一种大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的装置和方法

摘要

本发明公开了一种大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的装置和方法，该装置和方法主要利用了灌注技术并维持细胞存于一个比较好的生长状态，使得瞬时转染的过程进行多次（≥2），而且多次瞬时转染组的细胞状态在连续多次的瞬时转染过程中活率没有明显的下降，增殖没有受到影响，因而能够有效的延长整个工艺的周期，增加重组蛋白的产量，降低重组蛋白的生产成本。

权利要求

1.一种大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的方法，其特征在于，主要包括如下步骤：

（1）提供一大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的装置，安装、连接整套装置并进行高温灭菌；所述大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的装置包括：储液装置、转染复合物混合装置、细胞培养装置、中央控制装置、细胞截留装置、上清液收集装置、细胞收集装置、若干液体无菌推动装置和若干可控速液体流动管道，上述各装置的连接方式为：储液装置通过一第一可控速液体流动管道与细胞培养装置相连，在储液装置与细胞培养装置之间设有一第一液体无菌推动装置；转染复合物混合装置通过一第二可控速液体流动管道与细胞培养装置相连，在转染复合物混合装置与细胞培养装置之间设有一第二液体无菌推动装置；细胞培养装置与中央控制装置通过信号转化输出线相连；细胞培养装置的一端通过一第三可控速液体流动管道与细胞截留装置的截留前部分相连，细胞培养装置的另一端通过一第四可控速液体流动管道与截流后的细胞截留装置相连，在细胞培养装置与截流后的细胞截留装置之间设有一第三液体无菌推动装置；细胞截留装置截留前一端与上清液收集装置相连，在上清液收集装置与截流前的细胞截留装置之间设有一第四液体无菌推动装置；

细胞截留装置截留后另一端通过一第五可控速液体流动管道与细胞收集装置相连，在细胞收集装置与截流后的细胞截留装置之间设有一第五液体无菌推动装置；其中，所述细胞截留装置至少设有细胞混合液入口、细胞上清液出口、细胞回流出口、截留出口，其中细胞混合液入口与细胞培养装置连接，用于将从细胞培养装置中排出的细胞混合液中的细胞进行截留，所述第三可控速液体流动管道设置在所述细胞混合液入口与细胞培养装置之间；细胞上清液出口经所述第四液体无菌推动装置与上清液收集装置连接，使细胞截留装置中的细胞上清液通过所述第四液体无菌推动装置被推入到上清液收集装置中；细胞回流出口经所述第三液体无菌推动装置连接细胞培养装置，用于将细胞截留装置截留下来的细胞通过第三液体无菌推动装置被推入细胞培养装置中；截留出口经所述第五液体无菌推动装置连接于细胞收集装置，用于将细胞截留装置截留下来的细胞通过所述第五液体无菌推动装置被推入到细胞收集装置中；其中，所述可控速液体流动管道为可通过滑动控制阀或夹子控制培养液流速的管道；所述液体无菌推动装置为蠕动泵；

（2）无菌条件下向细胞培养装置中泵入无菌培养液，培养液的量至少能没过检测温度、溶氧、pH的探头，然后进行无菌检测；

（3）在无菌条件下，向细胞培养装置中接种事先培养的、状态良好的待转染的细胞，根据不同细胞、不同质粒确定最佳转染条件，在所述最佳转染条件下将DNA、转染介导试剂、细胞转染液在转染复合物混合装置中孵育并将得到的转染复合物加入到细胞培养装置中；其中，所述最佳转染条件包括质粒浓度，转染试剂与质粒浓度比例，孵育时间；

（4）根据培养细胞的生长特性和细胞培养装置的工作体积，将细胞培养装置的反应器各项理、生、化指标设定在细胞培养和蛋白表达的最佳条件，同时通过中央控制装置控制系统灌注参数，所述系统灌注参数包括反应器的灌注、回流速度、废细胞排出速度；细胞培养装置中的细胞通过细胞截留装置后，启动细胞截留装置的无菌推动装置，将生长快慢不同的细胞均匀的推入细胞截留装置中并根据细胞生长状态需要，部分回流至细胞培养装置中，同时收集上清液进行重组蛋白的检测和纯化；

（5）按照具体的蛋白表达水平的变化，在灌注培养一定时间后，再次加入适量的转染复合物，按照上述步骤（3）中的转染条件再次转染，此过程重复至少一次；

（6）每个工作周期收集细胞培养液进行蛋白含量的检测和后续重组蛋白纯化处理，收集足够的蛋白后，终止细胞培养和蛋白表达过程。

2.根据权利要求1所述的大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的方法，其特征在于，所述的步骤（3）中，待转染的细胞的接种细胞密度为0.05～1×107个细胞/mL。

