地表水体中若干种痕量糖皮质激素及其衍生物的检测方法

摘要

本发明公开了地表水体中若干种痕量糖皮质激素及其衍生物的检测方法，包括如下步骤：固相萃取；(2)采用超高效液相色谱-质谱串联方法分析水体样品中糖皮质激素及其衍生物的含量：(3)绘制标准曲线，并以外标法进行定量测定，通过换算得到水体样品中痕量糖皮质激素及其衍生物的浓度。本发明所述检测方法具有操作简便、对环境友好、检出限低的优点。(1)水体样品的预处理：将水体样品过滤后进行

权利要求

1.一种地表水体中若干种痕量糖皮质激素及其衍生物的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)水体样品的预处理：将水体样品过滤后进行固相萃取；

(2)采用超高效液相色谱-质谱串联方法对水体样品的萃取液进行检测；

(3)绘制标准曲线，并以外标法进行定量测定，通过换算得到水体样品中痕量糖皮质激素及其衍生物的浓度；

步骤(2)中所述超高效液相色谱-质谱串联方法中的仪器和色谱条件为：TM

ACQUITY 超高液相色谱仪、Agilent Zorbax SB-C18柱，100mm×3mm,1.8μm和Micromass-Quattro Premier XE质谱仪，使用MassLynxV4.1软件，柱温：40℃；样品温度：4℃；进样体积：3μL；流动相A：甲醇，流动相B：含0.1％体积分数的乙酸的水溶液，洗脱程序如下：0～6min，A：35％→45％；6～12min，A：45％→80％；12～15min，A：80％→95％；15～

15.1min，A：95％→35％；

步骤(2)中所述超高效液相色谱-质谱串联方法中的质谱条件为：离子源为电喷雾电离采用ESI，负离子模式，毛细管电压：3.00kV，射频透镜1电压：

27.0V，射频透镜2电压：0.0V，离子源温度：99℃，脱溶剂温度：450℃，脱溶剂气流量：600L/h，碰撞梯度：1.9，采用多选择反应监测转换模式MRM；

所述糖皮质激素及其衍生物为泼尼松、可的松、氢化可的松、泼尼松龙、氟米松、地塞米松、曲安西龙、醋酸氟氢可的松、曲安奈德、甲泼尼龙、倍氯米松、醋酸可的松、醋酸氢化可的松、氟米龙、醋酸地塞米松、布地奈德和丙酸氯倍他索；

所述质谱条件中的质谱采集参数如表1所示：

表1目标糖皮质激素及其衍生物的质谱采集参数1)

a

1)表示该碎片离子为定量离子。

2.根据权利要求1所述的地表水体中若干种痕量糖皮质激素及其衍生物的检测方法，其特征在于：所述水体样品的预处理包括如下步骤：采集需要检测的水体样品，置于棕色玻璃瓶中运回实验室，为避免固相萃取柱的堵塞，

1.5L水体样品首先经过1.2μm孔径的Whatman公司GF/C玻璃纤维滤纸过滤，接着以3～5mL/min的流速通过事先用6mL乙酸乙酯、6mL乙腈和6mL超纯水活化的HLB固相萃取柱，水体样品全部通过固相萃取柱后，用12mL超纯水淋洗固相萃取柱，并用氮气吹干除尽萃取柱内的水分，再用6mL体积比为1:1的乙酸乙酯/乙腈洗脱HLB固相萃取柱，收集洗脱液利用微弱氮气吹干，用100μL甲醇重新溶解定容待测，所有萃取富集过程在6h内完成。

3.根据权利要求2所述的地表水体中若干种痕量糖皮质激素及其衍生物的检测方法，其特征在于：所述方法还包括：使用糖皮质激素的同位素标样cortisol-d4作为过程内标用以校正实际样品在前处理和检测过程中的损失。

说明书

地表水体中若干种痕量糖皮质激素及其衍生物的检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及化学物质的检测方法，特别是涉及一种采用超高效液相色谱质谱串联法对地表水样中糖皮质激素及其衍生物(包括天然糖皮质激素、酯化糖皮质激素和卤代糖皮质激素)的检测方法。

