HHrpEcc蛋白及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了HHrpEcc蛋白及其编码基因和应用。本发明提供了一种蛋白质，命名为HHrpEcc蛋白，自上游至下游依次包括如下区段：HrpN1区段、HrpW区段、HrpEcc区段、1个以上拷贝的HrpN2区段和HrpzPSS区段；HrpN1区段由序列表的序列1自N末端第1‑29位氨基酸残基组成；HrpW区段由序列表的序列1自N末端第35‑83位氨基酸残基组成；HrpEcc区段由序列表的序列1自N末端第87‑202位氨基酸残基组成；HrpN2区段由序列表的序列1自N末端第207‑246位氨基酸残基组成；HrpzPSS区段由序列表的序列1自N末端第395‑437位氨基酸残基组成。本发明提供的蛋白质在低浓度(5μg/ml)下可以明显促进植物根系和叶片的生长，最终大大提高植物产量。

权利要求

1.一种蛋白质，如下(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)：(Ⅰ)序列表的序列1所示的蛋白质；

(Ⅱ)在序列表的序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

(Ⅲ)序列表的序列3所示的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下(1)或(2)：(1)序列表的序列2所示的DNA分子；

(2)序列表的序列4所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌；

所述重组载体为将pBAD-hisB载体中XhoⅠ和PstⅠ酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列2所示的双链DNA分子，得到的重组质粒；

所述重组菌为将所述重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到的含有所述重组质粒的重组大肠杆菌。

5.一种制备权利要求1所述蛋白质的方法，包括如下步骤：发酵权利要求4中所述的重组菌，得到所述蛋白质。

6.权利要求1所述蛋白质的应用，为如下(a)或(b)：(a)制备植物促生长剂；(b)促进植物生长；所述植物为油菜。

7.一种植物促生长剂，其活性成分为权利要求1所述蛋白质；所述植物为油菜。

8.权利要求2所述核酸分子、权利要求3所述核酸分子、权利要求4所述表达盒、权利要求4所述重组载体或权利要求4所述重组菌在制备植物促生长剂中的应用；所述植物为油菜。

说明书

HHrpEcc蛋白及其编码基因和应用

技术领域

[0001] 本发明属于农业生物技术领域，涉及HHrpEcc蛋白及其编码基因和应用，具体涉及HHrpEcc蛋白及其编码基因在促进植物生长中的应用。

背景技术

[0002] Harpin是一种富含甘氨酸的热稳定性蛋白质，是通过革兰氏阴性植物致病细菌中III型分泌系统分泌的。Harpin可以在非寄主植物和抗病植物上激发过敏性反应(hypersensitive response，HR)，在感病寄主上具有致病性(pathogenicity)。当在非寄主植物上使用Harpin时，可以提高植物的抗病抗虫性，同时它还可以促进植物的生长，从而提高作物的产量。Harpin主要通过受体及传导，激发宿主植物细胞内的信号物质，同时激发植物自身抗病、抗虫、抗不良环境的防卫系统和生长发育系统的表达和活力，促进生长发育，从而极大增强作物对病毒、细菌、真菌的防御能力。Harpin属于新型、安全、稳定和高效的生物农药和生长促进剂。

[0003] 如需要大量生产Harpin蛋白，在大肠杆菌中重组表达是非常有效的方法，但是这些蛋白有很多在大肠杆菌中是以包涵体的形式存在。如来源于Pectobacterium carotovorum的HrpEcc在大肠杆菌中表达主要以包涵体的形式存在，因此在大肠杆菌中可溶性大量表达Harpin将是非常有用的技术。

[0004] 目前Harpin蛋白的使用浓度为15-100μg/ml,只用在这种高浓度时才能有效的提高农作物的产量。但是当使用较高浓度时Harpin时，将会明显提高农作物的成本，因此限制其使用。因此需要开发出更高效的harpin蛋白，降低其使用成本，使其在农业生产中广泛应用。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是获得高生物活性Harpin蛋白，降低其在农业生产中使用成本。为解决上述技术问题，本发明提供了HHrpEcc蛋白及其编码基因和应用。