3.根据权利要求1所述的大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的方法，其特征在于，所述的步骤（3）中，最佳转染条件包括：质粒DNA浓度为0.5-3μg/mL，质粒DNA:转染试剂比例为1:2-10，孵育时间为5-30分钟，以形成稳定的DNA-转染介导试剂复合物。

4.根据权利要求1所述的大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的方法，其特征在于，所述的步骤（4）中，细胞培养和蛋白表达的最佳条件包括：温度为37°C ± 0.2°C，pH值为

7.1 ± 0.1，溶氧为25%～55%，转速为50 150转/分钟。

~

5.根据权利要求1所述的大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的方法，其特征在于，所述的步骤（4）中，所述反应器的灌注、回流速度、废细胞排出速度为0.05-20个反应器培养体积/天。

6.根据权利要求1所述的大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的方法，其特征在于，所述转染过程的重复次数为2次以上。

说明书

一种大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的装置和方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种生物工程领域的装置和方法，具体涉及一种在连续悬浮生物反应器中多次瞬时转染长时间表达重组蛋白的装置和方法。

背景技术

[0002] 转染指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染两大类。瞬时转染过程中外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，在转染后的24小时至96小时内收获细胞，其具体时间取决于细胞类型、载体构建等多种因素。

[0003] 近年来，随着瞬时转染技术和细胞培养技术的发展，已经可以通过对一些普遍使用的细胞系（例如HEK293和CHO细胞）进行悬浮培养，来实现瞬时转染的大规模重组蛋白合成。在合适的情况下选用瞬时表达可以省时省力、节约成本。

[0004] 经过对现有文献的检索发现，Céline Raymond,Roseanne Tom,Sylvie Perret等人.2011年4月在《Methods》上发表的《A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications》一文报告了一种工艺简化的大规模的瞬时转染过程，分别研究了悬浮细胞在孔板和反应器中的瞬时转染表达重组蛋白的过程。但是在生物反应器中的瞬时转染过程只持续了一周且重组蛋白的产量非常有限。文章中大规模的瞬时转染的存在以下缺陷：

[0005] 第一，由于瞬时转染过程中质粒丢失这一特性，瞬时转染技术仅限于实验室水平，工业化推广具有很多局限性；

[0006] 第二，常见的规模化瞬时转染工艺（如batch）一般持续3-7天，周期短，因而造成整个工艺成本高。

[0007] 综上所述，现有的基因瞬时转染表达重组蛋白的方法周期短、产量低、成本高，不适应于工业化规模的生产，难以满足临床前实验对重组蛋白的需求。

发明内容

[0008] 本发明针对现有技术的不足，提供一种连续、生物反应器规模的重组蛋白瞬时转染表达的装置和方法。该方法与传统的瞬时转染方法相比具有周期长，产量高，可自动化等优势，故可以在较短的时间提供比较大量的重组蛋白，用于新药开发与筛选，满足临床前对重组蛋白需求。

[0009] 本发明提供的一种生物反应器规模的大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的装置，包括储液装置、转染复合物混合装置、细胞培养装置、中央控制装置、细胞截留装置、上清液收集装置、细胞收集装置、若干液体无菌推动装置和若干可控速液体流动管道，上述各装置的连接方式为：储液装置通过一第一可控速液体流动管道与细胞培养装置相连，在储液装置与细胞培养装置之间设有一第一液体无菌推动装置；转染复合物混合装置通过一第二可控速液体流动管道与细胞培养装置相连，在转染复合物混合装置与细胞培养装置之间设有一第二液体无菌推动装置；细胞培养装置与中央控制装置通过信号转化输出线相连；细胞培养装置的一端通过一第三可控速液体流动管道与细胞截留装置的截留前部分相连，细胞培养装置的另一端通过一第四可控速液体流动管道与截流后的细胞截留装置相连，在细胞培养装置与截流后的细胞截留装置之间设有一第三液体无菌推动装置；细胞截留装置截留前一端与上清液收集装置相连，在上清液收集装置与截流前的细胞截留装置之间设有一第四液体无菌推动装置；细胞截留装置截留后另一端通过一第五可控速液体流动管道与细胞收集装置相连，在细胞收集装置与截流后的细胞截留装置之间设有一第五液体无菌推动装置。