背景技术

[0002] 内分泌干扰物质的一种是近几十年环境科学领域关注的重点，其可以干扰机体内分泌系统从而对人体和动物的内分泌干扰系统造成影响，近几十年女性子宫癌发病率上升、儿童性成熟提前、新生儿免疫力下降都被证明与内分泌干扰物质相关。糖皮质激素及其衍生物作为内分泌干扰物质的一类，是目前广受关注的新型内分泌干扰物质，研究发现糖皮质激素及其衍生物在ng/L的浓度水平下就可对生物的免疫、生殖和免疫系统造成损害，严重的可导致生殖受损和发育缺陷等问题，处于糖皮质激素的暴露下的鱼类可能会引发机体免疫反应抑制、生长抑制和生理状况恶化等情况。鉴于糖皮质激素与雌激素、雄激素和孕激素结构的相似性，其生物效应可能会发生交叉，如有研究表明两种糖皮质激素：氢化可的松和泼尼松可能导致雌性食蚊鱼的雄性化现象，因此有必要对地表水体中的糖皮质激素及其衍生物展开研究。

[0003] 地表水体中的糖皮质激素及其衍生物来源较多，主要有：人类日常分泌排放和未被利用的医疗用糖皮质激素及其衍生物药物，值得注意的是，我国糖皮质激素类药物达到了滥用的程度，在调查的医院中使用率超过20％，个别医院超过50％。另外畜牧业由于动物数量巨大，日常分泌排放量也十分可观，且一些糖皮质激素类药物如地塞米松被广泛使用于畜牧业养殖，其产生的进入水体中的糖皮质激素量十分庞大，另外一些激素合成工业的废水废渣也是不容忽视的污染来源。

[0004] 鉴于糖皮质激素及其衍生物对人类和动物机体产生的危害以及其在人类接触密切的地表水体中的广泛存在，另外地表水体样品具有复杂的基质特征，可对检测灵敏度产生较大干扰，且水体中糖皮质激素含量可达到极低的ng/L级别，使得地表水体中的糖皮质激素检测方法较为匮乏。目前环境激素的检测方法主要有气相色谱串联质谱串联法、液相色谱串联质谱串联法以及免疫分析法等，但都存在着灵敏度低、衍生化困难、不适用于大规模操作等弊端。因此本发明利用固相萃取激素结合超高效液相色谱质谱串联技术建立灵敏度高、简便易用、可检测多种物质的糖皮质激素及其衍生物检测方法。

发明内容

[0005] 为了解决现有技术存在的困难，本发明针对水环境中基质复杂，糖皮质激素及其衍生物含量极低，检测难度大等问题，提供了一种高效、简便、经济的分析方法，实现对地表水体样品中常见的糖皮质激素及其衍生物的测定。

[0006] 一种地表水体中若干种痕量糖皮质激素及其衍生物的检测方法，包括如下步骤：

[0007] (1)水体样品的预处理：将水体样品过滤后进行固相萃取；

[0008] (2)采用超高效液相色谱-质谱串联方法对水体样品的萃取液进行检测；

[0009] (3)绘制标准曲线，并以外标法进行定量测定，通过换算得到水体样品中痕量糖皮质激素及其衍生物的浓度。

[0010] 本发明所述的地表水体中若干种痕量糖皮质激素及其衍生物的检测方法，其中，步骤(2)中所述超高效液相色谱-质谱串联方法中的色谱条件为：

[0011] ACQUITYTM超高液相色谱仪、Agilent Zorbax SB-C18柱(100mm×3mm,1.8μm)和Micromass-Quattro Premier XE质谱仪，使用MassLynxV4.1软件，柱温：40℃；样品温度：4℃；进样体积：3μL；流动相A：甲醇，流动相B：含0.1％(体积分数)乙酸的水溶液，洗脱程序如下：0～6min，A：35％→45％；6～12min，A：45％→80％；12～15min，A：80％→95％；15～15.1min，A：95％→35％。

[0012] 本发明所述的地表水体中若干种痕量糖皮质激素及其衍生物的检测方法，其中，步骤(2)中所述超高效液相色谱-质谱串联方法中的质谱条件为：

[0013] 离子源为电喷雾电离采用ESI(-)模式，毛细管电压：3.00kV，射频透镜1电压：27.0V，射频透镜2电压：0.0V，离子源温度：99℃，脱溶剂温度：450℃，脱溶剂气流量：600L/h，碰撞梯度：1.9，采用多选择反应监测转换模式MRM。

