一种纳米银灭菌槲蕨孢子的方法转让专利
申请号 : CN201510303444.7
文献号 : CN104938334B
文献日 : 2017-06-16
发明人 : 石雷 , 李彦敬 , 李杨
申请人 : 中国科学院植物研究所
摘要 :
本发明提供一种纳米银灭菌槲蕨孢子的方法，包括如下步骤：将槲蕨孢子用无菌水冲洗1遍以上，用100‑2000ppm的纳米银溶液灭菌15‑25分钟，再用5％次氯酸钠溶液灭菌3‑10分钟，最后经过无菌水冲洗2遍以上。本发明的方法可以使得槲蕨的孢子既达到最佳的灭菌状态，又保持了孢子较高的萌发率和较低的畸形率。
权利要求 :
1.一种纳米银灭菌槲蕨孢子的方法，其包括如下步骤：将槲蕨孢子用无菌水冲洗1遍以上，用500ppm的纳米银溶液灭菌15-25分钟，再用5%次氯酸钠溶液灭菌5-6分钟，最后经过无菌水冲洗2遍以上。
2.如权利要求1所述的纳米银灭菌槲蕨孢子的方法，其特征在于，灭菌过程在无菌离心管中完成。
3.一种槲蕨孢子无菌播种方法，其根据权利要求1或2所述的方法进行灭菌，播种于无菌的1/2MS培养基里培养。
说明书 :
一种纳米银灭菌槲蕨孢子的方法
技术领域
[0001] 本发明属于植物组培领域，具体涉及一种适合槲蕨(Drynaria fortunei(Knuze)J.SM.)孢子组织培养的灭菌方法。
背景技术
[0002] 槲蕨是槲蕨科槲蕨属中极有特色的一种附生草本蕨类，其槲蕨的根状茎富含柚皮甙(naringin)，21-何帕烯(hop-21-ene)及采油甾醇(campesterol)等化学成分，具有治牙痛，治肾虚耳鸣、耳聋，斑秃等作用。
[0003] 在槲蕨的生产中，其繁殖方法是一个重要的问题，槲蕨的传统繁殖方式分为分株繁殖和孢子繁殖两种，分株繁殖非常容易到季节、栽培环境等条件的约束，且分株的繁殖率很低；孢子繁殖容易获得孢子，繁殖系数高，是快速繁育种苗的有效途径，但是也是容易受环境因子的影响；近些年来，国内外不断展开各种各样蕨类孢子无菌培养的研究，无菌培养因具有不受环境、时间等外界因素的影响和高效等特点，并被广泛的运用于植物的生产和应用中，在槲蕨孢子的无菌培养中，灭菌方法是很关键的一步，灭菌不当很容易造成培养中的污染，针对不同灭菌方式对槲蕨孢子无菌培养的影响进行研究，为槲蕨的无菌培养奠定理论基础，并为其商业化生产提供技术支持。
[0004] 在孢子的无菌培养过程中，仅用无菌水的冲洗能对真菌有一定的作用，但不会杀死细菌，为了有效地防止无菌培养过程中的细菌污染，孢子的无菌培养中常用70％酒精、升汞、次氯酸钠(NaOCl)、次氯酸钙Ca(OCl2)﹒4H2O)等无机灭菌剂，无机灭菌剂的种类，浓度和灭菌时间是孢子无菌培养的研究热点，有研究表明次氯酸钠浓度提高到5％，真菌污染会减少，但会产生副作用导致萌发率降低，次氯酸钙度即使到达5％不会影响孢子萌发，但是真菌污染基本没减少。不同种类的孢子对不同的无机灭菌剂的敏感程度也会不同，分支沙草蕨经次氯酸钠，赤链霉素，灭菌，只有用链霉素灭菌的孢子能萌发，蜈蚣草的孢子却可以用升汞来灭菌。槲蕨的无菌培养多采用次氯酸钠，有研究表明用5％次氯酸钠溶液灭菌5分钟能使得槲蕨在无菌培养中达到较好的灭菌效果，但也有研究表明仅用次氯酸钠灭菌虽然能够有效减少孢子在组织培养中的细菌污染，但是可能对真菌污染没有明显作用。
[0005] 近些年来许多种植物组织培养的灭菌方法引进了有机的纳米级别的抗菌剂，也就是一种以运用纳米技术研制而成的新型抗菌剂，纳米抗菌剂在光下产生的活性氧离子具有很强的氧化能力，能在短时间内破坏细菌的增殖能力而使细胞死亡，一般纳米抗菌剂的配方是由简单的无毒的金属或金属氧化物，如纳米晶体形式的铝、锌、氧化镁、氧化钙、氧化铝、氧化锌等制成，并携带有活跃的卤素如MgO.Cl2和MgO.Br2(Olga,2002)，纳米级别的粉末和配方对芽孢杆菌属，病毒和毒素的孢子及营养细胞的杀伤作用，并且其杀伤能力的大小与其浓度和接触时间相关，研究已经证实在种子植物的组织培养中，纳米粒子溶液比较非纳米溶液确实能起到更强的消毒作用，如纳米TiO2和非纳米TiO2，但是同无机灭菌剂一样，其消毒效果也会因外植体种类而异，比如水悬浮液培养的黑麦草，大麦，亚麻的种子，零价纳米铁粒子溶液(nZVI)在250mg/L时产生抑菌作用，而纳米银溶液(Ag)在10mg/L就能产生抑菌作用；植物的茎部对纳米银抗菌剂的敏感度高于种子。纳米粒子溶液的浓度不合适(过高)或处理时间不合适(过长)时也会起到副作用，如抑制种子萌发和根生长，活性氧形成，过氧化胁迫，严重的脂质过氧化等。
