用于检测维生素D的组合物和方法

摘要

化合物，包括维生素D(包括维生素D3和维生素D2)的氨基甲酸酯衍生物。该化合物可用于测定怀疑含有维生素D的样品中维生素D，包括维生素D类似物和其代谢物的存在和/或总量的方法和试剂盒。某些组合物包含信号产生体系、N‑羟基琥珀酰亚胺、小分子、小分子的结合配偶体或载体。

权利要求

1.下式的化合物：

其中：

Z为具有1至10个碳原子的烷基、烯基或炔基，所述碳原子可以是未取代的或其中一个或多个可以被一个或多个羟基、低级烷氧基、氧代和肟取代；

R为-O-琥珀酰亚胺基、-NH-O-(A)k-R2，其中R2为信号产生体系的成员、-(CH2)nCOOH、-(CH2)mCOONHS (NHS为N-羟基琥珀酰亚胺)、有机小分子、所述有机小分子的结合配偶体、或载体，所述有机小分子选自生物素、荧光素、罗丹明、化学发光分子和二硝基苯酚，所述有机小分子的结合配偶体选自抗生物素蛋白、荧光素的抗体、罗丹明的抗体、化学发光分子的抗体和二硝基苯酚的抗体；k为0或1；当k为0时，A为键，当k为1时，A为连接基团；n为1至5的整数，和m为1至5的整数；和R4为H、OH或低级烷氧基。

2.根据权利要求1的化合物，其中Z为具有4至10个碳原子的支链烷基或支链烯基，其中支链烷基或支链烯基的末端碳原子包含羟基。

3.根据权利要求1的化合物，其中R2为选自荧光化合物、化学发光化合物、增敏剂、酶和放射性标记物的信号产生体系的成员。

4.下式的化合物：

或下式的化合物：

其中：

R'为-O-琥珀酰亚胺基或-NH-O-(A)k-R2，其中R2为信号产生体系的成员、-(CH2)nCOOH、-(CH2)mCOONHS (NHS为N-羟基琥珀酰亚胺)、有机小分子、所述有机小分子的结合配偶体、或载体，所述有机小分子选自生物素、荧光素、罗丹明、化学发光分子和二硝基苯酚，所述有机小分子的结合配偶体选自抗生物素蛋白、荧光素的抗体、罗丹明的抗体、化学发光分子的抗体和二硝基苯酚的抗体；k为0或1；当k为0时，A为键，当k为1时，A为连接基团；n为1至5的整数，和m为1至5的整数；

R1为H、OH、或受保护的OH；和R4为H、OH或低级烷氧基。

2

5.根据权利要求4的化合物，其中R 为选自荧光化合物、化学发光化合物、增敏剂、酶和放射性标记物的信号产生体系的成员。

6.根据权利要求4的化合物，其中R2为包含颗粒的信号产生体系的成员。

7.根据权利要求6的化合物，其中所述颗粒选自荧光颗粒、化学发光颗粒、增敏剂颗粒和磁性颗粒。

8.一种测定样品中维生素D的存在和/或量的方法，所述方法包括：(a) 在培养基中以组合的形式提供：(i) 样品，

(ii) 根据权利要求5的化合物，和(iii) 维生素D的抗体；

(b) 对所述组合物施以使所述权利要求1的化合物与所述特异性结合成员结合形成复合物的条件，和(c) 测量所述复合物的量，所述复合物的量与样品中维生素D的存在和/或量有关。

9.下式的化合物：

或下式的化合物：

其中：

L选自磁性颗粒、吖啶酯、磁性颗粒与吖啶酯的组合、化学发光颗粒和增敏剂颗粒；和R1'为OH，和A'为键或连接基团。

10.根据权利要求9的化合物，其中L为化学发光颗粒。

11.根据权利要求9的化合物，其具有下式：

或下式：

其中：

p为1至5的整数，q为1至5的整数，和r为1至5的整数。

12.根据权利要求11的化合物，其中L为化学发光颗粒。

13.一种测定样品中维生素D的存在和/或量的方法，所述方法包括：(a) 在培养基中以组合的形式提供：(i) 样品，

(ii) 根据权利要求9的化合物，和(iii) 维生素D的抗体；

(b) 对所述组合物施以使所述权利要求1的化合物与特异性结合成员结合形成复合物的条件，和(c) 测量所述复合物的量，所述复合物的量与样品中维生素D的存在和/或量有关。

14.一种测定样品中维生素D的存在和/或量的方法，所述方法包括：(a) 在培养基中以组合的形式提供：(i) 样品，

(ii) 下式的化合物：

或下式的化合物：

其中：

R''为-NH-O-A''-R2'，其中R2'为信号产生体系的成员，和A''为键或连接基团，和R1''为H或OH；和(iii) 维生素D的抗体；

(b) 对所述组合物施以使所述的化合物与特异性结合成员结合形成复合物的条件，和(c) 测量所述复合物的量，所述复合物的量与样品中维生素D的存在和/或量有关。

15.根据权利要求14的方法，其中A''为-(CH2)p-C(O)-(W)b-(CH2)q-(X)c-(CH2)r-，其中W和X各自独立地为-NH-或-O-，b和c各自独立地为0或1，p为1至5的整数，q为1至5的整数，和r为1至5的整数。

16.根据权利要求14的方法，其中所述信号产生体系的成员选自增敏剂和化学发光化合物。

17.根据权利要求16的方法，其中所述信号产生体系的成员与颗粒缔合。

18.根据权利要求14的方法，其中所述信号产生体系的成员为光敏剂，并且所述组合物进一步包含化学发光反应物。

19.根据权利要求14的方法，其中所述信号产生体系的成员为化学发光化合物，并且所述组合物进一步包含光敏剂反应物。

说明书

用于检测维生素D的组合物和方法

背景技术

[0001] 本发明涉及用于在怀疑含有维生素D的样品中测定维生素D的存在和/或量的组合物、方法和试剂盒，所述维生素D包括维生素D类似物和其代谢物。

[0002] 术语“维生素D”表示一类脂溶性开环甾类化合物。在人体中，维生素D是独特的，因为其可以以胆钙化甾醇(维生素D3)或麦角钙化甾醇(维生素D2)的形式被摄取，以及因为人体也可以在日照充足时(由胆甾醇)合成维生素D。由于此后一性能，一些人认为维生素D是非必要膳食维生素，但大多数人认为其是必要营养素。维生素D在钙离子体内平衡的正调节方面具有重要的生理作用。维生素D3是由动物合成的维生素形式。维生素D2也是乳制品和某些食品中添加的常见补充剂。

[0003] 膳食和体内合成的维生素D3都必须经历代谢活化来产生生物活性代谢物。在人体中，维生素D3活化的初始步骤主要在肝脏中发生，涉及羟基化以形成中间代谢物25-羟基胆钙化甾醇(也被称为钙二醇、骨化二醇、25-羟胆钙化甾醇、或25-羟基维生素D3)。钙二醇是维生素D3在循环系统中的主要形式。维生素D2也经历相似的代谢活化为25-羟基维生素D2。这些化合物共同地被称作25-羟基维生素D (缩写为25(OH)D)，它们是在血清中测量来确定维生素D状态的主要代谢物。

[0004] 分析生物样品中的维生素D水平是重要的，因为维生素D缺乏与哺乳动物中的一些病症有关。需要用于精确和敏感地测定样品中维生素D、维生素D类似物和其代谢物的浓度的试剂和方法。

发明内容

[0005] 符合本文中所述原则的一些实施例涉及下式的化合物：

[0006]

[0007] 其中：

[0008] Z为具有1至10个碳原子的烷基、烯基或炔基，所述碳原子可以是未取代的或其中一个或多个可以被一个或多个羟基、低级烷氧基、氧代和肟取代；

[0009] R为-O-琥珀酰亚胺基、-NH-O-(A)k-R2，其中R2为信号产生体系的成员、-(CH2)nCOOH、-(CH2)mCOONHS (NHS为N-羟基琥珀酰亚胺)、小分子、小分子的结合配偶体、或载体；A为连接基团；k为0或1；n为1至5的整数，和m为1至5的整数；和

[0010] R4为H、OH或低级烷氧基。

[0011] 符合本文中所述原则的一些实施例涉及下式的化合物：

[0012]

[0013] 或下式的化合物：

[0014]

[0015] 其中：

[0016] R'为-O-琥珀酰亚胺基或-NH-O-(A)k-R2，其中R2为信号产生体系的成员、-(CH2)nCOOH、-(CH2)mCOONHS (NHS为N-羟基琥珀酰亚胺)、小分子、小分子的结合配偶体、或载体；当k为0时，A为直接键，当k为1时，A为连接基团；k为0或1；n为1至5的整数，m为1至5的整数；

[0017] R1为H，OH，或受保护的OH；和

[0018] R4为H，OH或低级烷氧基。

[0019] 符合本文中所述原则的一些实施例涉及下式的化合物：

[0020]

[0021] 或下式的化合物：

[0022]

[0023] 其中：

[0024] L选自磁性颗粒，吖啶酯，磁性颗粒和吖啶酯的组合，化学发光颗粒和增敏剂颗粒；和R1'为OH，和A'为键或连接基团。

[0025] 符合本文中所述原则的一些实施例涉及在怀疑含有维生素D的样品中测定维生素D的存在和/或量的方法。在该方法中，提供培养基中的组合物，其包含样品、如上所述的化合物和维生素D的特异性结合成员。在符合本文中所述原则的一些实施例中，作为样品的预处理或者在分析培养基中包括用于使维生素D从内源性结合物质中释放的释放剂。对该组合物施以使该化合物与特异性结合成员结合以形成复合物的条件。测量所述复合物的量，其中所述复合物的量与样品中维生素D的存在和/或量有关。

[0026] 符合本文中所述原则的一些实施例涉及在怀疑含有维生素D的样品中测定维生素D的存在和/或量的方法。提供一种组合物，其包含样品，维生素D的特异性结合成员和下式的化合物：

[0027]

[0028] 或下式的化合物：

[0029]

[0030] 其中：

[0031] R''为-NH-O-A''-R2'，其中R2'为信号产生体系的成员，和A''为键或连接基团，和[0032] R1''为H或OH。

[0033] 任选地，还包括释放剂。对该组合物施以使该化合物与特异性结合成员结合以形成复合物的条件，并测量该复合物的量。所述复合物的量与样品中维生素D的存在和/或量有关。

