一种具有水稻子房特异性的DNA片段

摘要

本发明公开一种DNA片段，所述DNA片段包含：1)、序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA序列；或者2)在严格条件下与1)、中所述的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或者3)、与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且具有启动子功能的DNA片段。该DNA片段可以用作子房特异表达启动子。本发明还提供了含有该DNA片段的表达盒、植物表达载体并将其应用于植物基因工程中。该DNA片段对于水稻生殖发育的研究具有重要的理论及实际意义。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。

权利要求

1.一种DNA片段，其特征在于，所述DNA片段由序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA序列构成，所述DNA片段用作子房特异启动子，SEQ ID NO：1中所示序列为:

2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段提取自日本晴水稻。

3.一组用于扩增权利要求1所述的DNA片段的全长或其任意片段的引物对，其特征在于，所述引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的DNA序列包含片段：TCCACAGGATTCACAATAACGT；所述第二引物的DNA序列包含片段：CACCGAGTATGGTAGAGGCAAT。

4.一种含有权利要求1所述的DNA片段的重组载体，其特征在于，所述重组表达载体为在植物表达载体的多克隆位点插入权利要求1所述的DNA片段得到的重组质粒，在所述重组表达载体中，所述DNA片段连接于载体中待表达的基因序列的上游。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述待表达基因为对子房部位性状具有改善功能的基因。

6.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1中所述的DNA片段。

7.一种根据权利要求1中任意一项所述的DNA片段在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将根据权利要求1中所述的DNA片段连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物生长特性，所述植物为水稻。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述待表达基因为对子房部位有特定功能的基因。

说明书

一种具有水稻子房特异性的DNA片段

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及能够在水稻转基因调控体系中特异性的驱动目标基因的表达的一段DNA片段。

背景技术

[0002] 人类通过对自然突变基因和重组体的选择与利用，对作物的品种进行改良已有近千年的历史。近百年来，通常采用人工杂交的方法，实现优良基因的重组和外源基因的导入培育作物新品种。杂交育种技术能够实现种内基因转移，但是，亲缘关系较远的品种之间的基因转移则存在障碍；另一方面，杂交育种技术不能准确选择和操纵某个基因。因此，增加了育种结果的复杂性。

[0003] 通过转基因的手段进行作物品种的选育，其优势在于转基因不受生物体间亲缘关系的限制，从转基因的技术角度来讲，候选转化的基因来源几乎不受限制。此外，转基因技术所操作和转移的基因是功能明确、控制目标性状的基因，这使得转基因后代的表型更具有可预见性。目前转基因技术已经成为作物品种改良的重要手段，转基因大豆、玉米、棉花和油菜的种植面积已达4种作物全球总种植面积的25％。

[0004] 在植物的转基因中需要两个必需的元件，即启动子和目的基因。启动子是位于基因转录起始位点上游的顺式调控元件，与反式作用因子结合，通过识别因子与RNA聚合酶的相互作用，启动基因的转录；因此，启动子调控基因的表达模式，即目的基因表达的时空特异性及表达强度，是转基因成败或成效高低的关键因素之一。

[0005] 针对转基因的目的不同，转化的基因选择不同的表达模式，主要包括组成型高表达、组织特异性表达及诱导型表达等。如在棉花、玉米、水稻等农作物中转入苏云金芽孢杆菌的抗虫蛋白采用的是组成型高表达方式，在作物中高剂量表达Bt抗虫蛋白的优势在于高剂量可以确保杀虫的效果，同时有利于延长Bt抗虫蛋白的有效期。在金稻谷的创制过程中，其目标是通过在水稻胚乳中引入了维生素A前体的合成途径，从而在稻米中强化维生素A，解决维生素A营养缺乏的问题；因此，转基因时采用的启动子为在水稻胚乳中特异表达的谷蛋白启动子。在植物抗病基因的转化中，常采用病原菌诱导表达的启动子。

[0006] 水稻是单子叶植物禾谷类的代表植物，不同于双子叶植物，且具有单子叶植物的多项优势，是研究花发育的理想材料，但水稻花发育机制的研究却远远落后于双子叶植物。

发明内容

[0007] 因此，针对上述问题，本发明针对水稻花发育机制进行了仔细研究。并且在研究过程，侧重于水稻子房中相关基因的表达，获得一个DNA片段，其具有子房表达特异性，可以用于驱动在子房中特异性表达的一些功能基因或结构基因，这对于水稻穗的品质改良及水稻的产量的提高具有重要的意义。

[0008] 本发明的还获得了获得含有上述DNA片段的表达盒和重组载体，并且本发明还利用该DNA片段获得了相应的转基因植物。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。

[0009] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种DNA片段，所述DNA片段包含：

[0010] 1)序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA序列；或者

[0011] 2)在严格条件下与1)中所述的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或者[0012] 3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且具有启动子功能的DNA分子。

[0013] 2)和3)中的序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同的功能，即驱动目标基因在植物中表达，其中，

[0014] SEQ ID NO：1中所示序列为:

[0015]

[0016]

[0017] 需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头的序列“tccacaggat tcacaataac gt”共计22bp为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列；序列末尾的序列“at tgcctctacc atactcggtg”共计22bp为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的是，即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。