[0014] 本发明所述的地表水体中若干种痕量糖皮质激素及其衍生物的检测方法，其中，所述水体样品的预处理包括如下步骤：

[0015] 采集需要检测的地表水体样品，置于棕色玻璃瓶中运回实验室，为避免固相萃取柱的堵塞，1.5L水体样品首先经过1.2μm孔径的Whatman公司GF/C玻璃纤维滤纸过滤，接着以3～5mL/min的流速通过事先用6mL乙酸乙酯、6mL乙腈和6mL超纯水活化的HLB固相萃取柱，水体样品全部通过固相萃取柱后，用12mL超纯水淋洗固相萃取柱，并用氮气吹干除尽萃取柱内的水分，再用6mL体积比为1:1的乙酸乙酯/乙腈洗脱HLB固相萃取柱，收集洗脱液利用微弱氮气吹干，用100μL甲醇重新溶解定容待测，所有萃取富集过程在6h内完成。

[0016] 本发明所述的地表水体中若干种痕量糖皮质激素及其衍生物的检测方法，其中，所述糖皮质激素及其衍生物为泼尼松、可的松、氢化可的松、泼尼松龙、氟米松、地塞米松、曲安西龙、醋酸氟氢可的松、曲安奈德、甲泼尼龙、倍氯米松、醋酸可的松、醋酸氢化可的松、氟米龙、醋酸地塞米松、布地奈德和丙酸氯倍他索。

[0017] 本发明所述的地表水体中若干种痕量糖皮质激素及其衍生物的检测方法，其中，所述质谱条件中的质谱采集参数如表1所示：

[0018] 表1 目标糖皮质激素及其衍生物的质谱采集参数1)

[0019]

[0020]

[0021] 1)a表示该碎片离子为定量离子

[0022] 本发明所述的地表水体中若干种痕量糖皮质激素及其衍生物的检测方法，其中，所述方法还包括：使用糖皮质激素的同位素标样cortisol-d4作为过程内标用以校正实际样品在前处理和检测过程中的损失。

[0023] 本发明地表水体中若干种痕量糖皮质激素及其衍生物的检测方法与现有技术不同之处在于：

[0024] 本发明地表水体中若干种痕量糖皮质激素及其衍生物的检测方法针对水体样品的复杂的基质特征和目标物质的极低浓度，针对性的采用过程简单有效的亲水亲油平衡(HLB)固相萃取柱进行萃取，选择特异性强的MRM转换离子对，采用灵敏度高的超高效液相色谱串联质谱法进行定量检测，并利用同位素标样cortisol-d4校正实验过程中可能产生的目标物质的损失。本发明提供了一种检出限低、回收效果好、可检测多种物质的分析方法，能够快速分析水体中的常见糖皮质激素及其衍生物含量。

[0025] 下面结合附图对本发明的地表水体中若干种痕量糖皮质激素及其衍生物的检测方法作进一步说明。

附图说明

[0026] 图1为添加量为10ug/L的泼尼松溶液的色谱图；

[0027] 图2为添加量为10ug/L的可的松和泼尼松龙(两种物质的定量转换离子对相同)溶液的色谱图；

[0028] 图3为添加量为10ug/L的氢化可的松溶液的色谱图；

[0029] 图4为添加量为10ug/L的氟米松溶液的色谱图；

[0030] 图5为添加量为10ug/L的地塞米松溶液的色谱图；

[0031] 图6为添加量为10ug/L的曲安西龙溶液的色谱图；

[0032] 图7为添加量为10ug/L的醋酸氟氢可的松溶液的色谱图；

[0033] 图8为添加量为10ug/L的曲安奈德溶液的色谱图；

[0034] 图9为添加量为10ug/L的甲泼尼龙溶液的色谱图；

[0035] 图10为添加量为10ug/L的倍氯米松溶液的色谱图；

[0036] 图11为添加量为10ug/L的醋酸可的松溶液的色谱图；

[0037] 图12为添加量为10ug/L的醋酸氢化可的松溶液的色谱图；

[0038] 图13为添加量为10ug/L的氟米龙溶液的色谱图；

[0039] 图14为添加量为10ug/L的醋酸地塞米松溶液的色谱图；

[0040] 图15为添加量为10ug/L的布地奈德溶液的色谱图；

[0041] 图16为添加量为10ug/L的丙酸氯倍他索溶液的色谱图；

[0042] 图17为实施例2中检出的糖皮质激素及其衍生物的色谱图；其中色谱图从上至下依次为：可的松(cortisone)和泼尼松龙(prednisolone)、氢化可的松(Hydrocortisone)、地塞米松(Dexamethasone)、曲安西龙(Triamcinolone)、曲安奈德(Triamcinolone acetonide)、醋酸氢化可的松(Hydrocortisone acetate)。