[0034] 附图简述

[0035] 图1为根据符合本文中所述原则的实施例合成化合物的示意图。

[0036] 图2为根据符合本文中所述原则的实施例合成化合物的示意图。

[0037] 具体实施方案的详细说明

[0038] 化合物

[0039] 如上所述，符合本文中所述原则的一些实施例涉及下式的化合物：

[0040]

[0041] 其中：

[0042] Z为具有例如1至10，或1至9，或1至8，或1至7，或1至6，或1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至10，或2至9，或2至8，或2至7，或2至6，或2至5，或2至4，或2至3，或3至10，或3至9，或3至8，或3至7，或3至6，或3至5，或3至4，或4至10，或4至9，或4至8，或4至7，或4至6，或4至5，或5至10，或5至9，或5至8，或5至7，或5至6，或6至10，或6至9，或6至8，或6至7，或7至10，或
7至9，或7至8，或8至10，或8至9，或9至10个碳原子的烷基、烯基或炔基，所述碳原子可以是未取代的，或其中一个或多个可以被一个或多个羟基、1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至
5，或2至4，或2至3，或3至5，或3至4，或4至5个碳原子的烷氧基、氧代、或肟取代；和[0043] R为-O-琥珀酰亚胺基或-NH-O-(A)k-R2，R2为信号产生体系的成员、-(CH2)nCOOH、-(CH2)mCOONHS (NHS为N-羟基琥珀酰亚胺)、小分子、小分子的结合配偶体、或载体；且当k为0时，A为键，当k为1时，A为连接基团；k为0或1；n为1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至5，或2至4，或2至3，或3至5，或3至4，或4至5的整数，m为1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至5，或2至4，或2至3，或3至5，或3至4，或4至5的整数；和

[0044] R4为H、OH或低级烷氧基。

[0045] 术语“烷基”包括直链、支链，或环状构造的具有指定碳原子数的那些烷基。“烷基”的实例包括但不限于例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲-丁基和叔-丁基、戊基、己基、庚基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、降冰片基。

[0046] 术语“烯基”包括直链-或支链-构造的具有指定碳原子数和至少一个碳-碳双键的烃链，所述碳-碳双键可以出现在沿着链的任何位点，其实例包括但不限于例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、二甲基戊烯基。

[0047] 术语“炔基”表示含有至少一个碳-碳三键的具有指定碳原子数的直链或支链烃，其包括但不限于例如乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、和2-丁炔基。

[0048] 术语“烷氧基”包括直链、支链或环状构造的具有指定碳原子数的烷基，其中该烷基包括醚氧来连接母体化合物。

[0049] 在符合本文中所述原则的一些实施例中，连接基团A具有例如低于约2000，或低于约1500，或低于约1000，或低于约500，或低于约300，或低于约200，或低于约150的分子量。该连接基团可以包含约2至约200个原子，或4至约150个原子，或约5至约100个原子，或约5至约50个原子，或约5至约25个原子，不计算氢，和可以包含例如2至约100个原子，或3至约
90个原子，或约4至约80个原子，或约5至约70个原子，或约10至约50个原子，或约10至约25个原子，或约5至约20个原子，或约5至约10个原子的链，各自独立地选自碳、氧、硫、氮和磷。
连接基团中的杂原子数取决于连接基团的尺寸，在一些实施例中，该数为例如0至约30，或1至约25，或约2至约20，或约2至约15，或约2至约10，或约3至约10，或约3至约5。

[0050] 所述杂原子可以为一个或多个官能团的形式，其包括但不限于例如一个或多个胺(伯胺、仲胺或叔胺)、氨基甲酸酯、醚、酯、酰胺、脲、磺酰胺、硫醚、腙、酰肼、脒和磷酸酯。在符合本文中所述原则的一个实施例中，所述连接基团包含仲胺官能团形式的两个氮原子和约6至约20，或约6至约15，或约6至约10，或约7至约20，或约7至约15，或约7至约10，或约7至约9，或约7至约8，或约7个原子的链中的一个羰基，原子数包括碳原子。

[0051] 在符合本文中所述原则的一些实施例中，连接基团为大分子，且可以为聚合物大分子。所述聚合物大分子长度通常为约1至约10,000个单体单元或更多，或约10至约10,000个单体单元，或约100至约10,000个单体单元，或约500至约10,000个单体单元，或约1,000至约10,000个单体单元，或约2,000至约10,000个单体单元，或约3,000至约10,000个单体单元，或约5,000至约10,000个单体单元，或约10至约8,000个单体单元，或约100至约8,000个单体单元，或约1,000至约8,000个单体单元，或约100至约7,000个单体单元等。单体单元的数量取决于单体单元链中的原子数，单体单元的组成等。

[0052] 聚合物大分子的分子量为至少约2,000。分子量可以为约2,000至约10,000,000或更多，或约2,000至约8,000,000，或约2,000至约6,000,000，或约2,000至约5,000,000，或约2,000至约4,000,000，或约2,000至约3,000,000，或约2,000至约2,000,000，或约2,000至约1,000,000，或约5,000至约10,000,000或更多，或约5,000至约8,000,000，或约5,000至约6,000,000，或约5,000至约5,000,000，或约5,000至约4,000,000，或约5,000至约3,000,000，或约5,000至约2,000,000，或约5,000至约1,000,000，或约10,000至约10,000,
000或更多，或约10,000至约8,000,000，或约10,000至约6,000,000，或约10,000至约5,
000,000，或约10,000至约4,000,000，或约10,000至约3,000,000，或约10,000至约2,000,
000，或约10,000至约1,000,000等。

[0053] 聚合物大分子可以为线性或支化或其组合。线性聚合物包含原子的直链，支化聚合物包含原子的支链。直链的各原子可以具有一个或多个代替氢的取代基。在一些实施方案中，聚合物可以为包含多于一类单体单元的共聚物。在一些实施方案中，聚合物大分子的一种或多种单体单元包含碳原子和一个或多个杂原子例如，举例来说氧、硫、氮、磷等。

[0054] 聚合物大分子可以为天然存在的材料或合成构建体。在一些实施方案中，聚合物大分子为多肽。通过说明并非限制，天然存在的多肽的实例包括蛋白质例如，举例来说白蛋白和球蛋白，其可以来自人类或其它动物源。白蛋白包括例如人血清白蛋白和牛血清白蛋白。球蛋白包括例如丙种球蛋白和免疫球蛋白。通过说明而非限制的方式，其它聚合物大分子的实例包括树枝状大分子、羧酸聚合物(例如，聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚半乳糖醛酸、聚甲基丙烯酸等)、胺聚合物(例如，聚乙烯胺、聚赖氨酸、聚谷氨酰胺、聚乙烯亚胺、聚烯丙胺等)，醚聚合物(聚乙二醇或聚环氧乙烷等)、硫醚聚合物(例如，聚乙烯硫醚等)、巯基聚合物(polymeric sulfhydryl)(例如聚半胱氨酸)等。

[0055] 如上所述，在符合本文中所述原则的一些实施例中，R2可以为信号产生体系的成员。信号产生体系可以具有一种或多种组分，至少一种组分为标记物。信号产生体系产生与样品中维生素D的存在有关的信号。信号产生体系包括产生可测量信号所需的所有试剂。信号产生体系的其它组分可以包括在显影液中，且可以包括但不限于例如基材、增强剂、活化剂、化学发光化合物、辅因子、抑制剂、清除剂、金属离子、和结合信号产生物质所需的特异性结合物质。信号产生体系的其它组分可以为例如辅酶，与酶产物反应的物质，其它酶和催化剂。信号产生体系提供可由外部手段，通过使用电磁辐射，理想地通过目测来检测的信号。示例性信号产生体系在美国专利号5,508,178中描述，将其相关公开内容引入本文作为参考。

[0056] 术语“标记物”包括聚(氨基酸)标记物和非聚(氨基酸)标记物。术语“聚(氨基酸)标记物部分”包括属于蛋白质的标记物，例如但不限于例如酶、抗体、肽、和免疫原。对于标记物蛋白质例如，举例来说酶，分子量范围将为约10,000至约600,000，或约10,000至约300,000分子量。每约200,000分子量的蛋白质，存在通常至少一种符合本文中所述原则的化合物(模拟基团(analog group))，或例如每约150,000分子量，或每约100,000分子量，或每约50,000分子量的蛋白质，存在至少约1种所述化合物。在酶的情况下，模拟基团的数量通常为1至约20，约2至约15，约3至约12，或约6至约10。

[0057] 通过说明而非限制的方式，酶包括氧化还原酶例如，举例来说脱氢酶，如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和乳酸脱氢酶；涉及产生过氧化氢和使用过氧化氢以使染料前体氧化为染料的酶例如，举例来说辣根过氧化物酶，乳过氧化物酶和微过氧化物酶；水解酶例如，举例来说碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶；荧光素酶例如，举例来说萤火虫荧光素酶，和细菌萤光素酶；转移酶；酶的组合，例如但不限于糖氧化酶，例如葡萄糖和半乳糖氧化酶，或杂环氧化酶(heterocyclic oxidase)，例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，与使用过氧化氢将染料前体氧化的酶，即过氧化物酶，例如辣根过氧化物酶，乳过氧化物酶或微过氧化物酶偶合。

[0058] 术语“非聚(氨基酸)标记物”包括非蛋白质的那些标记物。非聚(氨基酸)标记物能够被直接检测到，或可通过产生可检测信号的反应检测。非聚(氨基酸)标记物可以为同位素的或非同位素的，并且通过说明而非限制的方式，可以为例如放射性同位素、发光化合物(其包括但不限于例如吖啶酯，荧光化合物和化学发光化合物)、催化剂的多核苷酸编码、促进剂、染料、辅酶、酶底物、放射性基团、和可扩增的多核苷酸序列。在一些实施例中，所述非聚(氨基酸)标记物为例如放射性同位素的，发光的(例如，举例来说吖啶酯)，颗粒(例如，举例来说可以将结合物与未结合物分离的磁性颗粒，可以由浊度和散射比浊法测量的胶乳颗粒)，和化学发光珠粒(例如LOCI发光珠(chemibead))。