[0006] 本发明提供了一种蛋白质，命名为HHrpEcc蛋白，自上游至下游依次包括如下区段：HrpN1区段、HrpW区段、HrpEcc区段、1个以上拷贝的HrpN2区段和HrpzPSS区段；所述HrpN1区段由序列表的序列1自N末端第1-29位氨基酸残基组成；所述HrpW区段由序列表的序列1自N末端第35-83位氨基酸残基组成；所述HrpEcc区段由序列表的序列1自N末端第87-202位氨基酸残基组成；所述HrpN2区段由序列表的序列1自N末端第207-246位氨基酸残基组成；所述HrpzPSS区段由序列表的序列1自N末端第395-437位氨基酸残基组成。

[0007] 所述“1个以上拷贝的HrpN2区段”具体可为4个拷贝的HrpN2区段。

[0008] 所述HHrpEcc蛋白具体可为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)：

[0009] (Ⅰ)序列表的序列1所示的蛋白质；

[0010] (Ⅱ)在序列表的序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

[0011] (Ⅲ)序列表的序列3所示的蛋白质。

[0012] (Ⅳ)将(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有促进植物生长活性的蛋白质。

[0013] 所述标签具体可如表1所示。

[0014] 表1 标签的序列

[0015]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0016] 上述(Ⅳ)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

[0017] 所述HHrpEcc蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

[0018] 上述(Ⅳ)中的蛋白质的编码基因可通过将序列2或序列4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。

[0019] 编码所述HHrpEcc蛋白的核酸分子(HHrpEcc基因)也属于本发明的保护范围。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA。所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

[0020] 所述核酸分子具体可为如下(1)或(2)或(3)或(4)：

[0021] (1)序列表的序列2所示的DNA分子(cDNA或基因组DNA)；

[0022] (2)序列表的序列4所示的DNA分子(cDNA或基因组DNA)；

[0023] (3)与(1)或(2)限定的DNA分子具有75％以上同一性且编码所述HHrpEcc蛋白的DNA分子(cDNA或基因组DNA)；

[0024] (4)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA分子杂交且编码所述HHrpEcc蛋白的DNA分子(cDNA或基因组DNA)。

[0025] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明中的HHrpEcc基因进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明提供的HHrpEcc基因具有75％以上同一性的核苷酸，只要编码所述HHrpEcc且具促进植物生长活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

[0026] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的HHrpEcc基因具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

[0027] 上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

[0028] 上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

[0029] 含有所述HHrpEcc基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组载体具体如下：将pBAD-hisB载体中XhoⅠ和PstⅠ酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列2所示的双链DNA分子，得到重组质粒pBAD/HHrpEcc。所述重组菌具体如下：将重组质粒pBAD/HHrpEcc导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒pBAD/HHrpEcc的重组大肠杆菌。

[0030] 本发明还保护一种制备所述HHrpEcc蛋白的方法，包括如下步骤：发酵所述重组菌，得到所述HHrpEcc蛋白。制备所述HHrpEcc蛋白的方法具体包括如下步骤：在含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养所述重组菌，培养体系的OD600nm值为0.6-0.8时加入阿拉伯糖病使阿拉伯糖在体系中的浓度为0.2g/100mL，然后30℃、200rpm/min振荡培养14h。

[0031] 本发明还保护所述HHrpEcc蛋白或所述融合蛋白在制备植物促生长剂中的应用。所述植物可为十字花科植物，具体可为芸苔属植物，更具体可为油菜，例如上海青油菜。所述植物促生长剂的功能为促进植物生长。所述促进植物生长具体可体现为促进植物的根系和/或叶片生长。

[0032] 本发明还保护所述HHrpEcc蛋白或所述融合蛋白在促进植物生长中的应用。所述植物可为十字花科植物，具体可为芸苔属植物，更具体可为油菜，例如上海青油菜。所述促进植物生长具体可体现为促进植物的根系和/或叶片生长。

[0033] 本发明还保护一种植物促生长剂，其活性成分为所述HHrpEcc蛋白或所述融合蛋白。所述植物可为十字花科植物，具体可为芸苔属植物，更具体可为油菜，例如上海青油菜。所述植物促生长剂的功能为促进植物生长。所述促进植物生长具体可体现为促进植物的根系和/或叶片生长。

