一种可降解林可霉素的小麦苍白杆菌

摘要

本发明公开了一种可降解林可霉素的小麦苍白杆菌，该小麦苍白杆菌以保藏编号CGMCC No. 10665保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明的可降解林可霉素的小麦苍白杆菌菌株，可以利用林可霉素为唯一碳源生长，该菌株对林可霉素的降解能力在24小时以内可达到100%。可将该菌株用于林可霉素工业生产中发酵菌渣的无害化处理，该处理方法高效，绿色环保，节约资源，处理成本低，彻底消除了林可霉素废菌丝对环境的不利影响。

权利要求

1.一种可降解林可霉素的小麦苍白杆菌，其特征在于，该小麦苍白杆菌（Ochrobactrum tritici）以保藏编号CGMCC No. 10665保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.根据权利要求1所述的可降解林可霉素的小麦苍白杆菌，其特征在于，所述小麦苍白杆菌在富集培养基上形成的菌落特征为：圆形，淡黄色，粘稠，表面光滑，边缘整齐，直径为0.5-0.7mm；

菌体特征为：革兰氏阴性，菌体短杆状，大小为0.4 µm×0.6-1.5 µm，成对或成堆排列。

3.根据权利要求1所述的可降解林可霉素的小麦苍白杆菌，其特征在于，所述小麦苍白杆菌的氧化酶、脲酶阳性；鸟氨酸、精氨酸脱羧酶阴性；蜜二糖、阿拉伯糖发酵阴性。

4.根据权利要求1所述的可降解林可霉素的小麦苍白杆菌，其特征在于，所述小麦苍白杆菌可以林可霉素为唯一碳源生长。

5.根据权利要求1所述的小麦苍白杆菌，其特征在于，所述的小麦苍白杆菌16S rDNA的全部碱基序列如SEQUENCE LISTING所示。

6.一种可降解林可霉素的细胞级分，其特征在于，

其通过权利要求1至权利要求5中任一项所述的小麦苍白杆菌获得。

说明书

一种可降解林可霉素的小麦苍白杆菌

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种可降解林可霉素的小麦苍白杆菌。

背景技术

[0002] 林可霉素(lincomycin)是一种由林肯链霉菌产生的碱性广谱抗生素，其广泛用于治疗由革兰氏阳性菌引发的炎症。

[0003] 目前工业上林可霉素的生产主要是用淀粉、玉米浆、豆饼粉等为培养基，经链霉菌发酵、萃取、纯化而成。该发酵液经预处理进行固液分离后形成的副产物菌丝部分即为生产废渣，该生产废渣中含有林可霉素残留以及粗蛋白、纤维素和粗脂肪等。由于废渣中残留林可霉素的理化性质稳定，具有长期的残留性、生物蓄积性，其进入生物链后容易引起生物耐药性等各种安全隐患。根据目前国际及国内法律法规规定，菌渣只能按照危险废物标准进行焚烧，这样不但会对环境造成一定程度的破坏，同时会造成粮食资源的浪费以及相关企业生产成本的提高。国内每年产生的林可霉素菌渣能达到15000吨以上，废渣(湿菌体)中林可霉素残留含量约为0.2-0.5g/kg。

[0004] 而现有技术中没有对菌渣中残留的林可霉素进行无害化处理的方法，因此，如何利用绿色环保的手段对菌渣中残留林可霉素进行适当无害化处理并进行有效利用，成为相关行业的技术难题。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种可降解林可霉素的小麦苍白杆菌，其具有高效降解林可霉素的能力，可对林可霉素的发酵菌株进行无害化处理，具有绿色环保，节约能源，成本低的优点。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供一种可降解林可霉素的小麦苍白杆菌，该小麦苍白杆菌以保藏编号CGMCC No.10665保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

[0007] 本发明的一个实施例中，所述小麦苍白杆菌在富集培养基上形成的菌落特征为：圆形，淡黄色，粘稠，表面光滑，边缘整齐，直径为0.5-0.7mm；

[0008] 菌体特征为：革兰氏阴性，菌体短杆状，大小约为0.4μm×0.6-1.5μm，成对或成堆排列。

[0009] 本发明的一个实施例中，所述小麦苍白杆菌的氧化酶、脲酶阳性；鸟氨酸、精氨酸脱羧酶阴性；蜜二糖、阿拉伯糖发酵阴性。

[0010] 本发明的一个实施例中，所述小麦苍白杆菌可以林可霉素为唯一碳源生长。

[0011] 本发明提供一种可降解林可霉素的小麦苍白杆菌，其通过诱变或遗传转化上述所述的小麦苍白杆菌得到。

[0012] 本发明的一个实施例中，所述的小麦苍白杆菌16S rDNA的全部碱基序列如SEQUENCE LISTING所示。

[0013] 本发明还提供一种可降解林可霉素的细胞级分，其通过上述所述的小麦苍白杆菌获得。

[0014] 本发明的有益效果为：

[0015] 本发明的可降解林可霉素的小麦苍白杆菌菌株，其可以利用林可霉素为唯一碳源生长，该菌株对林可霉素的降解能力在24小时以内可达到100％。可将该菌株用于林可霉素工业生产中发酵菌渣的无害化处理，该处理方法高效、绿色环保，节约资源，处理成本低，彻底消除了林可霉素废菌丝对环境的不利影响。