[0059] 如上所述，在符合本文中所述原则的一些实施例中，R2可以为分子量为约200至约2,000，或约200至约1,500，或约200至约1,000，或约200至约500的有机小分子。此类有机小分子包括但不限于例如生物素、荧光分子(例如，举例来说荧光素和罗丹明)、化学发光分子、和二硝基苯酚。有机小分子的结合配偶体为特异性识别和结合该小分子的分子。小分子的结合配偶体由该小分子的特性来确定，并且包括但不限于例如抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、该有机小分子的抗体(其包括但不限于例如荧光分子的抗体(例如，举例来说荧光素的抗体和罗丹明的抗体)、化学发光分子的抗体、和二硝基苯酚的抗体)。

[0060] 如上所述，在符合本文中所述原则的一些实施例中，R2可以为载体，其可以由有机或无机的、固体或液体的、水不溶性材料组成，并且其可以是透明的或部分透明的。载体可以具有若干形状的任一种，例如但不限于颗粒(颗粒状载体)包括珠粒、薄膜、膜、管、井(well)、条、棒、纤维、或平坦表面例如，举例来说板材或纸。载体可以或可以不在其中使用它的培养基中悬浮。可悬浮载体的实例为聚合物材料例如，举例来说胶乳、脂双层或脂质体、油滴、细胞和水凝胶、以及磁性颗粒。其它载体组合物包括聚合物，通过说明而非限制的方式例如，举例来说硝化纤维素、醋酸纤维素、聚(氯乙烯)、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、尼龙、聚(丁酸乙烯酯)(poly(vinyl butyrate))，其单独使用或和其它材料一起使用。所述载体可以用或可以不用例如染料，催化剂或其它可检测基团进一步标记。

[0061] 在符合本文中所述原则的一些实施例中，所述载体可以为颗粒。所述颗粒具有至少约0.02微米和不超过约100微米的平均直径。在一些实施例中，所述颗粒具有约0.05微米至约20微米，或约0.3微米至约10微米的平均直径。所述颗粒可以是有机或无机的，可溶胀或不可溶胀的，多孔或非多孔的，优选具有通常为约0.7 g/mL至约1.5 g/mL的接近于水的密度，并由可以是透明、部分透明或不透明的材料组成。所述颗粒可以为生物材料，例如细胞和微生物例如，举例来说红血球、白血球、淋巴细胞、杂交瘤、链球菌、金黄色葡萄球菌、和大肠杆菌、病毒。所述颗粒也可以为由有机和无机聚合物、脂质体、胶乳颗粒、磁性或非磁性颗粒、磷脂囊泡、乳糜微粒、脂蛋白等组成的颗粒。在一些实施例中，所述颗粒为二氧化铬(chrome)颗粒或胶乳颗粒。

[0062] 在符合本文中所述原则的一些实施例中，以上化学式中的Z为-(CH2)sC(CH3)2-R1，其中s为1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至5，或2至4，或2至3，或3至5，或3至4，或4至5，或1 1
3，或2，或1的整数，和R为H、OH、或受保护的OH。在一个具体实施例中，R为OH。

[0063] 在符合本文中所述原则的一个具体实施例中，s为3，且所述化合物具有以下化学式：

[0064]

[0065] 其中：

[0066] R'为-O-琥珀酰亚胺基或-NH-O-(A)k-R2，其中R2为信号产生体系的成员、-(CH2)nCOOH、-(CH2)mCOONHS (NHS为N-羟基琥珀酰亚胺)、小分子、或小分子的结合配偶体、载体，k为0或1，当k为0时，A为键，且当k为1时，A为连接基团，n为1至5的整数，和m为1至5的整数；

[0067] R1为H、OH、或受保护的OH。在一个具体实施例中，R1为OH；和

[0068] R4为H、OH或低级烷氧基。在一个具体实施例中，R4为H。在另一个具体实施例中，R4为OH。

[0069] 在符合本文中所述原则的一些实施例中，以上化学式中的Z为-(CH=CH)(CH2)vCH(CH3)(CH3)2-R1，其中v为0至5，或0至4，或0至3，或0至2，或0至1，或1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至5，或2至4，或2至3，或3至5，或3至4，或4至5，或3，或2，或1的整数，和R1为H、OH、或受保护的OH。在一个具体实施例中，R1为OH。在符合本文中所述原则的一个具体实施例中，v为0，且所述化合物具有以下化学式：

[0070]

[0071] 其中：

[0072] R'为-O-琥珀酰亚胺基或-NH-O-(A)k-R2，其中R2为信号产生体系的成员、-(CH2)nCOOH、-(CH2)mCOONHS (NHS为N-羟基琥珀酰亚胺)、小分子、或小分子的结合配偶体、载体，k为0或1，当k为0时，A为键，且当k为1时，A为连接基团，n为1至5的整数，和m为1至5的整数；

[0073] R1为H、OH、或受保护的OH。在一个具体实施例中，R1为OH；和

[0074] R4为H、OH或低级烷氧基。在一个具体实施例中，R4为H。在另一个具体实施例中，R4为OH。

[0075] 符合本文中所述原则的一些实施例涉及25-OH维生素D2的衍生物和25-OH维生素D3的衍生物，其包含直接或通过连接基团的中间性与另一部分连接的氨基甲酸酯。该部分可以为但不限于信号产生体系的成员、载体或特异性结合对的成员。

[0076] 在符合本文中所述原则的一些实施例中，所述化合物具有以下化学式：

[0077]

[0078] 其中：

[0079] L选自磁性颗粒、吖啶酯、磁性颗粒与吖啶酯的组合(例如，举例来说顺磁性颗粒标记的吖啶酯)、化学发光颗粒和增敏剂颗粒；和R1'为OH，且A'为如上所述的键或连接基团。在一些实施例中，所述连接基团具有化学式-(CH2)p-C(O)-(W)b-(CH2)q-(X)c-(CH2)r-，其中W和X各自独立地为-NH-和-O-，b和c各自独立地为0或1，p为1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至5，或2至4，或2至3，或3至5，或3至4，或4至5的整数，q为1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至5，或2至4，或2至3，或3至5，或3至4，或4至5的整数，和r为1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至5，或2至4，或2至3，或3至5，或3至4，或4至5的整数。在一个实施例中，b和c各自为1，p为1，q为2和r为1。在一些实施例中，连接基团具有化学式-(CH2)p-C(O)-NH-(CH2)q-NH-(CH2)r-，其中p、q和r如上文所定义。

[0080] 在符合本文中所述原则的一些实施例中，所述化合物具有以下化学式：

[0081]

[0082] 其中：

[0083] L选自磁性颗粒、吖啶酯、磁性颗粒与吖啶酯的组合(例如，举例来说顺磁性颗粒标记的吖啶酯)、化学发光颗粒和增敏剂颗粒；和R1'为OH，和A'为如上所述的键或连接基团。在一些实施例中，所述连接基团具有化学式-(CH2)p-C(O)-(W)b-(CH2)q-(X)c-(CH2)r-，其中W和X各自独立地为-NH-和-O-，b和c各自独立地为0或1，p为1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至5，或2至4，或2至3，或3至5，或3至4，或4至5的整数，q为1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至5，或2至4，或2至3，或3至5，或3至4，或4至5的整数，和r为1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至5，或2至4，或2至3，或3至5，或3至4，或4至5的整数。在一个实施例中，b和c各自为1，p为1，q为2和r为1。在一些实施例中，所述连接基团具有化学式-(CH2)p-C(O)-NH-(CH2)q-NH-(CH2)r-，其中p、q和r如上文所定义。

[0084] 磁性颗粒包括顺磁性颗粒、铁磁性颗粒和抗磁性颗粒。此类颗粒包括但不限于例如，举例来说元素周期表第4-7周期的过渡金属，包括铬、铜、钴、铝、锰、铁和镍。

[0085] 化学发光颗粒为已经与化学发光化合物缔合的颗粒。如本文所使用的，短语“与……缔合”表示化合物例如，举例来说化学发光化合物和颗粒可以通过例如直接或间接键合、吸附，吸收、并入、或溶解来缔合。可以使用的化学发光化合物的实例为美国专利号5,340,716和6,251,581中阐述的那些，将其相关的公开内容通过引用并入本文。在符合本文中所述原则的一些实施例中，化学发光化合物为可光活化物质，其直接或由光敏化激发时，或与单线态氧反应时，经过化学反应形成能够在分解的同时或后续发射波长范围通常为
250至1200 nm的光的亚稳态反应产物。术语“可光活化”包括“可光化学活化”。在一些实施例中，化学发光化合物为与单线态氧反应形成二氧杂环丁烷(dioxetane)或二氧杂环丁酮(dioxetanone)的那些。后者通常为富电子烯烃。此类富电子烯烃的示例为烯醇醚类、烯胺类、9-亚烷基-N-烷基-9,10-二氢化吖啶(alkylacridan)类、芳基乙烯基醚类、二噁烯类、芳基咪唑类、9-亚烷基-苍耳烷类和光泽精。其它化合物包括鲁米诺(luminol)和其它邻苯二甲酰肼类，以及受到保护免于经历化学发光反应的化学发光化合物，其借助于通过光化学不稳定保护基团来保护，此类化合物包括例如萤火虫萤光素、水通道蛋白(aquaphorin)、和鲁米诺。可以使用的此类化学发光化合物的实例为美国专利号5,709,994中阐述的那些，将其相关的公开内容通过引用并入本文。

[0086] 增敏剂颗粒为已经与增敏剂化合物缔合的颗粒，所述增敏剂化合物包括但不限于光敏剂化合物。可以使用的增敏剂化合物的实例为美国专利号5,340,716和6,251,581中阐述的那些，将其相关公开内容通过引用并入本文。