[0034] 本发明还保护所述HHrpEcc基因或含有所述HHrpEcc基因的表达盒或含有所述HHrpEcc基因的重组载体或含有所述HHrpEcc基因的转基因细胞系或含有所述HHrpEcc基因的重组菌在制备植物促生长剂中的应用。所述植物可为十字花科植物，具体可为芸苔属植物，更具体可为油菜，例如上海青油菜。所述植物促生长剂的功能为促进植物生长。所述促进植物生长具体可体现为促进植物的根系和/或叶片生长。

[0035] 本发明还保护所述HHrpEcc基因或含有所述HHrpEcc基因的表达盒或含有所述HHrpEcc基因的重组载体或含有所述HHrpEcc基因的转基因细胞系或含有所述HHrpEcc基因的重组菌在促进植物生长中的应用。所述植物可为十字花科植物，具体可为芸苔属植物，更具体可为油菜，例如上海青油菜。所述促进植物生长具体可体现为促进植物的根系和/或叶片生长。

[0036] 本发明还保护一种植物促生长剂，其活性成分为所述HHrpEcc基因或含有所述HHrpEcc基因的表达盒或含有所述HHrpEcc基因的重组载体或含有所述HHrpEcc基因的转基因细胞系或含有所述HHrpEcc基因的重组菌。所述植物可为十字花科植物，具体可为芸苔属植物，更具体可为油菜，例如上海青油菜。所述植物促生长剂的功能为促进植物生长。所述促进植物生长具体可体现为促进植物的根系和/或叶片生长。

[0037] 本发明提供的蛋白质，具有很好的热稳定性、蛋白酶敏感，在1μg/ml的浓度条件下可以明显的诱导烟草产生应激反应，在低浓度(5μg/ml)下可以明显促进植物根系和叶片的生长，最终大大提高植物产量。

附图说明

[0038] 图1为重组质粒pBAD/HHrpEcc的结构示意图。

[0039] 图2为实施例2中的SDS-PAGE电泳图。

[0040] 图3为实施例3中的SDS-PAGE电泳图。

[0041] 图4为实施例5中出芽后生长25天的植株照片。

具体实施方式

[0042] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0043] 大肠杆菌BL21(DE3)：Invitrogen公司，产品目录号为C6010-03。pBAD-hisB载体：Invitrogen公司，产品目录号为VT1275。如无特殊说明，实施例中的PBS缓冲液均为pH7.0、
50mM的PBS缓冲液。

[0044] 实施例1、构建重组质粒pBAD/HHrpEcc

[0045] 发明人设计了HHrpEcc蛋白(分子量大小为50kDa)，然后根据HHrpEcc蛋白、以大肠杆菌密码子偏好性设计了HHrpEcc基因。

[0046] HHrpEcc蛋白如序列表的序列1所示，由HrpN1区段、HrpW区段、HrpEcc区段、HrpN2区段和HrpzPSS区段组成。序列表的序列1中，自N末端第1-29位氨基酸残基组成HrpN1区段，第35-83位氨基酸残基组成HrpW区段，第87-202位氨基酸残基组成HrpEcc区段，第207-246位氨基酸残基组成HrpN2区段，第251-290位氨基酸残基组成HrpN2区段，第302-341位氨基酸残基组成HrpN2区段，第346-385位氨基酸残基组成HrpN2区段，第395-437位氨基酸残基组成HrpzPSS区段。

[0047] HHrpEcc基因如序列表的序列2所示。

[0048] 将pBAD-hisB载体中XhoⅠ和PstⅠ酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列2所示的双链DNA分子，得到重组质粒pBAD/HHrpEcc。重组质粒pBAD/HHrpEcc的结构示意图见图1。重组质粒pBAD/HHrpEcc中，插入的DNA分子与载体骨架上的部分核苷酸融合，形成序列表的序列4所示的融合基因，表达序列表的序列3所示的融合蛋白。

