一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法

摘要

本发明提供一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，步骤为：取蛹虫草菌皮为原料，用粉碎机粉碎，过筛，置于真空干燥箱中干燥，备用；在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入甲醇和水的混合液，浸泡；将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流，过滤，得到提取液；提取液用石油醚萃取，弃去石油醚层；下层剩余液通过减压浓缩回收溶剂，得到提取液的浸膏；用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，回收洗脱液，TLC跟踪检测；得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，用适量甲醇或乙醇加热使其溶解，低温结晶。本发明工艺简单可控，提取时间短，有机溶剂用量少并且可以回收利用，成本低，得到的虫草素纯度较高。

权利要求

1.一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，其特征在于，步骤如下：(1)以蛹虫草菌皮为原料，用粉碎机粉碎，过60目筛，置于40℃的真空干燥箱中干燥4h，取1kg，备用；

(2)在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入10倍量的70％甲醇溶液，浸泡12h；

(3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流3次，第一次回流3h，用纱布过滤后，将剩余残渣继续加热回流2次，每次1h，合并滤液，得到提取液；

(4)提取液用2倍量的石油醚萃取2次，弃去石油醚层；

(5)下层剩余液通过减压浓缩进行回收，得到蛹虫草菌皮提取液的浸膏；

(6)用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，体积比为10:1，回收洗脱液，TLC跟踪检测，直到洗脱液中无虫草素为止；

(7)得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，用甲醇加热使其溶解，4℃低温结晶，得虫草素。

说明书

一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种提取纯化虫草素的方法，属于药用真菌有效成分提取分离领域。

背景技术

[0002] 蛹虫草又名北冬虫夏草，蛹草菌，蛹草等，中医认为，虫草是唯一一种能平衡、调节阴阳的中药，其入肺肾二经，既能补肺阴又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等。虫草素是蛹虫草的主要活性成分之一，现代药理学研究表明，虫草素具有抑制微生物生长、抗肿瘤、调节免疫力、抑菌、抗炎、抗衰老、改善新陈代谢、清除自由基等多种药理作用，有良好的临床应用前景。目前，国外有报道虫草素能够人工合成，但目前处于探索阶段，合成的过程复杂且产量极低。由于天然虫草资源稀缺，价格昂贵，虫草素含量甚微，所以天然虫草很难成为提取虫草素的主要原料。

[0003] 现有从人工养殖蛹虫草子实体中获得虫草素的方法，但子实体的获得困难、耗时、成本高，并且除虫草素外的其他成分含量也很高，如虫草酸、虫草多糖和超氧化歧化酶等，如果仅提取虫草素，其他高含量的成分会导致提取过程复杂且困难，因而从经济的角度考虑，从子实体中仅提取虫草素价格昂贵，成本较高。蛹虫草菌皮是蛹虫草子实体的副产品，生产中常常当做废品处理，但蛹虫草菌皮也含有虫草素成分，并且其他成分的含量较低，其作为副产品来源丰富，价格低廉，利用其提取虫草素可以变废为宝，不仅大大的降低成本，同时也避免了资源的浪费。

[0004] 从蛹虫草菌皮中纯化虫草素的方法，现有的方法是利用大孔强酸离子交换树脂来对虫草素进行纯化，但大孔强酸离子交换树脂使用时需要用酸碱反复浸洗数次，步骤繁琐，复杂、溶剂用量大，残留多，且大量提取时成本也比较高。另有方法利用硅胶柱层析从蛹虫草子实体中分离纯化虫草素，但其溶剂一般为三相或四相，如乙酸乙酯、乙醇和水的组合或水、乙酸乙酯、异丙醇和氯仿的组合，由于溶剂种类多，进而导致实验过程复杂、难以控制，并且三相或四相溶剂因无法根据密度调节其体积比例，进而溶剂不能回收再利用，造成溶剂的大量浪费，大大增加了实验的成本。

发明内容

[0005] 本发明是针对现有技术的不足，提供一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，该方法原料来源丰富，廉价易得，并具有工艺简单、易操作，有机溶剂可循环利用且用量少、成本低、产品纯度高的优点。