[0087] 光敏剂为通常通过用光激发产生单线态氧的增敏剂。在一些实施例中，所述光敏剂吸收相比于化学发光化合物较长的波长，并具有相比于化学发光化合物较低的能量三重态。所述光敏剂可以为可光活化的(例如染料和芳香族化合物)。所述光敏剂通常为由共价键合的原子组成的化合物，通常具有多个共轭的双键或三键。该化合物应吸收波长范围为200-1100 nm，通常300-1000 nm，优选450-950 nm内的光。典型的光敏剂包括但不限于例如丙酮、二苯甲酮、9-噻吨酮、曙红(eosin)、9,10-二溴蒽、亚甲基蓝、金属-卟啉类(例如血卟啉)、酞菁、叶绿素、玫瑰红(rose bengal)、勃克明斯特富勒烯(buckminsterfullerene)，和这些化合物的衍生物。其它光敏剂的实例列举在N.J.  Turro，“Molecular 
Photochemistry”，第132页，W. A. Benjamin Inc.，N.Y. 1965中。所述光敏剂有助于其中通过单线态氧活化的光活化。通常，所述光敏剂吸收光，并且由此形成的激发光敏剂使氧活化产生与化学发光化合物反应产生亚稳态发光中间体的单线态氧。

[0088] 在符合本文中所述原则的一些实施例中，所述化合物具有以下化学式：

[0089]

[0090] 其中L、p、q和r如上所定义。

[0091] 在符合本文中所述原则的一些实施例中，所述化合物具有以下化学式：

[0092]

[0093] 其中L、p、q和r如上所定义。

[0094] 化合物的制备

[0095] 参考图1和2，以说明而非限制的方式描述制备符合本文中所述原则的化合物的方法的实例。可以使用其它方法形成符合本文中所述原则的化合物。参见图1，处理25-OH VD3(I)形成琥珀酰亚胺基碳酸酯衍生物II。例如，I可以在碱存在下在无水极性有机溶剂中与二琥珀酰亚胺基碳酸酯混合。该碱可以为例如三乙胺或二异丙基乙胺。该无水极性有机溶剂可以为例如乙腈、二氯甲烷、四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)。反应期间的温度为约18℃至约25℃，或约室温。反应期间通过例如搅拌或摇振，对反应物施以搅动。反应的时间周期为约2小时至约24小时，或约15至约21小时，或约18小时。

[0096] 可以由琥珀酰亚胺基碳酸酯衍生物II，通过例如在碱存在下，使II与羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)的悬浮液在无水极性有机溶剂中混合来制备氨基甲酸酯III (25-OH维生素D3 3-氨基甲酸酯，p = 1)。该碱可以为例如三乙胺或二异丙基乙胺。该无水极性有机溶剂可以为例如DMF或DMSO。含有上述反应物的反应容器在反应期间保持在加热浴温度为约18℃至约25℃，或约22℃的加热浴中。反应期间通过例如搅拌或摇振，对反应物施以搅动。反应的时间周期为约15至约21小时，或约18小时。通过蒸发去除有机溶剂，其可以通过对反应容器内容物施以真空来加速。残余物可以与极性有机溶剂(例如乙酸乙酯或二氯甲烷)混合，然后用无机盐水溶液(例如盐水或碳酸氢钠溶液)洗涤。有机相可以通过例如与无水无机盐(例如硫酸钠或硫酸镁)混合来进行干燥。干燥之后，可以通过使有机相经历例如过滤或倾滤来处理有机相，以分离任何固体材料。通过蒸发去除有机溶剂，其可以通过对反应容器内容物施以真空来加速。所得干燥产物可以由色谱法，例如高效液相色谱法(HPLC)，逆相液相色谱(RPLC)，高湍流液相色谱(HTLC)，或气相色谱法来纯化。产物可以保存在无水极性有机溶剂(例如，举例来说DMSO或DMF)中。

[0097] 氨基甲酸酯III可以被活化，用于与例如颗粒的固体载体的连接基团偶合。在符合本文中所述原则的一个实施例中，通过形成磺基-NHS酯IV来使氨基甲酸酯III活化。通过使氨基甲酸酯III与活化剂(例如磺基-NHS)，在约15℃至约40℃，或约20℃至约30℃，或环境温度下，在例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)存在下在无水极性有机介质(例如DMSO)中混合约10小时至约25小时，或约12小时至约20小时，或约18小时来进行该反应。通过例如旋转或搅拌对介质施以搅动。

[0098] 参见图2，通过类似于美国专利号7,179,660中描述的程序制备颗粒，例如胶乳颗粒(在该实施例中指定为EPRM)，其中已经引入化学发光化合物(染料)并且具有内部氨基葡聚糖层和外部葡聚糖醛层，将其相关公开内容通过引用并入本文。外部葡聚糖醛层上的醛基在还原胺化条件下与乙二胺反应形成反应物V (EPRM-EDA)，其为具有包含亚乙基链和末端胺基的侧链部分的颗粒反应物。还原胺化条件包括使用还原剂例如，举例来说金属氢化物(例如硼氢化钠或硼氢化钾)、氰基硼氢化钠、或三乙酰氧基硼氢化钠。反应期间，该反应在约20℃至约100℃，或约30℃至约50℃的温度下在水性介质中进行约1小时至约48小时，或约5小时至约24小时。侧链部分与外部葡聚糖醛层的连接点包含仲胺连接键。

[0099] 磺基-NHS酯IV (在无水极性有机溶剂(例如，举例来说DMSO或DMF)中)与颗粒反应物V (在具有表面活性剂(例如，举例来说GAFAC®或TWEEN® 20)的无水极性有机溶剂(例如，举例来说DMSO或DMF)中)结合。通过例如搅拌或摇振对反应混合物施以搅动。反应期间的温度为约18℃至约25℃，或约室温。反应期间通过例如搅拌或摇振，对反应物施以搅动。反应的时间周期为例如约2小时至约24小时，或约15至约21小时。所得颗粒(VI)可以经历一个或多个洗涤和纯化技术例如，举例来说透滤法和超声处理。

[0100] 符合本文中所述原则的维生素D2衍生物可以以类似于上述制备符合本文中所述原则的维生素D3衍生物的方式制备。

[0101] 利用本发明化合物分析维生素D的概述

[0102] 符合本文中所述原则的一些实施例涉及在怀疑含有维生素D的样品中测定维生素D的存在和/或量的方法，并且本文中可以称为“维生素D的分析”。在该分析中，提供培养基中的组合，其包含样品、如上所述包含信号产生体系的成员的化合物以及维生素D的特异性结合成员。就分析而言，如本文中所用的术语“维生素D”表示以下的一种或多种：25-羟基胆钙化甾醇(也被称为钙二醇、骨化二醇、25-羟胆钙化甾醇、或25-羟基维生素D (简写为25(OH)D)；钙二醇；1,25-二羟基维生素D3 (钙三醇；1,25 (OH)2D3)；1,25-二羟基维生素D4；1,25-二羟基维生素D5；和1,25-二羟基维生素D6；包括上述所有的代谢物。

[0103] 符合本文中所述原则的一个具体实施例涉及在怀疑含有维生素D的样品中测定维生素D的存在和/或量的方法。提供一种组合物，其包含样品、维生素D的特异性结合成员和下式的化合物：

[0104]

[0105] 或下式的化合物：

[0106]

[0107] 其中：R''为-NH-O-A''-R2'，其中R2'为如以上定义的信号产生体系的成员，A''为如以上定义的键或连接基团，和R1''为H或OH。对该组合物施以使该化合物与特异性结合成员结合形成复合物的条件，以及测量该复合物的量。复合物的量与样品中维生素D的存在和/或量有关。

[0108] 特异性结合成员为特异性结合对的成员，其为两种不同的分子之一，在表面上或空腔中具有一定区域，特异性地与另一个分子的特定空间的和极性的组构结合并由此定义为与之互补。特异性结合对的成员通常为免疫对(例如抗原-抗体)的成员，虽然其它特异性结合对，例如生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、酶-底物、核酸双螺旋、IgG-蛋白A、多核苷酸对(例如DNA-DNA、DNA-RNA)不为免疫对，但是也包括在术语“sbp成员”的范围内。

[0109] 特异性结合涉及与基本较不识别其它分子相比，相对于另一个，特异性识别两种不同分子之一。另一方面，非特异性结合涉及分子之间的非共价结合，其相对来说与特异性表面结构无关。非特异性结合可以由若干因素产生，包括分子之间的疏水相互作用。优选的结合配偶体为抗体。

[0110] 在符合本文中所述原则的分析的一些实施例中，维生素D的特异性结合成员为维生素D的抗体，其可以为完整免疫球蛋白分子或其片段。抗体包括各种分类和同型例如，举例来说IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、以及IgM。其片段可以包括Fab、Fv和F(ab')2，Fab'等。另外，适当时，可以使用免疫球蛋白或它们的片段的聚集物、聚合物和共轭物，只要保持对于维生素D的结合亲合性。维生素D的抗体可以由以下技术制备，包括但不限于例如宿主的免疫和血清的收集(多克隆)，制备连续杂交细胞系和收集分泌的蛋白(单克隆)，或克隆和表达核苷酸序列，或其诱变处理的变体至少编码特异性结合天然抗体所需的氨基酸序列。

[0111] 待分析的样品为怀疑含有维生素D的样品。该样品可以为生物样品或非生物样品。生物样品可以来自哺乳动物受试者或非哺乳动物受试者。哺乳动物受试者可以为例如人类或其它动物物种。生物样品包括生物体液，例如全血、血清、血浆(plasma)、痰、淋巴液、精液、阴道粘液、排泄物、尿、脊髓液、唾液、粪便、脑脊液、泪液、粘液等；生物组织，例如头发、皮肤、来自器官或其它躯体部分的切片或切除组织；等等。在许多情况下，样品为全血，血浆或血清。非生物样品包括但不限于例如废料流，其也可以使用符合本文中所述原则的化合物分析。

[0112] 样品可以在任何适宜的培养基中制备，所述培养基可以为例如分析培养基，其在下文中更充分地讨论。在有些情况下，可以对样品施加预处理，例如溶解血细胞。在一些实施例中，这种预处理在培养基中进行，并不干扰随后的分析。