[0018] 优选地，本发明所述DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列。

[0019] 优选地，序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列用作水稻子房特异表达启动子。

[0020] 序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列可以提取自水稻属植物，优选为日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)，本文中称为OsOva1或启动子OsOva1。具体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)基因上游包括转录起始位点在内的1970bp的DNA序列，具有驱动目标基因在水稻子房中特异性表达的功能，并且分离克隆、并鉴定了该DNA序列的功能。但是，需要说明的，后续人们根据本发明公开内容而人工合成的相同序列也包含在本发明的范围内。

[0021] 另一方面，本发明还提供一种包含上述水稻子房特异性强表达启动子的表达盒。

[0022] 另一方面，本发明还提供一组用于扩增权利要求1所述的DNA片段的全长或其任意片段的引物对，其特征在于，所述引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的DNA序列包含片段：TCCACAGGATTCACAATAACGT；所述第二引物的DNA序列包含片段：ATTGCCTCTACCATACTCGGTG。

[0023] 又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体为在植物表达载体pCAMBIA1391的多克隆位点插入所述DNA片段得到的重组质粒，在所述重组表达载体中，所述水稻子房特异表达启动子OsOva1连接于载体中待表达的基因序列的上游；优选的，所述待表达的基因为对水稻子房有改善功能的基因。通过本发明的启动子驱动基因在子房中特异性表达，从而达到改良作物性状的作用。

[0024] 再一方面，本发明提供上述水稻子房特异性强表达启动子在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻子房特异性强表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

[0025] 综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)OsOva1基因上游包括转录起始位点在内的1970bp的DNA序列，并将其命名为启动子OsOva1。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行Gus组织化学染色检测发现，转基因植株仅在子房部位有Gus表达，从而证明该1970bp的序列具有驱动基因在子房部位特异性表达的活性。

[0026] 本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在水稻的子房部位特异性的驱动靶标基因的表达，增加转基因的效果，改良水稻的特性。

[0027] 技术效果

[0028] 本发明所克隆的水稻启动子OsOva1能够调控基因在水稻子房中特异性集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子驱动目标基因在植株中表达，可以提高和改善水稻的生殖特性，从而培育出理想的转基因植物品种。

附图说明

[0029] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

[0030] 图1为将OsOva1启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-OsOva1示意图，其中示出了利用OsOva1启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；

[0031] 图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；

[0032] 图3为12周苗龄的OsOva1::GUS转基因植株组织染色图。(标尺＝5mm)。在根、茎、叶、鞘组织中均没有观察到代表GUS活性的蓝色，而在花中，仅有位于雌蕊基部的子房中有蓝色出现，而颖壳、雄蕊中也都没有表现出GUS活性。

具体实施方式

[0033] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

[0034] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

[0035] 含有酶切位点的OsOva1启动子的获得

[0036] 步骤1、引物的设计

[0037] 根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻OsOva1基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

[0038] 本实验例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带HindIII，酶切位点(AAGCTT)，反向引物(SEQ ID No:3)5’端带EcoRI，酶切位点(GAATTC)，引物序列如下：

[0039] 正向引物：AAGCTTTCCACAGGATTCACAATAACGT HindIII

[0040] 反向引物：GAATTCCACCGAGTATGGTAGAGGCAAT EcoRI

[0041] 由深圳华大基因公司合成。

[0042] 步骤2、启动子OsOva1的获得

[0043] 以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子OsOva1，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

[0044] 95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环35次；最后72℃延伸10min。

[0045] 回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1970bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照冷激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用HindIII和EcoRI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送并Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子OsOva1，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

[0046] 植物表达载体的构建和农杆菌的转化

[0047] 从上面“启动子OsOva1的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII和EcoRI酶切，回收启动子OsOva1片段。同时利用HindIII和EcoRI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的OsOva1片段和pCAMBIA1391片段(pCAMBIA1391中含有Gus基因)用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子OsOva1与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-OsOva1，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。

[0048] 利用启动子OsOva1驱动Gus报告基因在水稻中表达

[0049] 步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

[0050] 将成熟水稻种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌的转化。

[0051] 采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得OsOva1::GUS转基因水稻植株，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan,Chenguang Zhai,et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phOsphomannOse isomerase pOsitive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report,2012.DOI10.1007/s00299-01201275-3.)等提出的方法。

[0052] 步骤2、转基因水稻苗的组织器官染色

[0053] 将转化OsOva1启动子的转基因水稻的组织器官，即根、茎、叶、花器官分别进行GUS染色：将各组织分别浸于GUS染色液中，37℃，过夜24小时，75％乙醇脱色，将组织中的叶绿素脱掉。然后在解剖显微镜下观察并记录GUS染色的结果。结果如图3所示，GUS基因只在转基因水稻幼穗的子房被染色成肉眼可明显观测到的很强的蓝色；而在其它各器官如根、茎、叶片、叶鞘以及雌蕊的花柱和柱头中，基本没有检测到GUS基因的表达。这表明，本发明的启动子能够在转基因植株的子房中特异性地指导其下游的GUS蛋白表达，这种表达具有子房组织表达特异性。

[0054] 以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。