[0010] 所述储液装置为普通圆柱或方体瓶罐结构或储液袋，用以盛放无菌培养基，其出口与可控速管道体系密封连接，并在该装置上具有接口通过无菌滤膜过滤器连通大气；所述储液装置至少设有三孔，其中一孔可通过可控速液体流动管道将无菌过滤后的培养液注入所述储液装置，另一孔可通过可控速液体流动管道将无菌过滤后的培养液推入细胞培养装置中，又一孔可通过空气过滤装置与外部环境相通；所述储液装置为可高温灭菌装置。

[0011] 所述转染复合物混合装置至少有试剂加入口和复合物出口，并具有自动搅拌混合液体的功能，具体表现为具备搅拌混合功能和计时功能，例如可调节搅拌速率和设定搅拌时间；孵育结束的转染复合物可通过复合物出口经过所述第二可控速液体流动管道进入细胞培养装置。

[0012] 所述细胞培养装置至少设有培养液入口、培养液出口、复合物入口、细胞回流入口、气体（如空气、氧气、二氧化碳、氮气）入口、细胞取样口、碱入口、细胞接种口、探头插入口（如PH、溶氧、温度），可高温灭菌、密闭无菌进行细胞培养；所述细胞培养装置可通过中央控制装置控制细胞培养过程中的各种参数（如PH、溶氧、温度、葡萄糖浓度等）。

[0013] 所述中央控制装置为至少能记录和调节各种培养过程中的物理化学参数（如PH、溶氧、温度、葡萄糖浓度等）的控制器，该中央控制装置可控制细胞培养过程的各种参数，使得细胞最优化的生长或获得目的产物。

[0014] 所述细胞截留装置（如biosep、细胞沉降装置、中空纤维装置等）至少设有细胞混合液入口、细胞上清液出口、细胞回流出口、截留出口，其中细胞混合液入口与细胞培养装置连接，用于将从细胞培养装置中排出的细胞混合液中的细胞进行截留，所述第三可控速液体流动管道设置在所述细胞混合液入口与细胞培养装置之间；细胞上清液出口经所述第四液体无菌推动装置与上清液收集装置连接，使细胞截留装置中的细胞上清液通过所述第四液体无菌推动装置被推入到上清液收集装置中；细胞回流出口经所述第三液体无菌推动装置连接细胞培养装置，用于将细胞截留装置截留下来的细胞通过第三液体无菌推动装置被推入细胞培养装置中；截留出口经所述第五液体无菌推动装置连接于细胞收集装置，用于将细胞截留装置截留下来的细胞通过所述第五液体无菌推动装置被推入到细胞收集装置中。

[0015] 所述上清液收集装置设有瓶盖，所述瓶盖设有液体入口，为至少有二孔的可灭菌储存装置，其中一孔通过可控速液体流动管道与细胞截留装置上部（如细胞上清液出口）相连，细胞培养上清液可通过所述第四液体无菌推动装置的推动作用进入上清液收集装置，另一孔通过空气过滤装置与外部环境相通。

[0016] 所述细胞收集装置为至少有二孔的可灭菌储存装置，其中一孔通过所述第五可控速液体流动管道与细胞截留装置下部（如截留出口）相连，截留后的细胞可通过所述第五液体无菌推动装置的推动作用进入细胞收集装置，另一孔通过空气过滤装置与外部环境相通。

[0017] 所述可控速液体流动管道为可通过滑动控制阀或夹子控制培养液流速的管道，管道例如为硅胶管。

[0018] 所述液体无菌推动装置为可无菌地推动管道内的液体流动的装置，如蠕动泵。

[0019] 本发明提供的上述大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的装置，其原理如下：一种细胞在瞬时转染之后，只有部分细胞会接受外源重组质粒并进行外源质粒转录、表达重组蛋白的过程，因成功接受质粒的细胞的代谢率（如比生长速率、比葡萄糖消耗率、比细胞得率等）要低于未接受质粒的细胞，因而在相同的培养条件下未接受质粒的细胞的生长情况要优于接受质粒的细胞。细胞培养装置中的细胞通过细胞截留装置后，启动细胞截留装置的无菌推动装置（如蠕动泵），将生长快慢不同的细胞均匀的推入细胞截留装置中并根据细胞生长状态需要，部分回流至细胞培养装置中，同时收集上清液进行重组蛋白的检测和纯化。由于未接受质粒的细胞与接受质粒的细胞比生长速率的差别，细胞培养装置中比生长速率大的细胞（未接受重组质粒）数量会越来越多，同时，已经接受外源质粒的细胞因为瞬时转染质粒丢失的特性，随着培养时间的增长，也会随时成为未接受外源质粒的细胞，因而一段时间后，细胞培养装置中的细胞又再次具有了接受重组质粒瞬时转染的能力，此时则可以进行第二次瞬时转染。本发明的这一工艺还利用了灌注技术（perfusion）维持细胞存于一个比较好的生长状态，使得瞬时转染的过程进行多次（≥2），因而能够有效的延长整个工艺的周期，增加重组蛋白的产量，降低重组蛋白的生产成本。

