从中药猴耳环中提取的化合物及其用途

摘要

本发明属于医药技术领域，涉及从豆科猴耳环属植物猴耳环(Pithecellobium clypearia Benth.)中提取分离的化合物，化学名为：5?烯丙基?5'?(2?羟丙基)[1,1'?联苯]?2,2'?二醇，5?烯丙基?5'?(2,3?二羟基?1?甲氧基丙基)[1,1?联苯]?2,2'?二醇，1?(3'?甲氧基,4'?羟基苯基)?3?(2'',6''?二甲氧基?4''?羟基苯基)丙烷?2?醇。是通过将猴耳环粗提物经过反复的硅胶、ODS柱层析、HPLC分离得到的三个新化合物。经过ABTS自由基清除能力的测定结果，表明三个化合物均具有很好的抗氧化活性，可制备治疗及预防自由基对人体破坏相关疾病的药物。

权利要求

1.如下结构所示的化合物：

 。

2.如权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）取干燥的猴耳环嫩枝和叶，用60～75%乙醇回流提取，合并提取液并减压浓缩后得总浸膏，总浸膏用水混悬后，经D101大孔树脂分别以水和体积分数25%～35%、55%～65%、85%～95%的乙醇水洗脱，85%～95%乙醇洗脱物采用快速减压柱色谱，以二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇系统50:1～2:1逐渐洗脱，得到15～20个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为A1～A5；

（2）50:1～30:1的洗脱流分A1再经ODS柱色谱，以甲醇-水系统40%～90%逐渐洗脱，得到

12～18个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为F1～F3，流分F2再经硅胶柱色谱，以二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇系统30:1～1:1逐渐洗脱，得到20～30个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为B1～B7利用HPLC法以甲醇-水为流动相在B2～B6中制备得到化合物1和3；

（3）30:1～15:1的洗脱流分A2再经ODS柱色谱，以甲醇-水系统40%～80%逐渐洗脱，得到

15～20个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为C1～C5，流分C2再经硅胶柱色谱，以二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇系统15:1~1:1逐渐洗脱，得到20～30个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为D1～D5，利用HPLC法以甲醇-水为流动相在D2～D4中制备得到化合物2。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述提取为回流提取，提取3～5次，每次2～3小时。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的用于HPLC的甲醇-水的比例为

50%-65%。

5. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述猴耳环是指豆科猴耳环属植物猴耳环(Pithecellobium clypearia Benth.)。

6.药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体。

7.权利要求1所述的化合物或权利要求6所述的药物组合物在制备抗氧化药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的抗氧化药物为具有清除ABTS自由基能力的药物。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的抗氧化药物为与自由基对人体破坏相关疾病的药物。

说明书

从中药猴耳环中提取的化合物及其用途

技术领域：

[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及猴耳环中三个新化合物及其制备方法，本发明还涉及所述的新化合物在制备抗氧化药物中的应用。背景技术：

[0002] 自由基是机体氧化反应中产生的有害化合物，具有强氧化性。我们生物体系主要遇到的是氧自由基，例如超氧阴离子自由基、羟自由基、脂氧自由基、二氧化氮和一氧化氮自由基。加上过氧化氢、单线态氧和臭氧，通称活性氧。过多的活性氧自由基可损害机体的组织和细胞，进而引起慢性疾病如心脏病、老年痴呆症、帕金森病、肿瘤及衰老效应。活性氧自由基对人体的损害实际上是一种氧化过程，因此，要降低自由基的损害，就得从抗氧化来实现。本发明所涉及的三个化合物是通过对猴耳环提取物制备获得，为未见报道的三个新化合物，具有很好的自由基清除活性，从而达到抗氧化的效果，是三个具有很大潜在价值的药物先导化合物。发明内容：

[0003] 本发明的目的之一是从猴耳环嫩枝和叶中寻找新的抗氧化前体药物，本发明的目的之二是提供该新化合物的提取、制备方法，并且研究它们的抗氧化生物活性和医药用途，本发明的目的之三在于提供该新化合物的结构鉴定方法，本发明的目的之四在于提供三个新化合物在制备抗氧化药物中的应用。