具体实施方式

[0043] 实施例1

[0044] 一种地表水体中痕量糖皮质激素及其衍生物含量的检测方法，该方法包括如下步骤：

[0045] (1)地表水体样品的预处理

[0046] 采集1.5L的地表水体样品经过1.2μm孔径的Whatman公司GF/C玻璃纤维滤纸过滤，接着以3～5mL/min的流速通过事先用6mL乙酸乙酯、6mL乙腈和6mL超纯水活化的亲水亲油平衡(HLB)固相萃取柱，水样全部通过固相萃取(SPE)柱后，用12mL超纯水淋洗SPE柱，并用微弱氮气吹干除尽萃取柱内的水分，最后用6mL乙酸乙酯/乙腈(1:1，V/V)洗脱HLB固相萃取柱，收集洗脱液利用微弱氮气吹干，用100μL甲醇重新溶解定容后待测，所有萃取富集过程须在6h内完成。

[0047] (2)利用超高效液相色谱质谱串联技术对地表水样品的萃取液进行检测

[0048] 本发明实验仪器和条件为：ACQUITYTM超高液相色谱仪、Agilent Zorbax SB-C18柱(100mm×3mm,1.8μm)和Micromass-Quattro Premier XE质谱仪，使用MassLynx V4.1软件，色谱洗脱条件：柱温：40℃；样品温度：4℃；进样体积：3μL；流动相A：甲醇，流动相B：含0.1％(体积分数)乙酸的水溶液，洗脱程序如表1所示：

[0049] 表2 17种目标糖皮质激素及其衍生物的超高液相色谱分析条件

[0050]

[0051] 质谱条件：离子源为电喷雾电离采用ESI(-)模式，采用多选择反应监测转换模式(MRM)，毛细管电压：3.00kV，射频透镜1(RF lens 1)电压：27.0V，射频透镜2(RF lens 2)电压：0.0V，离子源温度：99℃，脱溶剂温度：450℃，脱溶剂气流量：600L/h，碰撞梯度：1.9，质谱条件如表1所示。

[0052] 表1 目标糖皮质激素及其衍生物的质谱采集参数1)

[0053]

[0054]

[0055] 1)a表示该碎片离子为定量离子

[0056] (3)标准曲线的绘制，并以外标法进行定量测定

[0057] 所述的外标法标准曲线的绘制：利用分析天平称取标准糖皮质激素及其衍生物样品溶于色谱纯甲醇中，配制成系列浓度的标准溶液，采用超高效液相色谱质谱串联技术进行分析检测，分别以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标进行回归分析，得到标准曲线，用于测定样品中糖皮质激素及其衍生物的含量。

[0058] (4)样品和回收率的的测定

[0059] 采集地表水体样品，按照步骤(1)对水样进行前处理操作，再按步骤(2)进行超高效液相色谱质谱串联技术检测，并与步骤(3)得到的标准曲线比较，为了校正实际样品在前处理和检测过程中的损失，本研究使用糖皮质激素及其衍生物的同位素标样cortisol-d4作为过程内标。最终通过换算得到待测水样中痕量糖皮质激素及其衍生物的浓度。

[0060] 采集相同的水体样品，加入50ng/L的糖皮质激素及其衍生物标准溶液，按照上述前处理和检测方法测定糖皮质激素及其衍生物浓度含量，按照下式计算回收率：

[0061]

[0062] R-回收率，％；

[0063] C-添加标准溶液的水样中糖皮质激素及其衍生物含量，ng/L；

[0064] C0-未添加标准溶液的水样中糖皮质激素及其衍生物含量，ng/L；

[0065] 其中所述的糖皮质激素及其衍生物包括：泼尼松、可的松、氢化可的松、泼尼松龙、氟米松、地塞米松、曲安西龙、醋酸氟氢可的松、曲安奈德、甲泼尼龙、倍氯米松、醋酸可的松、醋酸氢化可的松、氟米龙、醋酸地塞米松、布地奈德和丙酸氯倍他索。标准样品色谱图见图1-图16。

[0066] 本发明采用添加标准糖皮质激素及其衍生物混合样品用以计算回收率，添加量为50ng/L。另外按照3倍检出限信噪比(S/N)计算目标糖皮质激素及其衍生物的信号强度，根据浓度-峰面积的工作曲线计算每个目标糖皮质激素及其衍生物的检出限。本方法的回收率和最低检出限如表3所示。