[0006] 本发明采用的技术方案为：

[0007] 一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，

[0008] 步骤如下：

[0009] (1)取蛹虫草菌皮为原料，用粉碎机粉碎，过筛，置于真空干燥箱中干燥，备用；

[0010] (2)在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入甲醇和水的混合溶液，浸泡；

[0011] (3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流，过滤，得到提取液；

[0012] (4)提取液用石油醚萃取，弃去石油醚层；

[0013] (5)下层剩余液通过减压浓缩进行回收，得到蛹虫草菌皮提取液的浸膏；

[0014] (6)用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，回收洗脱液，TLC跟踪检测；

[0015] (7)得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，溶解，结晶，得虫草素。

[0016] 所述的一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，其特征在于，所述步骤(1)中蛹虫草菌皮粉末过20-80目筛，置于真空干燥箱中的温度为30-60℃，干燥时间为2-6h。

[0017] 所述的一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，其特征在于，步骤(2)中在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入8-14倍量的甲醇和水的混合溶液，浸泡8-20h。

[0018] 所述的一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，其特征在于，所述步骤(3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流3次，每次回流时间1-3h。

[0019] 所述的一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，其特征在于，所述步骤(4)中提取液用1-3倍量的石油醚萃取1-3次。

[0020] 所述的一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，其特征在于，所述步骤(6)中硅胶柱洗脱时的流动相为氯仿和甲醇，且比例为8:1-14:1。

[0021] 所述的一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，所述步骤(7)中得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，用适量甲醇或乙醇加热使其溶解，于4℃低温下结晶，得虫草素。

[0022] 本发明具有以下有益效果：

[0023] (1)原料蛹虫草菌皮来源丰富，价格低廉，可代替蛹虫草子实体，克服蛹虫草子实体获取困难，成本较高，所以不利于大量的生产的缺陷。

[0024] (2)采用甲醇和水热回流提取，设备简单，操作容易，节省时间，成本低廉。

[0025] (3)分离选择硅胶层析柱富集虫草素，操作简单，分离效果好，得到虫草素纯度高。

[0026] (4)洗脱溶剂为氯仿和甲醇，溶剂可以回收循环使用，避免了多种溶剂配比复杂而不能回收使用的情况，节省大量的溶剂。

附图说明

[0027] 图1所示的是虫草素标准品的紫外扫描图。

[0028] 图2所示的是虫草素标准品的高效液相色谱图。

[0029] 图3所示的是虫草素标准品色谱峰的纯度结果。

[0030] 图4所示的是本发明实施例1得到的虫草素的高效液相色谱图。

[0031] 图5所示的是本发明实施例1得到的虫草素色谱峰的纯度结果。

[0032] 图6所示的是本发明实施例1得到的虫草素红外谱图。

[0033] 图7所示的是对比例1的TLC图谱。

具体实施方式

[0034] 一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，步骤如下：

[0035] (1)取蛹虫草菌皮为原料，用粉碎机粉碎，蛹虫草菌皮粉末过20-80目筛，置于真空干燥箱中的温度为30-60℃，干燥时间为2-6h，备用；

[0036] (2)在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入8-14倍量的甲醇和水的混合溶液，浸泡8-20h；

[0037] (3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流3次，每次回流时间1-3h，过滤，得到提取液；

[0038] (4)提取液用1-3倍量的石油醚萃取1-3次，弃去石油醚层；

[0039] (5)下层剩余液通过减压浓缩进行回收，得到蛹虫草菌皮提取液的浸膏；

[0040] (6)用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，且比例为8:1-14:1，回收洗脱液，TLC跟踪检测；

[0041] (7)得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，用适量甲醇或乙醇加热使其溶解，于4℃低温下结晶，得虫草素。

[0042] 实施例1一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法

[0043] (一)、步骤如下：

[0044] (1)以蛹虫草菌皮为原料，用粉碎机粉碎，过60目筛，置于40℃的真空干燥箱中干燥4h，取1kg，备用；

[0045] (2)在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入10倍量的70％甲醇溶液，浸泡12h；

[0046] (3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流3次，第一次回流3h，用纱布过滤后，将剩余残渣再加入提取溶剂，继续加热回流2次，每次1h，合并滤液，得到提取液；

[0047] (4)提取液用2倍量的石油醚萃取2次，弃去石油醚层；

[0048] (5)下层剩余液通过减压浓缩进行回收，得到蛹虫草菌皮提取液的浸膏；

[0049] (6)用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，体积比为10:1，回收洗脱液，TLC跟踪检测，直到洗脱液中无虫草素为止；

[0050] (7)得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，用适量甲醇加热使其溶解，4℃低温结晶，得虫草素。