[0004] 本发明所述的三个具有抗氧化活性的新化合物5-烯丙基-5'-(2-羟丙基)[1,1'-联苯]-2,2'-二醇，5-烯丙基-5'-(2,3-二羟基-1-甲氧基丙基)[1,1-联苯]-2,2'-二醇，1-(3'-甲氧基,4'-羟基苯基)-3-(2”,6”-二甲氧基-4”-羟基苯基)丙烷-2-醇，其结构如下所示：

[0005]

[0006] 本发明所述三个新化合物的提取、制备方法如下：

[0007] (1)取干燥的猴耳环嫩枝和叶，用60～75％乙醇回流提取，合并提取液并减压浓缩后得总浸膏，总浸膏用水混悬后，经D101大孔树脂分别以水和体积分数25％～35％、55％～65％、85％～95％的乙醇水洗脱，85％～95％乙醇洗脱物采用快速减压柱色谱，以二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇系统50:1～2:1逐渐洗脱，得到15～20个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为A1～A5。

[0008] (2)流分A1(50:1～30:1的洗脱流分)再经ODS柱色谱，以甲醇-水系统40％～90％逐渐洗脱，得到12～18个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为F1～F3。流分F2再经硅胶柱色谱，以二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇系统30:1～1:1逐渐洗脱，得到20～30个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为B1～B7。利用 HPLC法以甲醇-水(50％～65％)为流动相在B2～B6中制备得到化合物1和3。

[0009] (3)流分A2(30:1～15:1的洗脱流分)再经ODS柱色谱，以甲醇-水系统40％～80％逐渐洗脱，得到15～20个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为C1～C5。流分C2再经硅胶柱色谱，以二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇系统15:1～1:1逐渐洗脱，得到20～30个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为D1～D5。利用HPLC法以甲醇-水(50％～65％)为流动相在D2～D4中制备得到化合物2。

[0010] 所述提取为回流提取，提取3～5次，每次2～3小时。

[0011] 所述的制备方法，其特征在于，所述的用于HPLC的甲醇-水的比例为50％～65％。

[0012] 所述猴耳环是指豆科猴耳环属植物猴耳环(Pithecellobium clypearia Benth.)。

[0013] 具体地：所述三个化合物的制备方法如下：

[0014] 取干燥的猴耳环嫩枝和叶15～19kg，用5～7倍量的60～75％工业乙醇回流提取3～5次，每次2～3小时，合并提取液并减压浓缩后得总浸膏1.5～2.0kg，总浸膏用8～10L水混悬后，经D101大孔树脂分别以水和体积分数30％、60％、95％的乙醇水洗脱，得到的30％层干浸膏90～110g，60％层干浸膏300～400g，95％层干浸膏180～210g，水层干浸膏290～320g。95％乙醇洗脱物采用快速减压柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统50:1～2:1逐渐洗脱，得到15～20个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为A1～A5。

[0015] 流分A1(40～60g)再经ODS柱色谱，以甲醇-水系统40％～90％逐渐洗脱，得到12～18个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为F1～F3。流分F2再经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统30:1～1:1逐渐洗脱，得到20～30个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为B1～B7。利用HPLC法以甲醇-水为流动相在B2～B6中制备得到化合物1和3。

[0016] 流分A2(40～60g)再经ODS柱色谱，以甲醇-水系统40％～80％逐渐洗脱，得到15～20个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为C1～C5。流分C2再经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统15:1～1:1逐渐洗脱，得到20～30个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为D1～D5。利用HPLC法以甲醇-水为流动相在D2～D4中制备得到化合物2。

[0017] 本发明所述三个新化合物具有较好的抗氧化活性。ABTS自由基清除活性试验方法如下：

[0018] 1.实验材料

[0019] 1.1受试品：化合物

[0020] 1.2试剂：ABTS(华蓝化学试剂公司)，Trolox(华蓝化学试剂公司)，PBS(Silarbio公司)

[0021] 2.实验方法

[0022] 2.1药物处理

[0023] 药物的溶解

[0024] 化合物和Trolox用无水乙醇配制成100、50、10、5、1μg·ml 5个浓度；PBS用蒸馏水配制成0.01M；ABTS用配好的PBS配制成3.84mg·mL-1，然后与0.66mg·mL-1的过硫酸钾溶液按体积比1:1混合均匀，室温避光放置12-16h,即生成ABTS.+，再用PBS将其稀释10倍待用。

