一种水稻花药特异表达启动子OsAnth1

摘要

本发明提供一种花药特异表达启动子OsAnth1及其应用。本发明分离到一个可在植物花药中特异性表达的启动子。所述的启动子可指导目的基因在植物花药中特异性高表达，而在植物的其它组织中低表达或不表达。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体，以及利用该启动子获得相应宿主菌和转化子的方法。此外，本发明将其应用于植物基因工程中。该启动子对于水稻花药相关的研究具有重要的理论及实际意义。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。

权利要求

1.一种水稻花药特异性强表达启动子OsAnth1，其特征在于，所述水稻花药特异性强表达启动子由序列表中SEQID NO:1所示的DNA分子构成。

2.如权利要求1所述的水稻花药特异表达启动子OsAnth1，其特征在于，所述水稻花药特异表达启动子OsAnth1从水稻属植物中分离获得。

3.一组扩增权利要求1或2所述的水稻花药特异性强表达启动子OsAnth1的全部或其任意片段的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所述，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.含有权利要求1所述水稻花药特异性强表达启动子的重组载体或表达盒，在所述重组载体或表达盒中，权利要求1所述的水稻花药特异表达启动子OsAnth1连接于待表达基因的上游，所述待表达基因包括具有改变水稻花药性状能力的基因。

5.一种利用权利要求1中所述的水稻花药特异表达启动子OsAnth1获得相应转化子的方法，其特征在于，所述方法包括将所述水稻花药特异性强表达启动子转入第一菌种中，利用转入了所述水稻花药特异表达启动子OsAnth1的第一菌种和植物载体构建植物表达载体，再将所述植物表达载体转入到受体菌中，并利用所述受体菌获得转基因植物细胞、组织或植株。

6.一种根据权利要求1所述的水稻花药特异表达启动子OsAnth1在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将根据权利要求1中任意一项所述的水稻花药特异表达的启动子OsAnth1连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物生长特性，所述植物为水稻。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物花药的生长特性。

说明书

一种水稻花药特异表达启动子OsAnth1

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻花药特异表达启动子OsAnth1及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中驱动目标基因在水稻花药中特异表达。

背景技术

[0002] 外源DNA序列通过连接到特定的启动子从而启动在植物宿主中的表达，启动子类型的选择决定基因的表达时间和部位。植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调。启动子是重要的顺式作用元件，是位于结构基因5’端上游区域调控基因转录的一段DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合，确保转录精确而有效地起始，在转录调控中起关键作用。根据其驱动基因表达的不同特点，启动子分为组成型启动子和特异性启动子。组成型启动子能在所有细胞或组织中，不分时间和空间地启动转录。

[0003] 目前在农业生物技术领域广泛应用的主要是一些组成型启动子，比如CaMV35S启动子和玉米Ubiquitin-1启动子，然而在利用这些启动子诱导目的基因转化水稻等作物以期改良作物的品质时，往往会由于目的基因表达的时间(发育阶段特异性)或空间(组织器官特异性)不能很好地控制而导致改良效果不明显，或者由于这些组成型启动子诱导基因表达量太高而对植物的生长发育造成影响，这些都是目前利用组成型强启动子结合功能基因来改良作物品质时遇到的障碍。

[0004] 特异性启动子可以在特定的条件、部位或者时段集中表达。特异性启动子又可分为组织特异型启动子和诱导型启动子，其中诱导型启动子平时不启动转录或转录活性很低，但在某些特定的逆境信号的刺激下，转录活性能够显著地提高。

[0005] 随着转基因农作物在全球的大面积推广，启动子在转基因中的重要性得到广泛的共识。水稻花药是水稻雄性配子花粉产生的器官，与水稻穗的发育、育种及水稻的产量等密切相关。因此在水稻组织特异启动子的研究领域中，花药特异性启动子是人们最为关注的启动子之一。

[0006] 但是目前人们所发现的花药特异性启动子的遗传资源并不是十分丰富，限制了人们对花药性状改良能力的提升。

[0007] 因此，本发明希望分离到一种水稻花药特异性表达的启动子，以用于驱动在花药中特异性表达一些功能基因或结构基因，达到品种改良的目的。

发明内容

[0008] 针对上述问题，本发明的目的是提供一种驱动外源基因在水稻花药中特异性表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。

[0009] 具体而言，本发明提供一种花药特异性强表达启动子，所述水稻花药强表达启动子包含：

[0010] 1)序列表中SEQID NO:1所示的DNA分子；或者

[0011] 2)在严格条件下与SEQID NO:1中的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或者

[0012] 3)与1)或2)中所限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且具有启动子功能的DNA分子。

[0013] 优选地，本发明提供的水稻花药特异性强表达启动子由SEQ ID No:1所示的序列构成。

[0014] 序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的花药特异性强表达启动子，本文中称为OsAnth1或启动子OsAnth1。具体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)基因上游包括转录起始位点在内的1753bp的DNA序列，具有驱动目标基因水稻花药中特异性表达的功能，并且分离克隆、并鉴定了该DNA序列的功能。

[0015] 另一方面，本发明还提供一组扩增权利要求1或2所述的水稻花药特异性强表达启动子的全部或其任意片段的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所述，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