[0113] 对培养基中的组合物施以使该化合物与维生素D的特异性结合成员结合形成复合物的条件。测量复合物的量，其中复合物的量与样品中维生素D的存在和/或量有关。

[0114] 维生素D的分析可以在不分离(均质)或分离(非均质)任何分析组分或产物的基础上进行。非均质分析通常涉及一个或多个分离步骤，可以是竞争性或非竞争性的。免疫分析可以涉及标记或未标记反应物。涉及未标记反应物的免疫分析通常包括形成较大复合物，所述较大复合物涉及由符合本文中所述原则的免疫原共轭物制备的一种或多种抗体。对于抗体复合物的检测，此类分析包括例如免疫沉淀素和凝集法，以及相应的光散射技术例如，举例来说散射比浊法和比浊法。标记免疫分析包括但不限于例如化学发光免疫分析、酶免疫分析、荧光偏振免疫分析、放射免疫分析、抑制分析、诱导发光分析、以及荧光氧通道分析。

[0115] 一种常用的免疫分析组包括使用有限浓度的符合本文中所述原则的化合物的免疫分析。另一组免疫分析涉及使用过量的一种或多种主要反应物，例如过量的符合本文中所述原则的化合物。另一组免疫分析包括无分离均质分析，其中当符合本文中所述原则的化合物结合至维生素D的特异性结合成员时，符合本文中所述原则的标记反应物调节标记物信号，由此与样品中可能存在的维生素D竞争。

[0116] 如上所述，分析可以在不分离(均质)或分离(非均质)任何分析组分或产物的基础上进行。均质免疫分析由以下示例：公开在Rubenstein等人的美国专利号3,817,837，第3栏，第6行至第6栏，第64行中的EMIT®分析(Siemens Healthcare Diagnostics Inc.，Deerfield，IL)；免疫荧光法，例如Ullman等人的美国专利号3,996,345，第17栏，第59行至第23栏，第25行中公开的那些；酶通道免疫分析(“ECIA”)，例如Maggio等人的美国专利号4,233,402，第6栏，第25行至第9栏，第63行中公开的那些；荧光偏振免疫分析(“FPIA”)，如例如尤其是美国专利号5,354,693中公开的那些；和酶免疫分析，例如酶联免疫吸附分析(“ELISA”)。非均质分析的示例为放射免疫分析，其公开在Yalow等人，J. Clin. Invest. 
39:1157 (1960)中。将上述公开内容的相关部分全部通过引用并入本文。

[0117] 其它酶免疫分析为例如酶调节介导免疫分析(“EMMIA”)，由Ngo和Lenhoff，FEBS Lett. (1980) 116:285-288所讨论的那样；底物标记荧光免疫分析(“SLFIA”)，由Oellerich，J. Clin. Chem. Clin. Biochem. (1984) 22:895-904所公开的那样；联合酶给体免疫分析(combined enzyme donor immunoassay，“CEDIA”)，由Khanna等人，Clin. Chem. Acta (1989) 185:231-240所公开的那样；均质颗粒标记免疫分析，例如颗粒增强的比浊抑制免疫分析(“PETINIA”)，颗粒增强的比浊免疫分析(“PETIA”)；亲合性二氧化铬介导免疫分析(“ACMIA”)分析形式，其在例如美国专利号7,186,518、5,147,529、5,128,103、5,158,871、4,661,408、5,151,348、5,302,532、5,422,284、5,447,870和5,434,051中描述，将其公开内容通过引用以其整体并入本文。

[0118] 其它分析包括吖啶酯标记物分析，例如美国专利号6,355,803；6,673,560；7,097,995和7,319,041中讨论的那些，将其相关公开内容通过引用并入本文。吖啶酯标记物分析的一个具体实例为使用顺磁性颗粒作为固相的吖啶酯标记物免疫分析(“ADVIA”免疫分析)。其它分析包括溶胶颗粒免疫分析(“SPIA”)，分散染料免疫分析(“DIA”)；金属免疫分析(“MIA”)；酶膜免疫分析(“EMIA”)；和发光免疫分析(luminoimmunoassay)(“LIA”)。其它分析类型包括免疫传感器分析，涉及在结合维生素D分析物时，监测现有共轭物的光学，声学和电学性能的变化。这种分析包括例如光学免疫传感器分析、声学免疫传感器分析、半导体免疫传感器分析、电化学换能器免疫传感器分析、电位型免疫传感器分析、电流型电极分析。

[0119] 非均质分析通常涉及一个或多个分离步骤，并且可以是竞争性或非竞争性的。各种竞争性和非竞争性非均质分析形式在Davalian等人的美国专利号5,089,390，第14栏，第25行至第15栏，第9行中公开，通过引用并入本文。在竞争性非均质分析的一个实例中，具有与之结合的维生素D抗体的载体与培养基接触，所述培养基含有怀疑含有维生素D的样品和符合本文中所述原则的标记化合物。为与维生素D抗体结合，样品中的维生素D与带有可检测的标记物的符合本文中所述原则的化合物竞争。将载体和培养基分离之后，由常规技术测定载体或培养基的标记物活性，其与样品中的维生素D分析物的量有关。在上述竞争性非均质分析的一个变型中，所述载体包含符合本文中所述原则的标记化合物作为标记反应物，并且维生素D抗体包含标记物。

[0120] 在一些实施例中，待分析的样品在分析培养基中与维生素D抗体和符合本文中所述原则的标记化合物混合。检测培养基中包含标记化合物和维生素D抗体的复合物的存在和/或量，其中所述复合物的存在和/或量指示样品中维生素D的存在和/或量。

[0121] 在符合本文中所述原则的一些实施例中，待分析的样品经历预处理，以从内源性结合物质例如，举例来说结合维生素D的血浆或血清蛋白中释放维生素D。可以例如通过添加消化剂或释放剂或按顺序使用的消化剂和释放剂的组合，从内源性结合物质中释放维生素D。所述消化剂为分解内源性结合物质，使得它们不再能结合维生素D的试剂。此类试剂包括但不限于蛋白酶K，以及蛋白酶K和蛋白变性剂例如，举例来说洗涤剂(例如十二烷基硫酸钠)。通过说明而非限制的方式，用于从内源性结合物质中释放维生素D的释放剂包括酸性变性剂例如，举例来说水杨酸、杀鼠灵、磺酸、甲苯磺酸、萘磺酸、苯胺萘磺酸(ANS)(包括例如1-苯胺基萘-8-磺酸(1,8-ANS)和8-苯胺基萘-1-磺酸(8-ANS))、水杨酸和上述的衍生物。

[0122] 进行消化或释放作用的条件例如，举例来说持续时间、温度、pH和培养基中释放剂的浓度取决于例如内源性结合物质的特性，样品的特性，以及释放剂的特性。通常，条件足以获得所需的效果或功能。在符合本文中所述原则的一些实施例中，释放剂的有效浓度为约0.01至约20 mg/mL，或约0.01至约10 mg/mL，或约0.01至约5 mg/mL，或约0.1至约20 mg/mL，或约0.1至约10 mg/mL，或约0.1至约5 mg/mL，或约0.1至约1 mg/mL。从内源性结合物质中释放维生素D的样品的预处理可以在进行分析之前作为单独的步骤，或在分析中作为第一个步骤进行。在这两者任一种的情况下，可能需要一种或多种反应物来停止消化剂和/或释放剂的作用。

[0123] 进行分析的条件包括在通常提供最佳分析灵敏度的适度pH下在水性缓冲培养基中进行分析。水性培养基可以仅为水，或可以包含0.1至约40体积%的助溶剂。培养基的pH将为例如约4至约11，或约5至约10，或约6.5至约9.5。pH将通常为任何特异性结合对的结合成员的最佳结合，该分析的其它反应物，例如信号产生体系成员等的pH最佳值之间的折中。各种缓冲剂可用来获得所需pH和在分析期间保持pH。通过说明而非限制的方式，说明性的缓冲剂包括例如硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐、TRIS、巴比妥、PIPES、HEPES、MES、ACES、MOPS和BICINE。所使用的具体缓冲剂并非关键，但是在单独的分析中，可以优选一种或另一种缓冲剂。

[0124] 分析方法中可以使用各种辅助材料。例如，除缓冲剂之外，培养基可以包含所使用的培养基以及反应物的稳定剂。在一些实施方案中，除这些添加剂之外，可以包含蛋白质例如，举例来说白蛋白；有机溶剂例如，举例来说甲酰胺；季铵盐；聚阴离子例如，举例来说硫酸葡聚糖；结合增强剂，例如聚亚烷基二醇；多糖例如，举例来说葡聚糖或海藻糖。培养基也可以包含防止形成血块的试剂。此类试剂是本领域中公知的，且包括但不限于例如EDTA、EGTA、柠檬酸盐、肝磷脂。培养基也可以包含一种或多种防腐剂，例如但不限于例如叠氮化钠、硫酸新霉素、PROCLIN® 300、链霉素。培养基可以另外包含一种或多种表面活性剂。如果使用，任何上述材料以足以获得所需效果或功能的浓度或量存在。

[0125] 可以以一个或多个时间间隔向培养基施加一个或多个培养周期，所述时间间隔包括添加分析中使用的各种反应物，包括上述那些反应物之间的任何时间间隔。培养基通常在足以发生各种反应物组分的结合以及样品中的维生素D的结合的温度和时间下培养。适度的温度通常用于实施该方法，测量周期期间通常为恒温，优选为室温。在一些实施例中，培养温度为例如约5℃至约99℃，或约15℃至约70℃，或约20℃至约45℃。在一些实施例中，培养的时间周期为例如约0.2秒至约24小时，或约1秒至约6小时，或约2秒至约1小时，或约1分钟至约15分钟。时间周期取决于培养基的温度和各种反应物结合的速率，这由缔合速率常数、浓度、结合常数和离解速率常数决定。

[0126] 在测定怀疑含有维生素D的样品中的维生素D的方法实例中，在培养基中提供一种组合物，其中该组合物包含样品、释放剂(如果样品未经预处理以从内源性结合物质中释放维生素D)，维生素D抗体，和符合本文中所述原则的标记化合物，其中该标记物为聚(氨基酸)标记物或非聚(氨基酸)标记物。检验该培养基以获得包含维生素D和维生素D抗体的复合物或包含标记化合物和维生素D抗体的复合物之一或两者的存在和/或量。复合物之一或两者的存在和/或量指示样品中维生素D的存在和/或量。

[0127] 一些已知的分析使用信号产生体系(sps)，其使用第一和第二sps成员。指定“第一”和“第二”完全是任意的，并不意在暗示sps成员中的任何顺序或等级，或在本方法中添加sps成员的任何顺序。sps成员可以是关联的，即一个sps成员的活化产生产物(例如光或活化产物)，其导致另一个sps成员的活化。