[0067] 表3 17种目标糖皮质激素及其衍生物的方法回收率和检出限

[0068]

[0069] 本发明的有益效果是针对地表水体样品的复杂的基质特征和目标物质的极低浓度，针对性的采用过程简单有效的亲水亲油平衡(HLB)固相萃取柱进行萃取，并采用灵敏度高，特异性好的超高效液相色谱串联质谱法进行定量检测。本发明提供了一种检出限低、回收效果好、可检测多种物质的分析方法，能够快速分析地表水体中的常见糖皮质激素及其衍生物含量。本发明方法还包括使用糖皮质激素的同位素标样cortisol-d4作为过程内标用以校正实际样品在前处理和检测过程中的损失。

[0070] 实施例2

[0071] 一种地表水体中痕量糖皮质激素及其衍生物含量的检测方法，该方法包括如下步骤：

[0072] (1)地表水体样品的预处理

[0073] 采集北京市部分城市河流的5个水体样品各1.5L，置于棕色玻璃瓶中，水样首先经过1.2μm孔径的GF/C玻璃纤维滤纸过滤以去除杂质，HLB固相萃取柱事先用6mL乙酸乙酯、6mL乙腈和6mL超纯水活化，接着过滤后的水样以3～5mL/min的流速通过固相萃取柱，水样全部通过HLB柱后，用12mL超纯水淋洗固相萃取柱，并用氮气吹干除尽萃取柱内的水分，最后用6mL乙酸乙酯/乙腈(1:1，V/V)洗脱HLB固相萃取柱，收集洗脱液并用微弱氮气吹干，用
100μL甲醇重新溶解定容用于UPLC-MS/MS检测，所有前处理过程在6h内完成。

[0074] (2)利用超高效液相色谱-质谱串联技术对水体样品萃取液进行检测

[0075] 超高效液相色谱-质谱串联法选择的实验仪器和条件为：ACQUITYTM超高液相色谱仪，Agilent Zorbax SB-C18柱(100mm×3mm,1.8μm)和Micromass-Quattro Premier XE质谱仪，使用MassLynxV4.1软件，柱温：40℃；样品温度：4℃；进样体积：3μL。

[0076] 实验证明：当甲醇作为流动相时，对于目标物质的洗脱效果好于常见的洗脱溶剂如乙腈，比较0.1％甲酸/水溶液和0.1％乙酸/水溶液对于目标物质离子化效率的影响，结果表明，0.1％乙酸/水溶液的效果较好，因此选择流动相A：甲醇和流动相B：含0.1％(体积分数)乙酸的水溶液作为最终的流动相溶剂，洗脱程序如下：0～6min，A：35％→45％；6～12min，A：45％→80％；12～15min，A：80％→95％；15～15.1min，A：95％→35％。电喷雾电离采用ESI(-)模式，毛细管电压：3.00kV，射频透镜1(RF lens 1)电压：27.0V，射频透镜2(RF lens2)电压：0.0V，离子源温度：99℃，脱溶剂温度：450℃，脱溶剂气流量：600L/h，碰撞梯度：1.9，采用多选择反应监测转换模式(MRM)，采用表1的质谱条件。

[0077] 表1 目标糖皮质激素及其衍生物的质谱采集参数1)

[0078]

[0079]

[0080] 1)a表示该碎片离子为定量离子

[0081] (3)标准曲线的绘制，并以外标法进行定量测定

[0082] 利用分析天平称取标准糖皮质激素及其衍生物混合样品溶于色谱纯甲醇中，配制成系列浓度梯度的标准溶液，采用超高效液相色谱质谱串联法进行分析检测，分别以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标进行回归分析，绘制标准曲线，用于测定水样中痕量糖皮质激素及其衍生物的含量。

[0083] (4)样品的测定

[0084] 在步骤(1)对5份水样进行前处理操作，和步骤(2)进行超高效液相色谱串联质谱法检测，并与步骤(3)得到的标准曲线比较，考虑前处理和检测过程的损失，最终通过换算得到待测水样中痕量糖皮质激素及其衍生物的浓度。最终结果如表4所示：

[0085] 表4 样点中17种糖皮质激素及其衍生物的浓度水平/ng·L-1

[0086]

[0087] 1)n.d.表示未检出

[0088] 色谱图见图17。

[0089] 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。