[0051] (二)、高效液相法检测虫草素纯度

[0052] (1)试剂和材料

[0053] 甲醇(色谱纯)，纯净水，虫草素标准品。

[0054] (2)色谱条件：Diamonsil反相C18柱(250×4.6mm，5μm)；Agilent1200高效液相；流动相：甲醇:水＝15:85(v/v)；流速为1ml/min；检测波长260nm；进样量10μL。

[0055] (3)最大吸收波长的测定

[0056] 称取60℃干燥至恒重的虫草素标准品适量，用甲醇溶解，稀释，配制成50.0μg·mL-1的溶液，按紫外分光光度法《( 中国药典》2010年版一部)在200-400nm波长范围内进行扫描。

[0057] 将虫草素标准品溶于水、甲醇和pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中，并进行紫外扫描。虫草素标准品紫外扫描结果见扫描图1，由紫外扫描结果可知虫草素在259nm波长处有最大吸收。

[0058] (4)虫草素标准品和实施例1中得到的虫草素样品的测定

[0059] 经测量实施例1的方法得到虫草素857mg。

[0060] 取少量虫草素标准品及实施例1的方法得到虫草素样品加入适量的甲醇超声使其溶解，使用孔径为0.22μm的微孔滤头进行过滤，待测。虫草素标准品高效液相色谱图如图2，色谱峰的纯度结果如图3，由图3可知虫草素标准品的纯度为97.44％。

[0061] 按实施例1方法得到的虫草素样品，高效液相色谱图如图4，色谱峰的纯度结果如图5，由图5可知，按实施例1的方法得到虫草素纯度为97.42％。说明采用实施例1的方法得到了高纯度的虫草素。

[0062] (5)自制样品的红外图谱

[0063] 取本实施案例得到的虫草素样品，测定红外图谱，结果见图6。红外图谱数据(cm-1)：3326.0、3141.8、2923.8、1672.2、1608.5、1575.7、1479.3、1340.4、1299.9、1209.2、1174.6、958.5、831.3、727.1，与虫草素标准谱图数据基本一致。进一步证明本发明实施例1的方法得到了虫草素。

[0064] 实施例2一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法

[0065] (一)、步骤如下：

[0066] (1)以蛹虫草菌皮为原料，用粉碎机粉碎，过60目筛，置于40℃的真空干燥箱中干燥4h，取1kg，备用；

[0067] (2)在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入10倍量的70％甲醇溶液，浸泡12h；

[0068] (3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流3次，第一次回流3h，用纱布过滤后，将剩余残渣再加入提取溶剂，继续加热回流2次，每次1h，合并滤液，得到提取液；

[0069] (4)提取液用2倍量的石油醚萃取2次，弃去石油醚层；

[0070] (5)下层剩余液通过减压浓缩进行回收，得到蛹虫草菌皮提取液的浸膏；

[0071] (6)用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，体积比为8:1，回收洗脱液，TLC跟踪检测，直到洗脱液中无虫草素为止；

[0072] (7)得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，用适量甲醇加热使其溶解，4℃低温结晶，得虫草素。经称量得到虫草素634mg。

[0073] (二)、高效液相法检测虫草素纯度同实施例1中的(二)

[0074] 经测定，实施例2的方法得到了虫草素，但较实施例1方法得到的虫草素质量较少。

[0075] 实施例3一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法

[0076] (一)、步骤如下：

[0077] (1)以蛹虫草菌皮为原料，用粉碎机粉碎，过60目筛，置于40℃的真空干燥箱中干燥4h，取1kg，备用；

[0078] (2)在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入10倍量的70％甲醇溶液，浸泡12h；

[0079] (3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流3次，第一次回流3h，用纱布过滤后，将剩余残渣再加入提取溶剂，继续加热回流2次，每次1h，合并滤液，得到提取液；

[0080] (4)提取液用2倍量的石油醚萃取2次，弃去石油醚层；

[0081] (5)下层剩余液通过减压浓缩进行回收，得到蛹虫草菌皮提取液的浸膏；

[0082] (6)用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，体积比为12:1，回收洗脱液，TLC跟踪检测，直到洗脱液中无虫草素为止；

[0083] (7)得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，用适量甲醇加热使其溶解，4℃低温结晶，得虫草素。经称量得到虫草素653mg。

[0084] (二)、高效液相法检测虫草素纯度同实施例1中的(二)