[0006] 孢子的灭菌研究多集中在无机灭菌剂上，但仅用无机灭菌剂灭菌往往达不到理想的真菌灭菌效果，种类不同对灭菌剂的敏感程度也不同，槲蕨孢子的灭菌研究很少。
[0007] 纳米抗菌剂作为一种新型的有机灭菌剂，在种子的无菌培养中比较常见，并已经在几种外植体的无菌培养中应用，但是在孢子的无菌培养中未见报道。因此，需要探索一种更为有效的槲蕨孢子灭菌方法。
发明内容
[0008] 为解决上述问题，本发明提供一种纳米银灭菌槲蕨孢子的方法。
[0009] 本发明提供的纳米银灭菌槲蕨孢子的方法，包括如下步骤：将槲蕨孢子用无菌水冲洗1遍以上，用100-2000ppm的纳米银溶液灭菌15-25分钟，再用5％次氯酸钠溶液灭菌3-10分钟，最后经过无菌水冲洗2遍以上。
[0010] 优选的，纳米银溶液浓度为300-800ppm。
[0011] 更优选的，纳米银溶液浓度为500ppm。
[0012] 在本发明一个实施方案中，优选用5％次氯酸钠溶液灭菌5-6分钟。
[0013] 在本发明另一个实施方案中，灭菌过程在无菌离心管中完成。
[0014] 本发明中，纳米银溶液可以市售获得。
[0015] 本发明还提供一种槲蕨孢子无菌播种方法，其为根据所述的灭菌方法进行灭菌，播种于无菌的1/2MS培养基里培养。
[0016] 本发明的方法可以使得槲蕨的孢子既达到最佳的灭菌状态，又保持了孢子较高的萌发率和较低的畸形率。在槲蕨孢子的组织培养中采用本发明方法，原萌发率为89.5％的孢子，经本方法后萌发率仅仅降低了4.9％，发育过程中的畸形率仅有17％，而且还保证了孢子在组织培养中不受污染，与其他方法相比，本发明方法具有成本低廉、高效率维持孢子活力的特点。
具体实施方式
[0017] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0018] 实施例1槲蕨(Drynaria fortunei(Knuze)J.SM.)孢子的组织培养灭菌方法。
[0019] 在12个5ml离心管中分别装4mg左右槲蕨孢子，并用无菌水冲洗1遍后，分别用1％、5％、10％的次氯酸钠溶液各灭菌3、5、7、10分钟。最后经过无菌水冲洗3-4遍后，播种于无菌的1/2MS培养基里，密封后放于培养室培养。以1个“+”代表污染程度为1个级别，全部污染用
5个“+”表示，“0”表示无污染，孢子培养过程中的污染情况和萌发情况如表1，灭菌浓度越低，灭菌时间越少，污染越严重。灭菌浓度以及灭菌时间在10％和3分钟以上的培养均没有污染，但是与未灭菌的孢子89.5％的萌发率相比，当灭菌浓度达到5％时间达到7分钟后，孢子的萌发就开始受到影响，灭菌浓度为10％，灭菌时间达到10分钟时，孢子萌发受到的影响最严重，萌发率仅有8.5％，当灭菌浓度达到5％时间达到10分钟后，孢子发育也受到严重的影响，畸形率超过36.6％。
5个“+”表示，“0”表示无污染，孢子培养过程中的污染情况和萌发情况如表1，灭菌浓度越低，灭菌时间越少，污染越严重。灭菌浓度以及灭菌时间在10％和3分钟以上的培养均没有污染，但是与未灭菌的孢子89.5％的萌发率相比，当灭菌浓度达到5％时间达到7分钟后，孢子的萌发就开始受到影响，灭菌浓度为10％，灭菌时间达到10分钟时，孢子萌发受到的影响最严重，萌发率仅有8.5％，当灭菌浓度达到5％时间达到10分钟后，孢子发育也受到严重的影响，畸形率超过36.6％。
[0020] 表1不同浓度的次氯酸酸钠灭菌不同时间时，槲蕨孢子培养过程中的污染、萌发及发育情况
[0021]
[0022]
[0023] 实施例2槲蕨(Drynaria fortunei(Knuze)J.SM.)孢子的组织培养灭菌方法。
[0024] 在6个5ml离心管中分别装4mg左右槲蕨孢子，并用无菌水冲洗1遍后，分别用100、200、300、500、1000、2000ppm的纳米银溶液灭菌15-25分钟，最后经过无菌水冲洗3-4遍后，播种于无菌的1/2MS培养基里，密封后放于培养室培养。孢子培养过程中的污染情况和萌发情况如表2，各种灭菌浓度下，培养均有污染，灭菌浓度越低污染越严重，灭菌浓度在
