本发明公开了一种直接从发酵液中固定化单宁酶的方法。该方法包括：（1）以塔宾曲霉为产酶菌株发酵铁观音茶梗获得游离粗单宁酶；（2）以亲水性超顺磁性纳米颗粒为游离单宁酶固定化载体；（3）采用直接固定化、戊二醛交联以及碳二亚胺共价结合三种方法将游离单宁酶固定在纳米颗粒上获得流体状固定化单宁酶；（4）真空冷冻干燥流体状固定化单宁酶获得粉末状固定化单宁酶。本方法直接从发酵粗酶液中固定化单宁酶，简单、快速的制备了磁性纳米固定化单宁酶。该固定化单宁酶具有良好的酶活力、存储稳定性、重复利用性以及磁操纵性能。
1.一种直接从发酵粗酶液中固定化单宁酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、产单宁酶菌株种子制备：将塔宾曲霉菌种活化，扩大培养获得发酵种子液；
步骤二、单宁酶发酵培养基制备及单宁酶发酵：固体发酵基质中添加蔗糖、葡萄糖、硫酸铵和酵母浸膏作为外加碳氮源，润湿、搅拌均匀后高压蒸汽灭菌，冷却至室温接种塔宾曲霉种子液，搅拌均匀后恒温静置固态发酵获得单宁酶；
步骤三、游离酶制备：发酵结束后，发酵物中加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液浸提培养基中单宁酶，减压真空过滤混合液收集滤过液获得游离单宁酶；
步骤四、酶固定化载体制备：以FeCl3和FeCl2为原料，加热搅拌条件下加入浓氨水采用共沉淀法获得Fe3O4磁性纳米粒子，再经油酸反应包裹磁性纳米粒子表面获得亲油性、具有活性基团的纳米粒子，高锰酸钾改性油酸包裹的纳米粒子表面活性基团，搅拌加热使制备得到的流体状磁性纳米粒子后，磁分离后经真空冷冻干燥后获得粉末状、具有亲水性、表面
羧基功能化的磁纳米载体；混合液中的Fe 和Fe 的摩尔量比约为1:2、加热温度70℃、搅拌速度750rpm，浓氨水添加量为总体积的1/10，油酸滴加量为总反应体积的1/30，后熟温度80℃、搅拌速度600rpm、时间2h；高锰酸钾溶液浓度为10mg/mL，超声振荡时间为3h，-80℃真空冷冻干燥时间为48h；
步骤五、单宁酶固定化及固定化酶制备：超声均匀分散磁性纳米载体于磷酸盐缓冲溶液中，将游离单宁酶与分散均匀的磁性纳米载体混合均匀进行直接固定化、戊二醛交联固定化或碳二亚胺共价结合固定化游离单宁酶；磁分离固定化酶，纯水洗涤数次至洗涤液呈中性，真空冷冻干燥流体状单宁酶获得干粉状固定化单宁酶。
2.如权利要求1所述的一种直接从发酵粗酶液中固定化单宁酶的方法，其特征在于：所述步骤一中产单宁酶菌株为Aspergillus tubingensis CICC 2651，斜面菌种转接于PDA斜面活化培养96h，0.8％无菌吐温-80溶液洗涤斜面孢子，制备浓度为1.5×107个/mL的孢子悬液，接种孢子悬液5mL于250mL摇瓶中，摇瓶中培养基为PD，即PDA去除琼脂，装量为100mL，每瓶加5粒直径0.5cm的玻璃珠，28℃培养72h获得塔宾曲霉发酵种子液。
3.如权利要求1所述的一种直接从发酵粗酶液中固定化单宁酶的方法，其特征在于：所述步骤二中固体发酵基质为干燥的铁观音茶梗粉末过40目筛下物，蔗糖添加量为9％、葡萄糖添加量3％、硫酸铵添加量6％，酵母浸膏添加量0.5％，固水比按质量体积比为1:2，灭菌温度和时间分别为121℃和15min；接种量为每克培养基接种0.5mL发酵种子液，培养温度为
4.如权利要求1所述的一种直接从发酵粗酶液中固定化单宁酶的方法，其特征在于：所述步骤三中，发酵物中加入的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH为5.0，固液比按质量体积比为