[0025] 2.1实验操作

[0026] 加不同浓度样品溶液(1、5、10、50、100μg·mL-1)100μL与配制好的ABTS.+溶液150μL于96孔酶标板中，震荡1min,放置30min,用酶标仪在734nm下 测定其吸光度值(S),同时测定样品PBS对照组吸光度值(SB),ABTS阴性对照组吸光度值(C)和无水乙醇PBS空白对照组吸光度值(CB)。以Trolox为阳性对照物,如下计算自由基清除率：抑制率(ABTS.+清除率)＝[1-(S-SB)/(C-CB)]×100％

[0027] 2.2统计学处理方法

[0028] 全部资料采用SPSS(16.0)统计软件包进行检验分析，结果采用IC50值来评估样品抗氧化活性。

[0029] 2.3实验结果

[0030] 测定了化合物1-3的ABTS自由基清除活性，结果表明三个化合物均有很好的清除自由基活性，化合物1-3的IC50值分别为14.941,7.652,9.772μg·mL-1，阳性对照Trolox的IC50值为14.152μg·mL-1。可看出，除化合物1的活性与阳性药相当之外，化合物2和3的活性都比阳性药好。

[0031] 本发明所涉及从猴耳环中分离得到的三个新化合物，均具有很好的抗氧化活性，是三个具有很大潜在价值的药物先导化合物。

[0032] 本发明制备方法简单，重现性好，提取纯度高。获得的化合物具有很好的抗氧化活性作用。

附图说明

[0033] 图1为1的1H-NMR

[0034] 图2为1的13C-NMR

[0035] 图3为1的HSQC

[0036] 图4为1的HMBC

[0037] 图5为2的1H-NMR

[0038] 图6为2的13C-NMR

[0039] 图7为2的HSBC

[0040] 图8为2的HMBC

[0041] 图9为3的1H-NMR

[0042] 图10为3的13C-NMR

[0043] 图11为3的HSBC

[0044] 图12为3的HMBC。具体实施方式：

[0045] 制备实施例1

[0046] 取干燥的猴耳环嫩枝和叶19kg，用6倍量的70％工业乙醇回流提取3次，每次3小时，合并提取液并减压浓缩后得总浸膏1.9kg，总浸膏用10L水混悬后，经D101大孔树脂分别以水和体积分数30％、60％、95％的乙醇水洗脱，得到的水层干浸膏310g，30％层干浸膏107g，60％层干浸膏380g，95％层干浸膏200g。95％乙醇洗脱物采用快速减压柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统50:1、30:1、15:1、8:1、5:1、2:1逐渐洗脱，得到18个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为A1～A5。

[0047] 流分A1(50g)再经ODS柱色谱，以甲醇-水系统40％、50％、60％、70％、80％、90％逐渐洗脱，得到18个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为F1～F3。 流分F2再经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统30:1、15:1、8:1、5:1、3:1、1:1逐渐洗脱，得到24个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为B1～B7。利用HPLC法以甲醇-水系统65％为流动相在B5中制备得到化合物1，甲醇-水系统60％为流动相在B4中制备得到化合物3。

[0048] 流分A2(56g)再经ODS柱色谱，以甲醇-水系统40％、50％、60％、70％、80％逐渐洗脱，得到20个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为C1～C5。流分C2再经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统15:1、8:1、5:1、3:1、2:1、1:1逐渐洗脱，得到24个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为D1～D5。利用HPLC法以甲醇-水系统60％为流动相在D2中制备得到化合物2。

[0049] 制备实施例2

[0050] 取干燥的猴耳环嫩枝和叶17kg，用5倍量的75％工业乙醇回流提取4次，每次2小时，合并提取液并减压浓缩后得总浸膏1.7kg，总浸膏用9L水混悬后，经D101大孔树脂分别以水和体积分数30％、60％、95％的乙醇水洗脱，得到的水层干浸膏300g，30％层干浸膏100g，60％层干浸膏360g，95％层干浸膏190g。95％乙醇洗脱物采用快速减压柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统50:1、30:1、15:1、8:1、5:1、3:1逐渐洗脱，得到18个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为A1～A5。