[0128] 在分析的一些实施方案中，sps成员包含增敏剂例如，举例来说光敏剂，和化学发光组合物，其中增敏剂的活化产生使化学发光组合物活化的产物。第二种sps成员通常产生可检测信号，该信号与结合和/或未结合的sps成员的量(即与待检测的维生素D分析物或与符合本文中所述原则的化合物结合或未结合的sps成员的量)有关。在符合本文中所述原则的一些实施例中，增敏剂反应物或化学发光反应物之一包含本发明的化合物反应物。

[0129] 在一个具体实例中，可以使用诱导发光免疫分析。诱导发光免疫分析在美国专利号5,340,716 (Ullman)中提及，将其公开内容通过引用并入本文。在一个方法中，该分析使用具有与之缔合的光敏剂的颗粒，其中符合本文中所述原则的化合物与该颗粒结合(颗粒-化合物反应物)。化学发光反应物包含维生素D抗体。维生素D分析物与颗粒-化合物反应物竞争以与维生素D抗体结合。如果存在维生素D分析物，较少量的颗粒-化合物反应物分子与化学发光反应物紧密接近。因此，分析信号将减小。当两种标记物紧密接近时，光敏剂产生单线态氧，并使化学发光反应物活化。经活化的化学发光反应物随后产生光。所产生的光的量与所形成的复合物的量有关，其进而与样品中存在的维生素D分析物的量有关。

[0130] 在诱导发光免疫分析的另一个具体实例中，该分析使用具有与之缔合的化学发光化合物的颗粒，其中符合本文中所述原则的化合物与颗粒结合(颗粒-化合物反应物)。光敏剂反应物包含维生素D抗体。维生素D分析物与颗粒-化合物反应物竞争以与维生素D抗体结合。如果存在维生素D分析物，较少量的颗粒-化合物反应物分子与光敏剂反应物紧密接近。因此，分析信号将减小。当两种标记物紧密接近时，光敏剂产生单线态氧，并使颗粒-化合物反应物的化学发光化合物活化。经活化的化学发光化合物随后产生光。所产生的光的量与所形成的复合物的量有关，其进而与样品中存在的维生素D分析物的量有关。

[0131] 在诱导发光分析的另一个具体实例中，使用光敏剂颗粒，其与小分子的结合配偶体例如，举例来说抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素(其为生物素的结合配偶体)共轭。也使用包含生物素的符合本文中所述原则的化合物(化合物-生物素反应物)。包含维生素D的特异性结合成员的化学发光反应物用作检测体系的一部分。培养反应培养基以允许光敏剂颗粒的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素借助于抗生物素蛋白和生物素之间的结合而与化合物-生物素反应物结合，并且还允许属于化学发光反应物的一部分的维生素D的特异性结合成员与维生素D分析物或与光敏剂颗粒现在连接的符合本文中所述原则的化合物结合。然后，用光辐照该培养基来激发光敏剂，其在其激发态能够使氧活化为单线态。因为由于存在维生素D分析物，现在较少的化学发光反应物与光敏剂紧密接近，所以化学发光反应物被单线态氧活化的较少，且发光较少。然后检验培养基以获得发光或发射光的存在和/或量，其存在与维生素D分析物的存在和/或量有关，其中在维生素D分析物存在下，观察到信号减小。

[0132] 在诱导发光分析的另一个具体实例中，使用光敏剂颗粒，其与小分子的结合配偶体例如，举例来说抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素(其为生物素的结合配偶体)共轭。共轭反应物包含与生物素共轭的维生素D的特异性结合成员。使用符合本文中所述原则的化合物，其中该化合物与化学发光颗粒连接(化学发光-化合物反应物)。培养反应培养基以允许光敏剂颗粒的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素借助于抗生物素蛋白和生物素之间的结合而与抗体-生物素反应物结合，并且还允许维生素D的特异性结合成员与样品中如果存在的维生素D和与属于化学发光-化合物反应物的一部分的符合本文中所述原则的化合物结合。然后，用光辐照该培养基来激发光敏剂，其在其激发态能够使氧活化为单线态。因为由于存在维生素D分析物，现在较少的化学发光-化合物反应物与光敏剂紧密接近，所以化学发光反应物被单线态氧活化的较少，且发光较少。然后检验培养基以获得发光或发射光的存在和/或量，其存在与维生素D分析物的存在和/或量有关，其中在维生素D分析物存在下，观察到信号减小。

[0133] 作为说明而非限制，用于检测维生素D的分析形式的另一个实例为ACMIA分析形式。对于ACMIA分析形式，涂布有维生素D或维生素D类似物的二氧化铬颗粒(二氧化铬颗粒反应物)用作第一组分。第二组分为维生素D抗体。该抗体与报告酶(reporter enzyme)(例如β-半乳糖苷酶)交联形成抗体-酶共轭物，以过量(即大于结合样品中可能存在的所有维生素D分析物所需的量)加入到反应容器中。预先用释放剂经过处理的样品用维生素D抗体来处理，所述抗体与样品中的维生素D结合。抗体-酶共轭物与样品在培养基中混合，以允许维生素D分析物与抗体结合。接下来，添加二氧化铬颗粒反应物以束缚任何过量的抗体-酶共轭物。然后，施加磁铁，将所有二氧化铬颗粒和过量抗体-酶从悬浮液中吸出，并将上清液转移至最终的反应容器。将报告酶的底物加入到最终的反应容器中，以吸收率随时间变化的形式，用分光光度法测量酶活性。该信号的量与样品中维生素D的量有关。

[0134] 符合本文中所述原则的维生素D分析的另一个实例为使用顺磁性颗粒作为固相的吖啶酯标记物免疫分析(ADVIA免疫分析)。用于该维生素D分析实例的检测系统包括小分子共轭物或捕获共轭物形式的小分子-标记的维生素D(捕获部分)，固相(SP)形式的小分子的结合配偶体涂布的顺磁性胶乳颗粒，和吖啶酯标记的维生素D抗体(检测抗体)。小分子可以为例如生物素或荧光素，且各个结合配偶体可以为抗生蛋白链菌素或荧光素抗体。维生素D可以与小分子直接连接，或者通过连接基团例如，举例来说蛋白质，例如牛血清白蛋白(BSA)与小分子连接。患者样品中的维生素D与捕获部分的维生素D竞争，以与吖啶酯标记的检测抗维生素D抗体结合。怀疑含有维生素D的样品用1,8-ANS进行预处理。该分析可以根据随之提供的制造商说明书，在Centaur®，Centaur® XP或Centaur® CP设备(Siemens Healthcare Diagnostics Inc.，Newark DE)上进行。

[0135] 符合本文中所述原则的维生素D分析的另一个实例为使用顺磁性颗粒作为固相的吖啶酯标记物免疫分析(ADVIA免疫分析)。用于该维生素D分析实例的检测系统包括生物素共轭物或捕获共轭物形式的小分子-标记的维生素D抗体(捕获抗体)，固相(SP)形式的抗生蛋白链菌素涂布的顺磁性胶乳颗粒，和吖啶酯标记的维生素D(检测半抗原)。吖啶酯标记物可以与维生素D直接结合形成检测半抗原，或者可以使用连接基团，包括例如蛋白质，例如举例来说BSA。患者样品中的维生素D与吖啶酯标记的检测半抗原竞争，以与抗维生素D抗体结合。怀疑含有维生素D的样品用1,8-ANS进行预处理。该分析可以根据随之提供的制造商说明书，在Centaur® ，Centaur®  XP或Centaur®CP设备(Siemens  Healthcare Diagnostics Inc.，Newark DE)上进行。在上述吖啶酯分析的变型中，小分子可以为例如生物素或荧光素。

[0136] 可以分析的样品中维生素D分析物的浓度通常为例如约10-5至约10-17 M，或约10-6至约10-14 M。考虑例如分析是定性、半定量还是定量的(相对于样品中存在的维生素D分析物的量)，特定的检测技术和维生素D分析物的预期浓度通常决定各反应物的浓度。

[0137] 分析培养基中各反应物的浓度将通常由所考虑的维生素D分析物的浓度范围，分析的特性等决定。但是，各反应物的最终浓度通常凭经验确定，以优化考虑范围内分析的灵敏度。也即，显著的维生素D分析物的浓度变化将提供可精确测量的信号差异。例如信号产生体系的特性和分析物的特性的各种因素通常决定各反应物的浓度。

[0138] 如上所述，样品和反应物以组合形式提供在培养基中。虽然加入到培养基中的顺序可以变化，但是对于本文中所述分析形式的一些实施方案，将存在一定的优先。最简单的加入顺序毫无疑问是同时加入所有材料，并决定分析培养基对信号产生的影响，如同在均质分析中。或者，可以按顺序组合各反应物，或反应物组。在一些实施方案中，在如上所述的各个添加步骤之后，可以包括培养步骤。在非均质分析中，在一个或多个培养步骤之后还可以使用洗涤步骤。

[0139] 检验步骤

[0140] 在分析方法的下一步中，检验培养基以验证包含维生素D分析物和维生素D抗体的复合物和/或包含符合本文中所述原则的化合物反应物和维生素D抗体的复合物的存在。复合物之一或两者的存在和/或量指示样品中维生素D分析物的存在和/或量。

[0141] 短语“测量维生素D分析物的量”表示维生素D的定量、半定量和定性测量。定量、半定量和定性的方法，以及测定维生素D分析物的所有其它方法，都被认为是测量维生素D分析物的量的方法。例如，仅检测怀疑含有维生素D分析物的样品中是否存在维生素D分析物的方法被认为包括在本发明范围内。术语“检测”和“测定”以及测量的其它常见同义词预期在本发明范围内。

[0142] 在许多实施方案中，培养基的研究涉及从培养基检测信号。信号的存在和/或量与样品中维生素D分析物的存在和/或量有关。检测的特定方式取决于信号产生体系的特性。如上所述，有许多方法，借助于该方法，产生信号的信号标记物可以产生可由外部装置检测的信号。信号产生体系的活化取决于信号产生体系成分的特性。