1:5-20，浸提温度20-30℃、摇床转速0-250rpm、浸提时间10-60min，混合液过滤方式为真空减压过滤。
5.如权利要求4所述的一种直接从发酵粗酶液中固定化单宁酶的方法，其特征在于：所述步骤三中，固体发酵物与浸提液比例优选1:10，浸提温度优选25℃，摇床转速优选
6.如权利要求1所述的一种直接从发酵粗酶液中固定化单宁酶的方法，其特征在于：所述步骤五中，直接固定化的步骤为：取亲水性超顺磁性纳米载体1g置于反应瓶中，加入
100mLpH为7.0的磷酸盐缓冲液，超声5min使得载体分散均匀；加入150mL游离单宁酶，30℃、
180rpm固定化24h；永磁铁磁分离固定化酶，蒸馏水洗涤流体状固定化酶直至洗涤液呈中性；-80℃真空冷冻干燥48h；获得粉末状具有超顺磁性的单宁酶固定化纳米载体。
7.如权利要求1所述的一种直接从发酵粗酶液中固定化单宁酶的方法，其特征在于：所述步骤五中，戊二醛交联固定化的步骤为：取亲水性超顺磁性纳米载体1g置于反应瓶中，加入100mLpH为7.0的磷酸盐缓冲液，超声5min使得载体分散均匀；加入150mL游离单宁酶、
25mL质量体积浓度为25％的戊二醛，30℃、180rpm固定化24h；永磁铁磁分离固定化酶，蒸馏水洗涤流体状固定化酶直至洗涤液呈中性；-80℃真空冷冻干燥48h；获得粉末状具有超顺磁性的单宁酶固定化纳米载体。
8.如权利要求1所述的一种直接从发酵粗酶液中固定化单宁酶的方法，其特征在于：所述步骤五中，碳二亚胺共价结合固定化的步骤为：取亲水性超顺磁性纳米载体1g置于反应瓶中，加入100mLpH为7.0的磷酸盐缓冲液，超声5min使得载体分散均匀；加入150mL游离单宁酶、13.8mL浓度为0.1m mol/L的碳二亚胺/羟基琥珀酰亚胺，30℃、180rpm固定化24h；永磁铁磁分离固定化酶，蒸馏水洗涤流体状固定化酶直至洗涤液呈中性；-80℃真空冷冻干燥
48h；获得粉末状具有超顺磁性的单宁酶固定化纳米载体。
一种直接从发酵液中固定化单宁酶的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物发酵以及酶固定化技术领域，尤其涉及一种直接从发酵粗酶液中固定化单宁酶的方法。
背景技术
[0002] 单宁酶在食品、医药、饲料，尤其是在茶饮料行业有着极为重要的应用价值。目前，单宁酶主要通过微生物发酵获得粗酶液，再经一系列的分离纯化操作获得一定纯度的单宁酶。单宁酶的纯化是一个复杂且昂贵的过程，这也是致使单宁酶成本居高不下的关键原因，并最终限制了单宁酶在工业中的规模化应用。
[0003] 酶固定化技术是一种通过吸附、交联、共价结合或包埋等方法将游离酶固定在特定载体上的技术，可显著提高酶的稳定性和重复利用率，从而降低酶的使用成本。将单宁酶进行固定化将有助于解决单宁酶使用成本过高的难题，有助于实现其在工业生产中的规模化应用。
[0004] 有鉴于此，本发明人研究和设计了一种直接从发酵粗酶液中固定化单宁酶的方法，本方案由此产生。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种直接从发酵液中固定化单宁酶的方法，简易、快速、低成本制备具有可重复利用、可磁操纵的磁性纳米固定化单宁酶。
[0006] 本发明的目的通过如下技术方案实现：
[0007] 一种直接从发酵粗酶液中固定化单宁酶的方法，包括以下步骤：
[0008] 步骤一、产单宁酶菌株种子制备：将塔宾曲霉菌种活化，扩大培养获得发酵种子液；