[0051] 流分A1(40g)再经ODS柱色谱，以甲醇-水系统40％、50％、60％、70％、80％、90％逐渐洗脱，得到16个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为F1～F3。流分F2再经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统35:1、15:1、8:1、5:1、3:1、1:1逐渐洗脱，得到28个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为B1～B7。利用HPLC法以甲醇-水系统65％为流动相在B4中制备得到化合物1，甲醇-水系统63％为流动相在B3中制备得到化合物3。

[0052] 流分A2(45g)再经ODS柱色谱，以甲醇-水系统40％、50％、60％、70％、80％逐渐洗脱，得到15个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为C1～C5。流分C2再经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统15:1、8:1、5:1、3:1、2:1、1:1逐渐洗脱，得到25个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为D1～D5。利用HPLC法以甲醇-水系统65％为流动相在D3中制备得到化合物2。

[0053] 制备实施例3

[0054] 取干燥的猴耳环嫩枝和叶15kg，用7倍量的65％工业乙醇回流提取5次，每次2小时，合并提取液并减压浓缩后得总浸膏1.5kg，总浸膏用8L水混悬后，经D101大孔树脂分别以水和体积分数30％、60％、95％的乙醇水洗脱，得到的水层干浸膏290g，30％层干浸膏90g，60％层干浸膏330g，95％层干浸膏180g。95％乙醇洗脱物采用快速减压柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统35:1、20:1、10:1、5:1、3:1、2:1逐渐洗脱，得到16个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为A1～A5。

[0055] 流分A1(42g)再经ODS柱色谱，以甲醇-水系统40％、50％、60％、70％、80％逐渐洗脱，得到15个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为F1～F3。流分F2再经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统30:1、15:1、8:1、5:1、2:1、1:1逐渐洗脱，得到27个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为B1～B7。利用HPLC法以甲醇-水系统64％为流动相在B5中制备得到化合物1，甲醇-水系统62％为流动相在B4中制备得到化合物3。

[0056] 流分A2(43g)再经ODS柱色谱，以甲醇-水系统40％、50％、60％、70％、80％逐渐洗脱，得到15个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为C1～C5。流分 C2再经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统20:1、10:1、5:1、3:1、2:1、1:1逐渐洗脱，得到26个流分，经硅胶薄层层析检识，将流分合并为D1～D5。利用HPLC法以甲醇-水系统60％为流动相在D2中制备得到化合物2。

[0057] 本发明所述的三个新化合物的结构解析：

[0058] 实验例1：

[0059] 化合物1(6mg)为黄色油状物(甲醇)；高分辨电喷雾离子质谱(HR-ESI-MS)给出准分子离子峰m/z 307.1319[M+Na]+(cal.307.1305)，结合1H NMR、13C NMR谱，确定分子式为C18H20O3；UV(MeOH)在λmax 217,292nm有最大吸收，说明存在苯环骨架；IR(KBr)在3426cm-1有吸收，说明存在羟基,在1495cm-1和820cm-1有吸收，说明存在苯环骨架；在1H NMR谱(400Hz,DMSO-d6,ppm,J in Hz)中，δ：6.94(2H,s,H-6/H-6'),6.93(2H,overlaped,H-4/H-4'),6.76(2H,overlaped,H-3/H-3')为两个1,3,4-苯环取代上的6个质子信号,δ：5.94(1H,ddt,J＝17.0,9.6,6.4Hz,H-8),5.06(1H,br.d,J＝17.0Hz,H-9a),5.00(1H,br.d,J＝9.6Hz,H-9b)为一个末端双键上的三个质子信号,δ：3.74(1H,m,H-8')为一个连氧亚甲基上的2个质子信号,δ：3.27(2H,d,J＝6.4Hz,H-7),2.61(1H,dd,J＝5.8,13.2Hz,H-7'a),2.45(1H,dd,J＝
6.5,13.2Hz,H-7'b)为两个连在苯环上的亚甲基质子信号,δ：1.02(3H,d,J＝5.7Hz,9'-CH3)为一个甲基质子信号；在13C NMR谱(100MHz,DMSO-d6,ppm)中给出18个碳信号，包括12个芳香碳信号δ：126.8(C-1),153.6(C-2),116.2(C-3),128.3(C-4),129.8(C-5),131.7(C-
6),126.3(C-1'),153.8(C-2'),116.6(C-3'),129.3(C-4'),129.8(C-5'),132.5(C-6'),两个双键碳信号δ：138.9(C-8),115.6(C-9),一个连氧碳信号δ：68.1(C-8')和三个烷基碳信号δ：45.2(C-7'),23.5(C-9'),39.3(C-7)。在HMBC谱中，H-7与C-4、C-5、C-6、C-8、C-9有相关，显示烯丙基连在C-5上，H-7'a及H-7'b与C-4'、C-5'、C-6'、C-8'、C-9'有相关，显示另一个三碳链连在C-5'上。由以上推导可确定化合物的结构，分子式为C18H20O3，与HR-ESI-MS所给出的分子式一致。经scifinder文献检索，为一未见报道的新化合物，命名为5-烯丙基-
5'-(2-羟丙基)[1,1'-联苯]-2,2'-二醇。化合物1的碳氢归宿及HMBC相关见Table.1。