[0049] 实施例2、蛋白的表达和纯化

[0050] 1、将重组质粒pBAD/HHrpEcc导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒pBAD/HHrpEcc的重组大肠杆菌，将该重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pBAD/HHrpEcc。

[0051] 2、将BL21(DE3)/pBAD/HHrpEcc接种于LB液体培养基，37℃、200rpm/min振荡培养过夜。

[0052] 3、将步骤2得到的菌液以1:100的体积比转接至含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、200rpm/min振荡培养至OD600nm值为0.6-0.8，然后加入阿拉伯糖(使阿拉伯糖在体系中的浓度为0.2g/100mL；阿拉伯糖为诱导剂)，30℃、200rpm/min振荡培养14h，收集菌体。

[0053] 4、取步骤3得到的菌体，用PBS缓冲液重悬后进行超声破碎(超声破碎的参数：总超声时间10分钟，每工作5s停5s，功率200W)，然后12000rpm离心10min，分别收集上清液和沉淀。

[0054] 5、步骤3中，加入阿拉伯糖之前，取菌体，用PBS缓冲液重悬后按步骤4的参数进行超声破碎，得到细胞破碎液。

[0055] 6、分别将步骤4得到的上清液、步骤4得到的沉淀和步骤5得到的细胞破碎液进行SDS-PAGE，结果见图2。图2中：M:Marker；1:步骤5得到的细胞破碎液；2:骤4得到的上清液；3:步骤4得到的沉淀。由图2中可以看出，BL21(DE3)/pBAD/HHrpEcc经过阿拉伯糖诱导后，表达的harpin蛋白大部分是以可溶性蛋白(50KDa)存在，包涵体蛋白的含量很少。

[0056] 7、取步骤4得到的上清液，上样于HisTrap FF crude预装柱(GE公司产品，产品目录号为11-0004-58)，先用含有20mM咪唑的PBS缓冲液洗脱3个柱体积以去除非目标组分，然后用含500mM咪唑的PBS缓冲液洗脱3个柱体积并收集过柱后洗脱液，即为HHrpEcc蛋白溶液。利用改良型Bradford法蛋白质浓度测定试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司产品，产品目录号SK3041)检测HHrpEcc蛋白溶液中的蛋白浓度，为10mg/mL。

[0057] 8、用pBAD-hisB载体代替重组质粒pBAD/HHrpEcc进行上述步骤，得到HHrpEcc蛋白溶液的对照溶液。

[0058] 实施例3、热稳定性研究

[0059] 取实施例2的步骤4得到的上清液，分别置于不同温度(60℃、80℃、100℃)下80rpm/min振荡孵育0.5h，然后4℃、10000rpm离心10min，收集上清液。

[0060] 分别将实施例2的步骤4得到的上清液、实施例2的步骤4得到的沉淀、实施例2的步骤4得到的上清液60℃孵育后再离心得到的上清液、实施例2的步骤4得到的上清液80℃孵育后再离心得到的上清液和实施例2的步骤4得到的上清液100℃孵育后再离心得到的上清液进行SDS-PAGE，结果见图3。图3中：M:Marker；1：实施例2的步骤4得到的上清液；2:实施例2的步骤4得到的沉淀；3:实施例2的步骤4得到的上清液60℃孵育后再离心得到的上清液；
4：实施例2的步骤4得到的上清液80℃孵育后再离心得到的上清液；5：实施例2的步骤4得到的上清液100℃孵育后再离心得到的上清液。

[0061] 由图3中可以看出，HHrpEcc蛋白在经过100℃处理0.5h后大部分蛋白仍未失活。表明HHrpEcc蛋白的热稳定性很好。

[0062] 实施例4、过敏性反应分析

[0063] HarpinEcc：成都稷安公司。

[0064] 本实施例中所用的烟草植株为烟草SR1品种。

[0065] HHrp的生物活性分析：取实施例2的步骤7得到的HHrpEcc蛋白溶液，分别进行如下处理：

[0066] 将处于生长期的烟草植株分成七组，分别处理如下：

[0067] 第一组：用PBS缓冲液稀释HHrpEcc蛋白溶液，得到蛋白浓度为50μg/ml的溶液，然后用其注射烟草叶片(注射剂量为50μl)；

[0068] 第二组：用PBS缓冲液稀释HHrpEcc蛋白溶液，得到蛋白浓度为50μg/ml的溶液，然后将该溶液沸水浴10min，然后用其注射烟草叶片(注射剂量为50μl)；