[0009] 步骤二、单宁酶发酵培养基制备及单宁酶发酵：固体发酵基质中添加蔗糖、葡萄糖、硫酸铵和酵母浸膏作为外加碳氮源，润湿后搅拌均匀后高压蒸汽灭菌，冷却至室温接种塔宾曲霉种子液，搅拌均匀后恒温静置固态发酵获得单宁酶；
[0010] 步骤三、游离酶制备：发酵结束后，发酵物中加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液浸提培养基中单宁酶，减压真空过滤混合液收集滤过液获得游离单宁酶；
[0011] 步骤四、酶固定化载体制备：以FeCl3和FeCl2为原料，加热搅拌条件下加入浓氨水采用共沉淀法获得Fe3O4磁性纳米粒子，再经油酸反应包裹磁性纳米粒子表面获得亲油性、具有活性基团的纳米粒子，高锰酸钾改性油酸包裹的纳米粒子表面活性基团，搅拌加热使制备得到的流体状磁性纳米粒子后，磁分离后经真空冷冻干燥后获得粉末状、具有亲水性、表面羧基功能化的磁纳米载体；
[0012] 步骤五、单宁酶固定化及固定化酶制备：超声均匀分散磁性纳米载体于磷酸盐缓冲溶液中，将游离单宁酶与分散均匀的磁性纳米载体混合均匀进行直接固定化、戊二醛交联固定化或碳二亚胺共价结合固定化游离单宁酶；磁分离固定化酶，纯水洗涤数次至洗涤液呈中性，真空冷冻干燥流体状单宁酶获得干粉状固定化单宁酶。
[0013] 作为实施例的优选方式，所述步骤一中产单宁酶菌株为Aspergillus tubingensis CICC 2651，斜面菌种转接于PDA斜面活化培养96 h，0.8%无菌吐温-80溶液洗涤斜面孢子，制备浓度为1.5×107个/mL的孢子悬液，接种孢子悬液5 mL于250 mL摇瓶中，摇瓶中培养基为PD，即PDA去除琼脂，装量为100 mL，每瓶加5粒直径0.5 cm的玻璃珠，28℃培养72 h获得塔宾曲霉发酵种子液。
[0014] 作为实施例的优选方式，所述步骤二中固体发酵基质为干燥的铁观音茶梗粉末过40目筛下物，蔗糖添加量为9%、葡萄糖添加量3%、硫酸铵添加量6%，酵母浸膏添加量0.5%，固水比按质量体积比为1:2，灭菌温度和时间分别为121℃和15 min；接种量为每克培养基接种0.5 mL发酵种子液，培养温度为 30℃，发酵为120 h。
[0015] 作为实施例的优选方式，所述步骤三中，发酵物中加入的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH 为5.0，固液比按质量体积比为1:5-20，浸提温度20-30℃、摇床转速0-250 rpm、浸提时间10-60 min，混合液过滤方式为真空减压过滤。
[0016] 作为实施例的优选方式，所述步骤三中，固体发酵物与浸提液比例优选1:10，浸提温度优选25℃，摇床转速优选180 rpm，浸提时间优选30 min。
[0017] 作为实施例的优选方式，所述步骤四中，混合液中的Fe3+和Fe2+的摩尔量比约为1:2、加热温度70℃、搅拌速度750 rpm，浓氨水添加量为总体积的1/10，油酸滴加量为总反应体积的1/30，后熟温度80℃、搅拌速度600 rpm、时间2h；高锰酸钾溶液浓度为10 mg/mL，超声振荡时间为 3h， -80℃真空冷冻干燥时间为 48 h。
[0018] 作为实施例的优选方式，所述步骤五中，直接固定化的步骤为：取亲水性超顺磁性纳米载体1 g置于反应瓶中，加入100 mLpH为7.0的磷酸盐缓冲液，超声5 min使得载体分散均匀；加入150 mL游离单宁酶，30℃、180 rpm固定化24 h；永磁铁磁分离固定化酶，蒸馏水洗涤流体状固定化酶直至洗涤液呈中性；-80℃真空冷冻干燥48 h；获得粉末状具有超顺磁性的单宁酶固定化纳米载体。