1000ppm时，与对照未灭菌孢子的89.5％的萌发率相比，孢子的萌发受到的影响也较小，萌发率为85％，但是孢子的发育受到了较大的影响，畸形率达到28.8％，灭菌浓度达到
2000ppm时，孢子的萌发和发育都受到了较大的影响，萌发率为77.4％，畸形率为30.6％。
1000ppm时，与对照未灭菌孢子的89.5％的萌发率相比，孢子的萌发受到的影响也较小，萌发率为85％，但是孢子的发育受到了较大的影响，畸形率达到28.8％，灭菌浓度达到
2000ppm时，孢子的萌发和发育都受到了较大的影响，萌发率为77.4％，畸形率为30.6％。
[0025] 表2不同浓度的纳米银溶液灭菌时，槲蕨孢子培养过程中的污染、萌发及发育情况[0026]纳米银浓度/mgl-1 0 100 200 300 500 1000 2000
污染程度 +++++ +++++ +++++ ++++ +++ ++ ++
萌发率 89.5％ 89.4％ 90.4％ 89％ 89.2％ 85％ 77.4％
畸形率 13.6％ 17.4％ 17％ 19％ 28.8％ 30.6％
污染程度 +++++ +++++ +++++ ++++ +++ ++ ++
萌发率 89.5％ 89.4％ 90.4％ 89％ 89.2％ 85％ 77.4％
畸形率 13.6％ 17.4％ 17％ 19％ 28.8％ 30.6％
[0027] 实施例3槲蕨(Drynaria fortunei(Knuze)J.SM.)孢子的组织培养灭菌方法。
[0028] 在6个5ml离心管中分别装4mg左右槲蕨孢子，并用无菌水冲洗1遍后，先用5％次氯酸钠溶液灭菌5分钟再分别用100-2000ppm的纳米银溶液灭菌15-25分钟，最后经过无菌水冲洗3-4遍后，播种于无菌的1/2MS培养基里，密封后放于培养室培养。孢子培养过程中的污染情况和萌发情况如表3，纳米银溶液浓度低于500ppm时，培养均有污染，灭菌浓度越低污染越严重，纳米银溶液浓度在500ppm及以上时，培养没有污染。仅用次氯酸钠灭菌的孢子萌发率为86.8％，畸形率为21％，添加纳米银溶液后，孢子的萌发和发育均受到了显著的影响，纳米银溶液浓度越高，影响越严重，纳米银溶液浓度为100ppm时，孢子萌发受到的影响最小，萌发率为34.4％，畸形率为42.2％，纳米银溶液浓度为2000ppm时，孢子萌发受到的影响最严重，萌发率为13.4％，畸形率为46.8％。
[0029] 表3先用5％次氯酸钠灭菌5分钟，再用不同浓度纳米银溶液灭菌15-25分钟时，槲蕨孢子培养过程中的污染、萌发及发育情况
[0030]
[0031] 实施例4蕨(Drynaria fortunei(Knuze)J.SM.)孢子的组织培养灭菌方法。
[0032] 在6个5ml离心管中分别装4mg左右槲蕨孢子，并用无菌水冲洗1遍后，分别先用100-2000ppm的纳米银溶液灭菌15-25分钟，再用5％次氯酸钠溶液灭菌5-6分钟，最后经过无菌水冲洗3-4遍后，播种于无菌的1/2MS培养基里，密封后放于培养室培养。孢子培养过程中的污染情况和萌发情况如表4，纳米银溶液浓度低于500ppm时，培养均有污染，灭菌浓度越低污染越严重，纳米银溶液浓度在500ppm及以上时，培养无污染，仅用次氯酸钠灭菌时，孢子的萌发率为的86.8％，畸形率为21％，纳米银溶液浓度为500ppm时，孢子的萌发和发育未受明显影响，萌发率为84.6％，畸形率为17％，而且培养过程中没有出现污染，纳米银溶液达到1000ppm及以上时，孢子的萌发和发育均受到严重的影响，纳米银溶液浓度为
1000ppm和2000ppm时，萌发率分别仅有46.6％和46.8％，畸形率分别为28％和34.2％。
1000ppm和2000ppm时，萌发率分别仅有46.6％和46.8％，畸形率分别为28％和34.2％。
[0033] 表4先用不同浓度纳米银溶液灭菌15-25分钟，再用5％次氯酸钠灭菌5-6分钟时，槲蕨孢子培养过程中的污染、萌发和发育情况
[0034]
[0035] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。