[0085] 经测定，实施例3的方法得到了虫草素，但较实施例1方法得到的虫草素质量较少。

[0086] 对比例1

[0087] (一)、步骤如下：

[0088] (1)同实施例1的步骤(1)；

[0089] (2)在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入13倍量的60％甲醇溶液，浸泡18h；

[0090] (3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流3次，第一次回流3h，用纱布过滤后，将剩余残渣再加入提取溶剂，继续加热回流2次，每次1h，合并滤液，得到提取液；

[0091] (4)提取液通过减压浓缩进行回收，得到蛹虫草菌皮提取液的浸膏；

[0092] (5)用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，体积比为10:1，回收洗脱液，TLC跟踪检测，直到洗脱液中无虫草素为止；

[0093] (6)得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，用适量甲醇加热使其溶解，4℃低温结晶，得虫草素。经称量得到虫草素426mg。说明采用对比例1的方法虽然得到了虫草素，但较实施例1方法得到的虫草素质量少很多，提取率不高。

[0094] 图7所示的是对比例1得到的样品TLC图谱。A图中，展开剂为氯仿和甲醇体积比为10:1，图中a为对比例1中蛹虫草提取液的样品点，b为蛹虫草提取液经石油醚萃取后的样品点，c为虫草素标准品样品点，d石油醚萃取层的样品点。从薄层色谱图A看出，没有经过石油醚萃取的蛹虫草提取液中，在虫草素的Rf值上方还有一些杂质成分，而石油醚萃取后的提取液在此展开剂比例下，其上方没有这些杂质，说明石油醚萃取确实起到了除杂的效果。

[0095] B图中，展开剂为石油醚和乙酸乙酯的体积比为5:1。图中a为对比例1中得到蛹虫草提取液的样品点，b为蛹虫草提取液经石油醚萃取后的样品点，c为石油醚萃取层的样品点。蛹虫草提取液和石油醚萃取层的样品点在更小的极性条件下，在相同的Rf值处均显示荧光斑点，而经石油醚萃取后的提取液中这些杂质，进一步说明本发明经石油醚萃取后提取液，其中脂溶性的小极性成分含量大大降低，这位后续的分离纯化得到高纯度的虫草素起到了重要的作用。

[0096] 对比例2

[0097] (一)、步骤如下：

[0098] (1)以蛹虫草菌皮为原料，用粉碎机粉碎，过60目筛，置于40℃的真空干燥箱中干燥4h，取1kg，备用；

[0099] (2)在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入10倍量的70％甲醇溶液，浸泡12h；

[0100] (3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流3次，第一次回流3h，用纱布过滤后，将剩余残渣再加入提取溶剂，继续加热回流2次，每次1h，合并滤液，得到提取液；

[0101] (4)提取液用2倍量的石油醚萃取2次，弃去石油醚层；

[0102] (5)下层剩余液通过减压浓缩进行回收，得到蛹虫草菌皮提取液的浸膏；

[0103] (6)用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，体积比为2:1，回收洗脱液，TLC跟踪检测，直到洗脱液中无虫草素为止；

[0104] (7)得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，用适量甲醇加热使其溶解，4℃低温结晶。

[0105] 按对比例2的方法没有得到达到一定纯度的虫草素样品，经硅胶层析柱洗脱后，虫草素随其他样品一同被洗脱下来，没有达到分离纯化的目的。

[0106] 对比例3

[0107] (一)、步骤如下：

[0108] (1)以蛹虫草菌皮为原料，用粉碎机粉碎，过60目筛，置于40℃的真空干燥箱中干燥4h，取1kg，备用；

[0109] (2)在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入10倍量的70％甲醇溶液，浸泡12h；

[0110] (3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流3次，第一次回流3h，用纱布过滤后，将剩余残渣再加入提取溶剂，继续加热回流2次，每次1h，合并滤液，得到提取液；

[0111] (4)提取液用2倍量的石油醚萃取2次，弃去石油醚层；

[0112] (5)下层剩余液通过减压浓缩进行回收，得到蛹虫草菌皮提取液的浸膏；

[0113] (6)用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，体积比为18:1，回收洗脱液，TLC跟踪检测，直到洗脱液中无虫草素为止；

[0114] (7)得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，用适量甲醇加热使其溶解，4℃低温结晶。

[0115] 按对比例3的方法没有得到达到一定纯度的虫草素样品，经硅胶层析柱洗脱后，洗脱时间很长，且虫草素随其他样品一同被洗脱下来，没有达到分离纯化的目的。