[0019] 作为实施例的优选方式，所述步骤五中，戊二醛交联固定化的步骤为：取亲水性超顺磁性纳米载体1 g置于反应瓶中，加入100 mLpH为7.0的磷酸盐缓冲液，超声5 min使得载体分散均匀；加入150 mL游离单宁酶、25 mL戊二醛（25%），30℃、180 rpm固定化24 h；永磁铁磁分离固定化酶，蒸馏水洗涤流体状固定化酶直至洗涤液呈中性；-80℃真空冷冻干燥48 h；获得粉末状具有超顺磁性的单宁酶固定化纳米载体。
[0020] 作为实施例的优选方式，所述步骤五中，碳二亚胺共价结合固定化的步骤为：取亲水性超顺磁性纳米载体1 g置于反应瓶中，加入100 mLpH为7.0的磷酸盐缓冲液，超声5 min使得载体分散均匀；加入150 mL游离单宁酶、13.8 mL浓度为0.1m mol/L的碳二亚胺/羟基琥珀酰亚胺，30℃、180 rpm固定化24 h；永磁铁磁分离固定化酶，蒸馏水洗涤流体状固定化酶直至洗涤液呈中性；-80℃真空冷冻干燥48 h；获得粉末状具有超顺磁性的单宁酶固定化纳米载体。
[0021] 本发明采用上述技术方案后，简单、快速的利用表面具有活性基团的磁性纳米粒子从单宁酶发酵粗酶液中选择性的直接固定化单宁酶，同时达到单宁酶纯化和固定化的双重目标。获得的磁性纳米固定化单宁酶具有良好的重复利用性以及可磁操纵性能。
附图说明
[0022] 图1磁性纳米固定化单宁酶的制备流程。
具体实施方式
[0023] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。实施例中使用的实验试剂如无特殊说明则均为市面上可通过商业渠道购置的试剂。
[0024] 下列实施例中采用的检测方法：
[0025] 固定化单宁酶酶活检测方法：（1）将载体与固定化酶分别用一定量柠檬酸缓冲液悬浮均匀备用。（2）取3支试管分别标记为空白管、对照管和测试管，各加入0.5 mL底物没食子酸丙酯（0.01 mol/L）。（3）空白管中加入0.5 mL柠檬酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 5.0），测试管中加入0.5 mL固定化酶，对照管中加入等量载体，所有处理均30℃水浴5 min。（4）永磁铁磁分离测试管与对照管中的固定化酶和载体，反应液加入0.6 mL甲醇绕丹宁溶液（6.67 g/L），30℃水浴5 min。（5）加入0.4 mL KOH（0.7 mol/L），30℃保温5 min。（6）所有处理中均加入8 mL蒸馏水，振荡均匀后30℃保温10 min，520 nm处测吸光值。将30℃条件下每分钟产生1 µmol没食子酸所需要的酶量定义为一个酶活单位（U）。
[0026] 固定化酶比酶活（Y）为每克磁性纳米载体所固定的单宁酶活力（U/g），即每克固定化单宁酶具有的酶活力。
[0027] 实施例1：磁性纳米粒子直接固定化法制备固定化单宁酶
[0028] （1）将Aspergillus tubingensis CICC 2651斜面菌种转接于PDA斜面活化培养96 h，0.8%无菌吐温-80溶液洗涤斜面孢子制备浓度为1.5×107个/mL的孢子悬液，接种孢子悬液5 mL于250 mL摇瓶中（培养基为PD，即PDA去除琼脂，装量为100 mL，每瓶加5粒直径0.5 cm的玻璃珠）28℃培养72 h获得塔宾曲霉发酵种子液。
[0029] （2）取干燥的铁观音茶梗粉末过40目筛下物，添加9%蔗糖、3%葡萄糖、6%硫酸铵以及0.5%酵母浸膏，固水比为1:2（m:v），121℃灭菌15 min冷却至室温获得发酵培养基。每克发酵培养基接种0.5 mL发酵种子液， 30℃恒温静置发酵120 h。