[0060] 实验例2：

[0061] 化合物2(9mg)为黄色油状物(甲醇)；高分辨电喷雾离子质谱(HR-ESI-MS)给出准+ 1 13分子离子峰m/z 353.1360[M+Na](calcd for C19H22NaO5,353.1359)，结合 H NMR、C NMR谱，确定分子式为C19H22O5；IR(KBr)在3425cm-1有吸收，说明存在羟基,在1496cm-1和826cm-1有吸收，说明存在苯环骨架；UV(MeOH)在λmax 220,289nm有最大吸收，进一步说明存在苯环骨架；根据1H NMR和13C NMR谱可以看出化合物2与化合物1具有相同的结构特征，只是连在C-5'上的三碳链有所区别，结合HMBC谱可以推出，C-7'上连了一个甲氧基，C-9'由甲基变成了羟甲基，其它信号均与化合物1相同。由以上推导可确定化合物的结构，这也与化合物2分子式为C19H22O5相符，经scifinder文献检索，为一未见报道的新化合物，命名为5-烯丙基-
5'-(2,3-二羟基-1-甲氧基丙基)[1,1-联苯]-2,2'-二醇。化合物2的碳氢归宿及HMBC相关见Table.1。

[0062] 实验例3：

[0063] 化合物3(8mg)为黄色油状物(甲醇)；高分辨电喷雾离子质谱(HR-ESI-MS)给出准分子离子峰m/z 357.1309[M+Na]+(calcd for C18H22NaO6,357.1309)，结合 1H NMR、13C NMR谱，确定分子式为C18H22O6；IR(KBr)在3425cm-1有吸收，说明存在羟基,在1515cm-1和817cm-1有吸收，说明存在苯环骨架；在1H NMR 谱(400Hz,DMSO-d6,ppm,J in Hz)中，δ：6.68(1H,d,J＝1.8Hz,H-2'),6.62(1H,d,J＝8.0Hz,H-5'),6.49(1H,dd,J＝1.8,8.00Hz,H-6'),6.04(2H,s,H-3”,H-5”)为两个苯环上的5个质子信号，δ：3.71(3H,s,3'-OCH3),3.68(3H,s,2”-OCH3),3.67(3H,s,6”-OCH3)为三个甲氧基质子信号；在13C NMR谱(100MHz,DMSO-d6,ppm)中给出18个碳信号，包括12个芳香碳信号δ：131.4(C-1'),113.9(C-2'),147.5(C-3'),144.9(C-4'),115.5(C-5'),121.8(C-6'),106.6(C-1”),159.5(C-2”),90.4(C-3”),157.4(C-4”),94.4(C-5”),159.3(C-6”),三个甲氧基碳信号δ：56.0(3'-OCH3),55.9(2”-OCH3),55.3(6”-OCH3)，一个连氧碳信号δ：72.3(C-2)，两个烷基碳信号δ：31.5(C-3),42.8(C-1)。结合HSQC及HMBC谱确定该化合物的结构，也与化合物3分子式为C18H22O6相符，经scifinder文献检索，为一未见报道的新化合物，命名为1-(3'-甲氧基,4'-羟基苯基)-3-(2”,6”-二甲氧基-4”-羟基苯基)丙烷-2-醇。化合物3的碳氢归宿及HMBC相关见Table.1。

[0064] 表1化合物1-3的1H、13C NMR数据

[0065]

[0066]