附图说明

[0016] 图1为本发明的可降解林可霉素的小麦苍白杆菌的菌体形态图。

具体实施方式

[0017] 本发明的小麦苍白杆菌菌株(Ochrobactrum tritici)，其为可高效降 解抗生素林可霉素的降解菌，该菌株编号为KDSP-J0105，该菌株于2015年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。其保藏号为CGMCC No.10665。本发明的小麦苍白杆菌(Ochrobactrum tritici)菌株，具有高效降解林可霉素的能力，能够对发酵工业产生的菌丝体中的林可霉素进行有效降解，以消除林可霉素废菌丝中抗生素残留，可用于林可霉素工业生产中发酵菌渣的无害化处理，为菌丝的无害化处理提供了有效的途径。

[0018] 其中，小麦苍白杆菌菌株通过诱变或遗传转化筛选得到的降解林可霉素突变菌株，该突变菌株至少保留了降解林可霉素的特性，其包括通过小麦苍白杆菌菌株的插入突变、整合突变等得到的突变体。其次，本发明通过小麦苍白杆菌菌株或者诱变、遗传转化的得到的可降解林可霉素的小麦苍白杆菌菌株的突变菌株得到的细胞级分。该细胞级分包括从上述菌株的培养物中得到的DNA制备物或者细菌壁制备物、上述菌株的得到的培养液，这些培养液的上清液以及该上清液的级分。该细胞级分具有降解林可霉素的作用。以及组合物包括小麦苍白杆菌菌株，可降解林可霉素的小麦苍白杆菌菌株的突变菌株以及它们的细胞分级的培养液。

[0019] 下面通过具体实施例，进一步说明本发明实现的详细过程。

[0020] 实施例1小麦苍白杆菌菌株的筛选。

[0021] 步骤一：从石家庄一抗生素企业周边采集污泥10g，接种到含有20mg林可霉素的100mL无机盐培养基中，于30℃，200rpm摇床震荡培养。培养开始后每7天转接一次，转接时以10％(V/V)的接种量转接到较高浓度的含林克霉素的培养基中，林克霉素的含药浓度依次为20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L、依次类推，至640mg/L，得到不同浓度的含有菌体的富集培养液。

[0022] 其中，本发明中的无机盐培养基的组成及配比为(g/L)：K2HPO4 1.6g，KH2PO4 0.4g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2·2H2O 0.025g，FeCl3·6H2O 0.0023，NH4NO3 0.5g，琼脂
18.0g，用1mol/L HCL或NaOH调节pH值至7.0，121℃高压灭菌30min。

[0023] 本发明中的富集培养基的组成及配比为(g/L)：蔗糖20.0g，琼脂18.0g，20％马铃薯浸出液1000mL，调pH值至7.0，121℃高压灭菌30min。

[0024] 步骤二：取0.1mL步骤一中含有细菌的富集培养液涂布到相应含药浓度的选择平板上，30℃，培养48小时。得到一株生长速度最快且菌落周围出现明显透明圈的菌株，将该菌株接种到含有20mg/L林可霉素的无机盐培养基上，菌落周围可出现清晰的透明圈，将该菌株编号为KDSP-J-0105。

[0025] 请配合参阅图1所示，该编号为KDSP-J-0105菌株的主要生物学特性为：该菌株在富集培养基上形成的菌落为圆形，淡黄色，粘稠，表面光滑，边缘整齐，直径为0.5-0.7mm；该菌株的菌体特征为：革兰氏阴性，菌体短杆状，大小约为0.4μm×0.6-1.5μm，成对或成堆排列。