[0143] 测量期间的温度通常为例如约10℃至约70℃，或为约20℃至约45℃，或为约20℃至约25℃。在一个方法中，使用已知的维生素D分析物浓度形成标准曲线。也可以使用校准仪和其它对照物。

[0144] 由任何标记物产生的冷光或光可以以目测、摄影、光量测定、分光光度的形式测量，例如通过使用光电倍增器或光电二极管，或任何测定其与培养基中维生素D分析物量有关的量的其它适宜装置。信号的存在和/或量的研究还包括信号检测，这通常仅是其中阅读信号的一个步骤。通常使用仪器阅读信号，仪器特性取决于信号的特性。仪器可以为但不限于例如分光光度计，荧光计，吸收分光计，光度计和化学光度计(chemiluminometer)。

[0145] 用于进行分析的包含反应物的试剂盒

[0146] 反应物包含与信号产生体系成员连接的符合本文中所述原则的化合物，其还可以包含载体，和用于进行维生素D分析物的特定分析的其它反应物，其可以存在于试剂盒中，该试剂盒可用于方便地进行测定维生素D分析物的分析。在一些实施方案中，试剂盒包含包装组合形式的生物素-结合配偶体，例如举例来说抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素，其与颗粒，符合本文中所述原则的生物素化的化合物以及标记的维生素D分析物抗体缔合。该试剂盒可以进一步包括用于进行分析的其它反应物，其特性取决于特定的分析形式。

[0147] 反应物可以各自在单独的容器中，或者各反应物可以在一个或多个容器中混合，取决于反应物的交叉反应性和稳定性。该试剂盒可以进一步包括用于进行分析的其它分别包装的反应物，例如举例来说额外的特异性结合对成员，信号产生体系成员，和辅助反应物。

[0148] 试剂盒中各反应物的相对量可以在很大程度上变化，以提供显著优化本发明方法期间需要发生的反应和进一步显著优化分析灵敏度的反应物浓度。在适当情形下，试剂盒中的一种或多种反应物可以以包含赋形剂的干燥粉末(通常经过冷冻干燥)的形式提供，其在溶解时将提供对于使用符合本文中所述原则的化合物反应物实施方法或分析而言具有适当浓度的反应物溶液。该试剂盒可以进一步包括使用反应物(其包括符合本文中所述原则的化合物反应物)的方法的书面说明书。

[0149] 如本文所使用的，短语“至少”表示所指定项的数量可以等于或大于所述数值。如本文所使用的，短语“约”表示所述数值可以相差加上或减去10%；例如“约5”表示4.5至5.5的范围。

[0150] 通过说明而非限制的方式，以下讨论涉及符合本文中所述原则的具体实施例；该具体实施例并不意图限制本公开内容和所附权利要求的范围。在不脱离本公开内容的精神和范围的基础上，可以设想多种修改和替代组合物、方法和体系。实施例

[0151] 除非另有说明，以下实验中的材料可以购自Sigma-Aldrich Chemical Corporation (St. Louis MO)或Fluka Chemical Corporation (Milwaukee WI)。本文所公开的份数和百分数按重量比体积计，除非另有说明。

[0152] 定义：

[0153] mg = 毫克

[0154] g = 克

[0155] ng = 纳克

[0156] mL = 毫升

[0157] µL = 微升

[0158] µmol = 微摩尔

[0159] ℃ = 摄氏度

[0160] min = 分钟

[0161] sec = 秒钟

[0162] hr = 小时

[0163] w/v = 重量比体积

[0164] TLC = 薄层色谱法

[0165] HPLC = 高效液相色谱法

[0166] EtOAc = 乙酸乙酯

[0167] DMF = 二甲基甲酰胺

[0168] DMSO = 二甲基亚砜

[0169] MeOP = 1-甲氧基-2-丙醇

[0170] MES = 2-(N-吗啉基)乙磺酸

[0171] DI = 蒸馏

[0172] UPA = 超微粒分析仪(Ultra Particle Analyzer)

[0173] LOCI = 发光氧通道免疫分析

[0174] BSA = 牛血清白蛋白

[0175] BGG = 牛丙种球蛋白

[0176] mIgG = 小鼠免疫球蛋白

[0177] MS = 质谱分析法。

[0178] EPRM-EDA珠粒的制备

[0179] 向40 mL小瓶中加入EPRM珠粒(2000 mg，20.0 mL)。该EPRM珠粒由类似于美国专利号7,179,660中所述的程序制备，且化学发光化合物为含有铕的2-(4-(N,N-二-十四烷基)-苯胺基-3-苯基二甲基噻吩螯合物。将EDA(800 mg，890 μL)与10 mL的MES pH 6缓冲剂(“Buffer”)和约4.2 mL的6N HCl混合。该混合物的pH为约6.9，或调节为约6.9。利用涡流将EDA溶液加入到EPRM珠粒中，并在室温下将混合物摇动15分钟。在15 mL小瓶中将氰基硼氢化钠(400 mg)与10 mL去离子水混合，将该组合物加入到上述珠粒混合物中。将混合物在37℃摇振18-20小时。将珠粒转移至六个40 mL离心管中。添加MES缓冲剂，使体积达到35 mL，将该混合物以19,000 rpm离心处理30分钟。滗析上清液，用搅拌棒使珠粒再悬浮在2 mL的Buffer中，加入另外的Buffer至35 mL。将混合物以18瓦特的功率超声处理30秒钟，使用冰将混合物保持冷却。洗涤/超声处理步骤进行4次，以去除所有的活化化学品。最后的MES Buffer离心处理之后，向管中加入含有5%MeOP和0.1%Tween®20的2 mL的Buffer (“第二Buffer”)用于再悬浮步骤。超声处理之前加入另外的第二缓冲剂至35 mL。将珠粒悬浮液以19,000 rpm离心处理30分钟。弃去上清液。最终的超声处理在各个管中使用12 mL的第二Buffer，产生25 mg/mL稀释液。如在UPA仪器上所测定的，粒度为277 nm。

[0180] 以类似于美国专利号6,153,442和美国专利申请公开号20050118727A中所述方法的方式制备EPRM发光珠(chemibead)，将其相关公开内容通过引用并入本文。该EPRM发光珠包含氨基葡聚糖内层和具有游离醛官能团的葡聚糖醛外层。参见例如美国专利号5,929,049、7,179,660和7,172,906，将其相关公开内容通过引用并入本文。在使用合适的缓冲剂，例如举例来说MES的缓冲水性介质中，反应在约0至约40℃的温度，约5.5至约7.0，或约6的pH下进行约16至约64小时。通过加入合适的淬灭剂，例如举例来说羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)，和后续颗粒的洗涤，使反应淬灭。

[0181] 外部葡聚糖醛层上的醛基在还原胺化条件下与乙二胺反应，形成反应物EPRM-EDA，其具有包含亚乙基链和末端胺基的侧链部分。所述还原胺化条件包括使用还原剂，例如举例来说金属氢化物。反应期间，该反应在约20℃至约100℃的温度下在水性介质中进行约1小时至约48小时。

[0182] 25-OH维生素D3 3-氨基甲酸酯(25-OH维生素D2 3-氨基甲酸酯)的合成

[0183] 参见图1，在氮气下在室温下将5-ml烧瓶(用箔片覆盖)中的22 mg (55 μmol)的购自ChemReagents.com，Sugarland TX的25-OH VD3 (I)、100 mg (420 μmol)的二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、1 mL无水乙腈中的100 μL三乙胺的混合物搅拌18小时，以制备活化的25-OH VD3(II)。TLC (EtOAc:己烷= 2:1)显示没有起始材料残留。通过向10 ml烧瓶中加入150 mg的羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)，0.3 ml的三乙胺和1 ml的DMF来制备悬浮液。伴随着搅拌向CMO悬浮液中滴加含有活化的25-OH VD3的溶液，持续搅拌另外18小时。施加真空以尽可能地去除溶剂(加热浴温度不应超过50℃)。向残余物中加入EtOAc (25 ml)，用2 ml盐水洗涤三次。用无水Na2SO4干燥有机相并过滤；使用旋转蒸发仪去除溶剂。干燥之后获得粗产物(42 mg)，并通过HPLC纯化。高真空下干燥之后获得纯产物(III)(p = 1)(24 mg)。将产物溶于1.2 ml的无水DMSO中。将等分试样转移到保持在-70℃的小瓶中。

[0184] 采用类似于上述的方法，使用25-OH VD2制备25-OH维生素D2 3-氨基甲酸酯。

[0185] 25-OH维生素D3 3-琥珀酸酯(25-OH维生素D2 3-琥珀酸酯)的合成

[0186] 在氮气下在室温下将5-ml烧瓶中的14.2 mg (35.4 μmol)的25-OH VD3、8.2 mg (90 μmol)的琥珀酸酐、1 mL无水二氯甲烷中的8.2 mg咪唑的混合物搅拌24小时。TLC (EtOAc:己烷= 2:1)显示没有起始材料残留。使用50℃下的加热浴，在真空下去除溶剂。向残余物中加入EtOAc，然后用3×2 ml盐水洗涤三次。用无水Na2SO4去除有机相并过滤。使用旋转蒸发仪去除溶剂，所得材料在高真空下干燥，得到18 mg的粗产物，通过MS证明其为25-OH维生素D3 3-琥珀酸酯。

[0187] 采用类似于上述的方法，使用25-OH VD2制备25-OH维生素D2 3-琥珀酸酯。

[0188] EPRM-EDA和25-OH维生素D3 3-氨基甲酸酯偶合产生颗粒反应物VI

[0189] 参见图1和2，向标记为3323-064-1的2-mL小瓶中加入氨基甲酸酯III (10 μL如上所述制备的DMSO中的等分试样)(0.2 mg)。向标记为EDAC/SNHS的5-mL小瓶中加入EDAC (6.8 mg)和SNHS (9.4 mg)，加上2.27 mL的无水DMSO (3 mg/mL)。向小瓶3323-064-1中加入EDAC/SNHS溶液(190 μL)(1 mg/mL)，以制备活化的25-OH维生素D3 3-氨基甲酸酯IV。使混合物在室温下旋转18小时。用3.6 mL去离子水将16%的GAFAC®表面活性剂溶液(GAF Corporation，Wayne NJ)的0.4 mL等分试样(0.15%)稀释至1.6%。