[0030] （3）发酵结束后，按固液比为1:10（m/v）往发酵物中加入pH 为5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液浸提培养基中单宁酶，置于回旋式摇床中于25℃、180 rpm条件下浸提时间30 min，真空减压过滤混合液即获得游离单宁酶。
[0031] （4）准确称取12.0 g FeCl3和7.0 g FeCl2分别用200 mL和10 mL去离子水溶解，70℃加热搅拌（750 rpm）条件下加入反应总体积1/10的浓氨水至生成大量黑色Fe3O4纳米粒子，滴加总反应体积1/30的油酸后于80℃、600 rpm条件下加热搅拌2 h进行后熟，磁分离所得沉淀物质，95%乙醇洗涤沉淀物5次，再经去离子水洗涤至洗涤液呈中性，得到流体状亲油性磁性纳米粒子。将获得的亲油性磁性纳米粒子加入10 g/L的高锰酸钾溶液中，超声振荡3 h，磁分离后用去离子水洗涤5次后-80℃真空冷冻干燥48 h获得亲水性具有超顺磁性的单宁酶固定化纳米载体。
[0032] （5）取亲水性超顺磁性纳米载体1 g置于反应瓶中，加入100 mLpH为7.0的磷酸盐缓冲液，超声5 min使得载体分散均匀。加入150 mL游离单宁酶，30℃、180 rpm固定化24 h。永磁铁磁分离固定化酶，蒸馏水洗涤流体状固定化酶直至洗涤液呈中性。-80℃真空冷冻干燥48 h获得粉末状具有超顺磁性的单宁酶固定化纳米载体。
[0033] 实施例2：磁性纳米粒子戊二醛交联法制备固定化单宁酶
[0034] （1）将Aspergillus tubingensis CICC 2651斜面菌种转接于PDA斜面活化培养96 h，0.8%无菌吐温-80溶液洗涤斜面孢子制备浓度为1.5×107个/mL的孢子悬液，接种孢子悬液5 mL于250 mL摇瓶中（培养基为PD，即PDA去除琼脂，装量为100 mL，每瓶加5粒直径0.5 cm的玻璃珠）28℃培养72 h获得塔宾曲霉发酵种子液。
[0035] （2）取干燥的铁观音茶梗粉末过40目筛下物，添加9%蔗糖、3%葡萄糖、6%硫酸铵以及0.5%酵母浸膏，固水比为1:2（m:v），121℃灭菌15 min冷却至室温获得发酵培养基。每克发酵培养基接种0.5 mL发酵种子液， 30℃恒温静置发酵120 h。
[0036] （3）发酵结束，按固液比为1:10（m/v）往发酵物中加入pH 5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液浸提单宁酶，置于摇床中于25℃、180 rpm条件下浸提时间30 min，真空减压过滤混合液即获得游离单宁酶。
[0037] （4）准确称取12.0 g FeCl3和7.0 g FeCl2分别用200 mL和10 mL去离子水溶解，70℃加热搅拌（750 rpm）条件下加入反应总体积1/10的浓氨水至生成大量黑色Fe3O4纳米粒子，滴加总反应体积1/30的油酸后于80℃、600 rpm条件下加热搅拌2 h进行后熟，磁分离所得沉淀物质，95%乙醇洗涤沉淀物5次，再经去离子水洗涤至洗涤液呈中性，得到流体状亲油性磁性纳米粒子。将获得的亲油性磁性纳米粒子加入10 g/L的高锰酸钾溶液中，超声振荡3 h，磁分离后用去离子水洗涤5次后-80℃真空冷冻干燥48 h获得亲水性具有超顺磁性的单宁酶固定化纳米载体。