[0069] 第三组：用PBS缓冲液稀释HHrpEcc蛋白溶液，得到蛋白浓度为50μg/ml的溶液，然后将该溶液用蛋白酶K处理(即在溶液中加入蛋白酶K并使其浓度为20μg/ml，37℃温育15min)，然后用其注射烟草叶片(注射剂量为50μl)；

[0070] 第四组：用PBS缓冲液稀释HHrpEcc蛋白溶液，得到蛋白浓度为1μg/ml的溶液，然后用其注射烟草叶片(注射剂量为50μl)；

[0071] 第五组：用PBS缓冲液稀释HarpinEcc，得到蛋白浓度为50μg/ml的溶液，然后用其注射烟草叶片(注射剂量为50μl)；

[0072] 第六组：用PBS缓冲液稀释HarpinEcc，得到蛋白浓度为1μg/ml的溶液，然后用其注射烟草叶片(注射剂量为50μl)；

[0073] 第七组：用水注射烟草叶片(注射剂量为50μl)。

[0074] 完成注射后，连续36小时观察接种区域的HR表型。

[0075] 结果表明：采用HHrpEcc蛋白处理1小时、2小时和4小时，接种区域都有明显的应激反应，出现了小面积的细胞死亡；采用蛋白酶K处理后的HHrpEcc蛋白，各个时间接种区域都没有HR反应，表明HHrpEcc蛋白失去了生物活性；HarpinEcc在50μg/ml的时候引起了接种区域的HR反应，在1μg/ml的时候没有引起接种区域的HR反应。这一结果表明，HHrpEcc蛋白有很好的热稳定性，对蛋白酶敏感，同时其生物活性要好于HarpinEcc(在1μg/ml时可引起明显的HR反应)。

[0076] 处理36小时后的具体结果见表2。

[0077] 表2

[0078]    使用浓度(μg/ml HR
第一组 HHrpEcc 50 有
第二组 HHrpEcc热处理 50 有
第三组 HHrpEcc蛋白酶K处理 50 无
第四组 HHrpEcc低浓度 1 有
第五组 HarpinEcc高浓度 50 有
第六组 HarpinEcc低浓度 1 无
第七组 清水对照 0 无

[0079] 实施例5、HHrpEcc蛋白促进油菜根系的生长

[0080] 本实施例中所用的油菜为上海青品种(济南新科种业开发有限公司，种子产品编号：1736943)。

[0081] 1、取实施例2的步骤7得到的HHrpEcc蛋白溶液，用水稀释，得到蛋白浓度为5μg/L的溶液。

[0082] 2、取实施例2的步骤8得到的对照溶液，用步骤1等体积的水稀释，得到溶液。

[0083] 3、取油菜种子，置于步骤1得到的溶液中充分拌匀，然后播种，作为试验组。取油菜种子，置于步骤2得到的溶液中充分拌匀，然后播种，作为阴性对照组。取油菜种子，置于清水中充分拌匀，然后播种，作为空白对照组。每组进行三个重复处理，每个重复处理中含有50粒种子。

[0084] 观察各组植株的生长状况(包括地上部分的生长情况和地下部分的生长情况)。

[0085] 出芽后生长25天的植株照片见图4。阴性对照组的植株表型与空白对照组的植株表型一致。HHrpEcc蛋白明显的促进了油菜根系的生长(须根增多)，HHrpEcc蛋白明显促进了叶片的生长(叶片数量较多且叶片较大)。结果表明，HHrpEcc蛋白可以明显的促进根系和叶片的生长。

[0086] 出芽后45天收获油菜并计算油菜产量(产量以全株重量计算)。与空白对照组相比，试验组油菜的产量提高了15％。阴性对照组的油菜产量与空白对照组的油菜产量没有显著差异。