[0190] 将维生素D3(8.5 mg)和850 μL的DMSO (10 mg/mL)混合。向装有搅拌棒的10 mL圆底烧瓶(标记为3323-064B)中加入2.0 mL (200MG)的EPRM-EDA，随后加入400 μL (4 mg)的上述维生素D3溶液。将该混合物在室温下搅拌过夜。

[0191] 向装有搅拌棒的10 mL圆底烧瓶(指定为3323-64A)中加入2.0 mL (200 mg)的EPRM-EDA (如上所述制备)，随后加入260 μL的1.6%的GAFAC®表面活性剂溶液(0.15%)，伴随适度搅拌。向小试管中加入504 μL的无水DMSO，随后加入如上所述制备的60 μL (0.06 mg)的3323-064-1活化的维生素D3-3-氨基甲酸酯IV；和将该混合物加入到EPRM-EDA珠粒混合物中。3323-64A珠粒悬浮液的DMSO总含量为20%。

[0192] 向10 mL圆底烧瓶(指定为3323-064B)中加入260 μL的1.6%的GAFAC®表面活性剂溶液(0.15%)，伴随适度搅拌。向小试管中加入104 μL的无水DMSO，随后加入60 μL (0.06 mg)的3323-064-1活化维生素D3-3-氨基甲酸酯IV。将DMSO/活化维生素D3-3-氨基甲酸酯IV加入到珠粒混合物中。混合的反应物(维生素D3/DMSO)加上添加的DMSO使3323-064B珠粒悬浮液得到20%的DMSO含量。将两个反应容器在室温下搅拌过夜。然后，通过透滤法洗涤珠粒。

[0193] 每批珠粒与10%的MeOP/1% GAFAC®/MES pH6缓冲剂占据20 mL工作体积。用5份量的缓冲剂使混合物透滤，然后用18-21瓦特的探针超声波仪进行超声处理，使用冰保持混合物冷却。透滤/超声处理持续经过50份量，以35、40、45和50份量取得流出物样品。将缓冲剂改变为LOCI半抗原洗涤缓冲剂(50 mM HEPES、300 mM NaCl、1 mM EDTA、0.01%的新霉素硫酸盐、0.1%的TRITON® 405X和0.15%的PROCLIN® 300，pH为7.2)，使用10份量。将混合物减少到约7 mL，并实施UPA。粒度为3323-064A = 289 nm和3323-064B = 298 nm。测定固体百分比，用LOCI半抗原洗涤缓冲剂pH7.2使两批珠粒达到10 mg/mL。产率如下：3323-064A = 160.4 mg和3323-064B = 183.5 mg。

[0194] EPRM-EDA和25-OH维生素D2 3-氨基甲酸酯偶合产生颗粒反应物VII

[0195] 以类似于制备颗粒反应物VI的上述方式，将25-OH维生素D2 3-氨基甲酸酯与EPRM-EDA偶合，以产生相似的颗粒反应物VII，在如下所述分析中使用其代替颗粒反应物VI。另外，在如下所述的分析中使用颗粒反应物VI和颗粒反应物VII的组合代替颗粒反应物VI。

[0196] EPRM-EDA和25-OH维生素D3 3-琥珀酸酯的偶合

[0197] 向标记为3323-026-1的2-mL小瓶中加入25-OH维生素D3 3-琥珀酸酯(如上所述制备的DMSO中的66 μL的等分试样)(2 mg)。向标记为EDAC/NHS的5-mL小瓶中加入EDAC (20 mg)和NHS (20 mg)，加上0.8 mL的无水DMSO (25 mg/mL)。向小瓶3323-026-1中加入EDAC/NHS溶液(180 μL)(8.1 mg/mL)，以制备活化的维生素D3-3-琥珀酸酯。将混合物在室温下旋转18小时。向2-mL离心管3323-026A中加入0.5 mL (50 mg)的EPRM-EDA，随后加入1.4 ml的MES pH6，随后加入(119 μL)(0.96 mg)的活化维生素D3-3-琥珀酸酯(添加过程中伴随着涡流)。所述添加使珠粒得到5.9%的DMSO含量。

[0198] 向标记为3323-026B的2-mL离心管中加入0.5 mL (50 mg)的EPRM-EDA，随后加入1.4 ml的MES pH6，随后加入69 μL的DMSO加上30 μL (0.24 mg)的活化维生素D3-3-琥珀酸酯(添加过程中伴随着涡流)。所述添加加上额外的DMSO使珠粒得到5%的DMSO含量。

[0199] 将混合物转移至40 mL离心管中。加入含有10%的MeOP和1%的GAFAC®的MES pH6缓冲剂，使管中的份量达到35 mL。将管以18,500 rpm离心处理30分钟。滗析上清液。将珠粒再悬浮在具有搅拌棒的1 mL MES缓冲剂混合物中。加入更多的MES缓冲剂混合物，使管达到35 mL。使用冰以保持管冷却，将管在18-21瓦特的功率下超声处理(探针超声波仪)60秒。如上离心处理珠粒，进行总共4次MES-MeOP-GAFAC®缓冲剂洗涤。最后的洗涤之后，将珠粒再悬浮在1 mL半抗原洗涤缓冲剂中，而不是如上所述的MES缓冲剂混合物中，并进行另外2次洗涤。将珠粒再悬浮在充足的半抗原洗涤缓冲剂中，得到15 mg/mL悬浮液。将珠粒以50%功率(杯型超声波仪(cup sonicator))超声处理60秒。在UPA仪器上测定粒度。3323-26A的粒度为290 nm；3323-26B的粒度为275 nm。产率如下：3323-26A = 33.2 mg和3323-26B = 32.3 mg。

[0200] 维生素D分析物的分析

[0201] 在DIMENSION® VISTA®分析仪(Siemens Healthcare Diagnostics Inc.，Deerfield，IL)上，按照LOCI分析的规程和使用含有不同量的25-羟基维生素D3的样品溶液进行分析(作为测量样品中总的维生素D的实例)。在该实施例中，所述分析使用符合本文中所述原则的标记物颗粒-共轭物(“一个或多个发光珠”)作为化学发光反应物，其中颗粒-共轭物的标记物为胶乳颗粒中包含的化学发光化合物。样品首先与针对25-羟基维生素D的生物素化抗体反应，然后与发光珠反应。发光珠与并未被来自样品的分析物占据的单克隆抗体结合位点的片段结合。随后，向反应混合物中加入抗生蛋白链菌素偶合的增敏剂珠粒。这导致发光珠/敏化珠粒(sensibead)对形成，其浓度与25-羟基维生素D3的浓度逆相关。当照度在680 nm时，增敏剂珠粒产生单线态氧，该单线态氧扩散进入到与敏化珠粒配对的发光珠中，与烯属染料反应并触发大约612 nm下的化学发光信号，其与分析物浓度逆相关。

[0202] 使用类似于美国专利号6,153,442、7.022,529、7,229,842和美国专利申请公开号20050118727A中描述的方法制备抗生蛋白链菌素-增敏剂珠粒(一种或多种“敏化珠粒”)。
所述光敏剂为双-(三己基)-硅-叔丁基-酞菁。敏化珠粒反应物的浓度在pH 8.0，含有150 mM的NaCl的HEPES缓冲剂中为200 μg/mL。如上所述制备的EPRM-EDA-25-OH维生素D3颗粒反应物VI用作“发光珠反应物”，在pH 7.2，含有150 mM的NaCl和0.1%的洗涤剂的HEPES缓冲剂中浓度为200 μg/mL。

[0203] 生物素化的抗体反应物以类似于美国专利申请公开号2009/0258435A1(将其相关部分通过引用并入本文)中描述的方式，使用对于25-羟基维生素D为特异性的单克隆抗体(绵羊单克隆抗体，来自Bioventix，Farnham，Surrey，UK)和抗体的生物素化胺基，通过与NHS-PEO4-生物素(Pierce Chemical Company，Rockford IL)反应来制备。生物素化的抗体反应物在含有150 mM NaCl和16 mg/mL BSA，1 mg/mL mIgG和2 mg/mL BGG的HEPES缓冲剂(pH 7.2)中制备，其中生物素化的抗体反应物的浓度为1000 ng/mL。

[0204] 同样如上所述进行分析，除了使用EPRM-EDA-25-OH维生素D3琥珀酸酯颗粒反应物代替EPRM-EDA-25-OH维生素D3颗粒反应物VI。

[0205] 在时间t =零秒，向反应容器中加入20 μL生物素化的抗体反应物和20 μL水。21.6秒后添加12 μL样品，随后添加8 μL水。在t = 414.0秒，加入40 μL的发光珠反应物，随后加入20 mL水。然后在457.2秒分配敏化珠粒反应物。引发反应时序之后601.2秒取得测量值。

[0206] 结果总结在下表1中。

[0207]

[0208] 如可以从表1中看出的，与25-OH-D3-3-琥珀酸酯发光珠反应物相比，符合本文中所述原则的25-OH-D3-3-氨基甲酸酯发光珠反应物一贯产生更高的信号计数。

[0209] 使用与EPRM-EDA偶合的25-OH维生素D2 3-氨基甲酸酯(颗粒反应物VII)代替颗粒反应物VI重复上述分析。样品溶液含有不同量的25-羟基维生素D3 (作为测量样品中总的维生素D的实例)。所得结果总结在表2中。

[0210]

[0211] 如可以从表2中看出的，与25-OH-D3-3-琥珀酸酯发光珠反应物相比，符合本文中所述原则的25-OH-D2-3-氨基甲酸酯发光珠反应物一贯产生更高的信号计数。

[0212] 同样使用颗粒反应物VI和颗粒反应物VII的组合(50/50按重量计)代替颗粒反应物VI重复上述分析。样品溶液含有不同量的25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2的组合(作为测量样品中总的维生素D的实例)。所得结果与使用颗粒反应物VI的分析的上述那些结果相似。

[0213] 在此将本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，就如同每个单独的出版物或专利申请被特别和单独指明通过引用并入本文一样。

[0214] 应理解上述实施例仅举例说明代表本文中所述原则的许多具体实施例的一部分。在不脱离以下权利要求限定的范围的基础上，本领域技术人员无疑可以容易地设想出许多其它方案。