[0016] 另一方面，本发明还提供含有权利要求1所述水稻花药特异性强表达启动子的重组载体或表达盒，在所述重组载体或表达盒中，权利要求1所述的水稻花药特异性强表达启动子连接于待表达基因的上游，所述待表达基因包括具有改变水稻花药性状能力的基因。

[0017] 又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的水稻花药特异性强表达启动子，在所述重组表达载体中，所述水稻花药特异性强表达启动子连接于待表达的基因序列的上游。在一种实现方式中，所述待表达的基因为Gus基因。该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即OsAnth1或启动子OsAnth1构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-OsAnth1。或者待表达基因可以为任何对水稻花药具有改善功能的基因。

[0018] 另一方面，本发明还提供一种利用该启动子获得宿主菌的方法。所述宿主菌为将本发明提供的上述水稻花药特异性强表达启动子、上述表达盒、或上述重组表达载体转入根癌农杆菌而获得。

[0019] 另一方面，本发明提供一种利用该启动子获得转化子的方法。所述转化子为将本发明提供的上述水稻花药特异性强表达启动子、上述表达盒、上述重组表达载体、或上述宿主菌转入转基因细胞系、愈伤组织或植株而获得。

[0020] 再一方面，本发明提供上述水稻花药特异性强表达启动子在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻花药特异性强表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

[0021] 并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，尤其是水稻的花药生长特性。所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。

[0022] 需 要说 明 的是 ，本 发明 所 提供 的 启 动子 序 列中 ，序 列开 头的“AAAATCCACCCATTGCCTCCAG”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾的序列“TCCTCCTCCGTCGTTCGCGTGC”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的是，即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。

[0023] 综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)OsAnth1基因上游包括转录起始位点在内的1753bp的DNA序列，并将其命名为启动子OsAnth1。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行Gus组织化学染色检测发现，转基因植株的花药部位Gus基因显著表达，而其他部位如根茎叶等中均没有明显的GUS活性，从而证明该1753bp的序列具有驱动基因在花药部位特异性表达的活性。

[0024] 本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在水稻的花药部位特异性的驱动靶标基因的表达，增加转基因的效果，避免不必要部位表达带来的物质能量浪费，有效改良水稻的特性。

[0025] 技术效果

[0026] 本发明所克隆的水稻启动子OsAnth1能够调控基因在水稻花药中特异性集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造改善植物花药的生长特性，如通过该启动子驱动目标基因在植株中表达，例如，可以增强花药发育过程中对环境的抵抗力，比如耐寒性、耐热性等等，从而培育出理想的转基因植物品种。

附图说明

[0027] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

[0028] 图1为将OsAnth1启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-OsAnth1示意图，其中示出了利用OsAnth1启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；

[0029] 图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；

[0030] 图3为12周苗龄的OsAnth1::GUS转基因植株组织染色图(标尺＝5mm)。

具体实施方式

[0031] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

[0032] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

[0033] 含有酶切位点的OsAnth1启动子的获得

[0034] 步骤1、引物的设计

[0035] 根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻OsAnth1基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

[0036] 本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带HindIII，酶切位点(AAGCTT)，反向引物(SEQ ID No:3)5’端带EcoRI，酶切位点(GAATTC)，引物序列如下：

[0037] 正向引物：AAGCTTAAAATCCACCCATTGCCTCCAG HindIII

[0038] 反向引物：GAATTCGCACGCGAACGACGGAGGAGGA EcoRI

[0039] 由深圳华大基因公司合成。

[0040] 步骤2、启动子OsAnth1的获得

[0041] 以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子OsAnth1，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环35次；最后72℃延伸10min。

[0042] 回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1753bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照冷激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用HindIII和EcoRI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送并Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子OsAnth1，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

[0043] 植物表达载体的构建和农杆菌的转化

[0044] 从上面“启动子OsAnth1的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII和EcoRI酶切，回收启动子OsAnth1片段。同时利用HindIII和EcoRI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的OsAnth1片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子OsAnth1与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-OsAnth1，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。

[0045] 利用启动子OsAnth1驱动Gus报告基因在水稻中表达

[0046] 步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

[0047] 成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗3-6遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养10-12天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌的转化。

[0048] 采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得OsAnth1::gus转基因水稻植株，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan,Chenguang Zhai,et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phOsphomannOse isomerase pOsitive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report,2012.DOI10.1007/s00299-01201275-3.)等提出的方法。

[0049] 步骤2、转基因水稻苗的组织器官染色

[0050] 将转化了OsAnth1启动子的转基因水稻的组织器官，即根、茎、叶、花器官分别进行GUS染色：将各组织分别浸于GUS染色液中，37℃，过夜24小时，75％乙醇脱色，将组织中的叶绿素脱掉。然后在解剖显微镜下观察并记录GUS染色的结果。结果如图3所示，GUS基因只在转基因水稻幼穗的花药中有强表达，显现出肉眼可明显观测到的很强的蓝色；而在其它各器官(根、茎和叶片)中，基本没有检测到GUS基因的表达。这表明，本发明的启动子能够在转基因植株的花药中指导其下游的GUS蛋白表达，这种表达具有花药组织表达特异性。

[0051] 虽然本发明以水稻为例进行描述，但是申请人认为，本发明所获得启动子的应用场景不限于水稻，本发明启动子可以用于各种单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。

[0052] 以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。