[0026] 经过试验测定，该编号为KDSP-J-0105菌株的氧化酶、脲酶阳性，鸟氨酸、精氨酸脱羧酶阴性，蜜二糖、阿拉伯糖发酵阴性。

[0027] 步骤三：通过液相色谱法测定在无机盐培养基中，该菌株对林可霉素具有降解能8
力。培养液中菌体的含量为每毫升培养液中10 个，林可霉素的浓度为20mg/L，于30℃，
200rpm摇床震荡培养1天，经测定，林可霉素的降解率为100％。同时，该菌株与发酵菌渣共培养一周，采用液相色谱法测定，该菌株对林可霉素的降解率可达到100％。实验证明，降解溶液体系为无机盐培养基，KDSP-J-0105菌株在pH 7.0-8.0，温度30至40℃生长良好，能以林可霉素为唯一碳源生长，是一株很有潜力的降解菌。

[0028] 测定该菌株的16S rDNA的序列，将该测定的16S rDNA序列与Genebank登录号为KP341765的16S rDNA的基因序列进行同源性分析。首先，采用DNA小量提取方法提取KDSP-J-0105菌株的总DNA。采用16S rRNA通用引物27F-1492R扩增其16S rRNA基因序列，将扩增得到 的PCR产物直接进行测序(测序结果见序列表中SEQUENCE LISTING)，将获得的16S rRNA基因序列输入GeneBank，通过Blastn程序对数据库中的所有序列进行比较分析。本发明的菌株的KDSP-J-0105的16S rRNA基因序列与苍白杆菌属的已有模式菌株具有较高的相似性。其中与Ochrobacterum tritici SCII24T的序列相似性为99.93％。该菌株属于Ochrobactrum spp.，同时结合其生理生化特征，鉴定该菌株为O.Tritici，即小麦苍白杆菌菌株。

[0029] 实施例2本发明的小麦苍白杆菌菌株(Ochrobactrum tritici)的筛选及对林可霉素的降解作用。

[0030] 步骤一：取10g污泥盛于灭菌的250mL锥形瓶中，加入100mL浓度为2000mg/L的盐酸林可霉素溶液，于30℃转速为200r/min摇床培养。培养开始后，每7天转接一次，转接时以10％的接种量接种到新鲜的盐酸林可霉素溶液驯化培养基中，并逐步提高盐酸林可霉素的含量。检测盐酸林可霉素的降解率，挑选出最好的一组以便分离菌株所用。

[0031] 步骤二：将1mL中上述菌株的菌悬液(1×108个/mL)接入到100mL含20mg/L林可霉素的无机盐培养基中，取三次平行，并以不接种细菌但含相同浓度的林可霉素的无机盐培养基为对照。30℃，200rpm摇床培养，分别培养8、16、24、32小时，液相色谱法检测林可霉素的含量，实验结果见表一。培养24小时，所选菌株可将林可霉素几乎完全降解。将得到的菌株编号为KDSP-J-0105。

[0032] 表一KDSP-J-0105菌株在无机盐培养基中对林可霉素的降解率

[0033]

[0034]

[0035] 步骤三：测定编号为KDSP-J-0105的菌株的16S rDNA的序列，将测定的16S rDNA序列与Genebank登录号为KP341765的16S rDNA的基因序列进行同源性分析，认为KDSP-J-0105菌株属于Ochrobactrum spp.，同时结合其生理生化特征，鉴定该菌株为O.Tritici，即小麦苍白杆菌。

[0036] 实施例3：小麦苍白杆菌菌株对菌渣中林可霉素的降解作用。

[0037] 将林可霉素废湿菌丝过0.2mm筛子，置于121℃灭菌30min。称取10g灭菌后的废菌丝，并放入100mL水中，向废湿菌丝溶液中加入培养了48小时的小麦苍白杆菌菌体5g(干重)，设3组平行试验，以加菌丝但不加小麦苍白杆菌发酵培养液为对照，分别作用16、32、48、60小时取样，高效液相法检测林可霉素的残留量。结果表明，该菌株在培养48小时后，对林可霉素的降解率可达到100％。

[0038] 表二小麦苍白杆菌菌株对菌渣中林可霉素的降解效果

[0039]

[0040] 由上可知，本发明的小麦苍白杆菌菌株是一株能够高效降解林可霉素的菌株，其可以利用林可霉素为唯一碳源生长，该菌株对林可霉素的降解能力在24小时以内可达到100％。本发明利用小麦苍白杆菌菌株用于林可霉素工业生产中发酵菌渣的无害化处理，该处理方法高效、绿色环保，节约资源能源，成本低，本发明的小麦苍白杆菌菌株消除了林可 霉素废菌丝对环境不利影响。同时，本发明的小麦苍白杆菌菌株与降解相关的基因及关键酶在生物修复和净化及工业和生物医药领域具有广泛的作用。

[0041] 以上仅为本发明的较佳实施例，不得以此限定本发明实施的保护范围，因此凡参考本发明的说明书内容所作的简单等效变化与修饰，仍属本发明的保护范围。