[0038] （5）取亲水性超顺磁性纳米载体1 g置于反应瓶中，加入100 mL pH为7.0的磷酸盐缓冲液，超声5 min使得载体分散均匀。加入150 mL游离单宁酶、25 mL戊二醛（25%），30℃、180 rpm固定化24 h。永磁铁磁分离固定化酶，蒸馏水洗涤流体状固定化酶直至洗涤液呈中性。-80℃真空冷冻干燥48 h获得粉末状具有超顺磁性的单宁酶固定化纳米载体。
[0039] 实施例3：磁性纳米粒子碳二亚胺共价结合法制备固定化单宁酶
[0040] （1）将Aspergillus tubingensis CICC 2651斜面菌种转接于PDA斜面活化培养96 h，0.8%无菌吐温-80溶液洗涤斜面孢子制备浓度为1.5×107个/mL的孢子悬液，接种孢子悬液5 mL于250 mL摇瓶中（培养基为PD，即PDA去除琼脂，装量为100 mL，每瓶加5粒直径0.5 cm的玻璃珠）28℃培养72 h获得塔宾曲霉发酵种子液。
[0041] （2）取干燥的铁观音茶梗粉末过40目筛下物，添加9%蔗糖、3%葡萄糖、6%硫酸铵以及0.5%酵母浸膏，固水比为1:2（m:v），121℃灭菌15 min冷却至室温获得发酵培养基。每克发酵培养基接种0.5 mL发酵种子液， 30℃恒温静置发酵120 h。
[0042] （3）发酵结束后，按固液比为1:10（m/v）往发酵物中加入pH 为5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液浸提培养基中单宁酶，置于回旋式摇床中于25℃、180 rpm条件下浸提时间30 min，真空减压过滤混合液即获得游离单宁酶。
[0043] （4）准确称取12.0 g FeCl3和7.0 g FeCl2分别用200 mL和10 mL去离子水溶解，70℃加热搅拌（750 rpm）条件下加入反应总体积1/10的浓氨水至生成大量黑色Fe3O4纳米粒子，滴加总反应体积1/30的油酸后于80℃、600 rpm条件下加热搅拌2 h进行后熟，磁分离所得沉淀物质，95%乙醇洗涤沉淀物5次，再经去离子水洗涤至洗涤液呈中性，得到流体状亲油性磁性纳米粒子。将获得的亲油性磁性纳米粒子加入10 g/L的高锰酸钾溶液中，超声振荡3 h，磁分离后用去离子水洗涤5次后-80℃真空冷冻干燥48 h获得亲水性具有超顺磁性的单宁酶固定化纳米载体。
[0044] （5）取亲水性超顺磁性纳米载体1 g置于反应瓶中，加入100 mLpH为7.0的磷酸盐缓冲液，超声5 min使得载体分散均匀。加入150 mL游离单宁酶、13.8 mL碳二亚胺/羟基琥珀酰亚胺（0.1 mM），30℃、180 rpm固定化24 h。永磁铁磁分离固定化酶，蒸馏水洗涤流体状固定化酶直至洗涤液呈中性。-80℃真空冷冻干燥48 h获得粉末状具有超顺磁性的单宁酶固定化纳米载体。
[0045] 如图1所述，为本发明的磁性纳米固定化单宁酶的制备流程。磁性纳米固定化单宁酶的活力、存储稳定性及重复利用性，如下表1所示。
[0046] 表1 磁性纳米固定化单宁酶的活力、存储稳定性及重复利用性
[0047]
[0048] 注：*分别在4℃、30℃条件下不遮光存储30 d后的剩余酶活力，以初始酶活力为100%；
[0049] **酶活力测定条件下催化单宁酸生成没食子酸重复使用6次的剩余酶活，以初始酶活力为100%。
[0050] 磁性纳米粒子是一种物理性能十分优秀的纳米材料，具有表面积巨大、吸附能力强、分散性好以及可以进行磁操纵等优点。本发明旨在以表面具有活性基团的磁性纳米粒子为酶固定载体，以载体表面的活性基团为酶固定化结合位点从单宁酶发酵粗酶液中选择性的直接固定化单宁酶，再利用磁场从发酵液中将固定化单宁酶分离出来。本方法可简易、快速、低成本的制备具有可重复利用、可磁操纵的纳米级固定化单宁酶。