[0020] 本发明的大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的装置工作时，储液装置中的培养液在所述第一液体无菌推动装置作用下，通过所述第一可控速液体流动管道进入细胞培养装置中，而中央控制装置控制细胞培养的各种参数（例如但不限于PH、溶氧、温度等），细胞在中央控制装置控制的细胞培养优化参数条件下生长。当完成第一次瞬时转染时，储液装置内的培养液在所述第一液体无菌推动装置作用下，通过所述第一可控速液体流动管道进入细胞培养装置中，而中央控制装置控制细胞培养的各种参数（例如但不限于PH、溶氧、温度等），细胞在中央控制装置控制的细胞培养优化参数条件下生长；同时，中央控制装置通过连续灌注称的设定重量调控上清液收集装置处的所述第四液体无菌推动装置的速度，使得细胞培养装置的培养液总体积保持不变。细胞截留装置的细胞回流出口与细胞培养装置之间的所述第三液体无菌推动装置（如蠕动泵）的运行速度根据细胞培养要求自行设定，不宜过大或过小（例如在细胞截留装置中，速度过大则回流细胞损伤过大，速度过小则截留效果不佳，导致较多细胞都进入了上清液中）。当细胞培养装置中的细胞密度高于设定的灌注细胞密度时，中央控制装置则启动细胞截留装置的截留出口与细胞收集装置之间的第五液体无菌推动装置（如蠕动泵），将截留的部分细胞推至细胞收集装置中，当细胞培养装置中的细胞密度低于设定的灌注细胞密度时，则关闭细胞截留装置的截留出口与细胞收集装置之间的第五液体无菌推动装置（如蠕动泵），使得细胞密度维持在设定密度不变。通过这一智能的控制过程，细胞可以维持在一个比较好的细胞状态。此时可向转染复合物混合装置再次加入重组质粒、转染介导试剂和细胞转染液，启动定时搅拌功能，制备出新鲜的转染复合物，在所述第二液体无菌推动装置作用下，将转染复合物推入到细胞培养装置中，进行二次转染。二次转染后细胞又进入与一次转染后相似的状态，又可通过中央控制装置调控灌注过程以维持细胞良好的生长、表达状态。同时上清液收集装置可以持续的收集细胞培养上清液，纯化收集上清液中的重组蛋白进行分析、检测以及其它临床前药理、毒理检测。本发明的大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的装置可进行多次转染，而具体的转染次数可根据细胞状态，质粒性质和产品等实际情况进行灵活的确定。

[0021] 本发明的大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的方法主要为利用了灌注（perfusion）技术维持细胞存于一个比较好的生长状态，使得瞬时转染的过程进行多次（≥2次），具体地，使用上述的大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的装置的该方法可以主要包括以下步骤：

[0022] （1）安装、连接上述的大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的整套装置并进行高温灭菌；高温灭菌条件高温灭菌可以是技术人员所熟知的121℃，30min；

[0023] （2）无菌条件下向细胞培养装置中泵入一定量的无菌培养液，培养液的量至少能没过检测探头如检测温度、溶氧、pH的探头，进行无菌检测，例如在37℃条件下进行无菌检测达48小时；

[0024] （3）在无菌条件下，向细胞培养装置里以一定细胞密度接种事先培养的、状态良好的待转染的细胞，并根据不同细胞、不同质粒的最佳转染条件（质粒浓度，转染试剂与质粒浓度比例，孵育时间），将DNA、转染介导试剂，细胞转染液在转染复合物混合装置中混合并孵育后得到的转染复合物加入到细胞培养装置中；通常，接种的待转染细胞密度可以是技术人员熟知的重组质粒细胞转染过程中常见的细胞密度，如0.05～1×107个细胞/mL（按照接种体积计算）；

[0025] （4）根据培养细胞的生长特性和细胞培养装置的工作体积，将细胞培养装置的反应器的各项理、生、化指标设定在细胞培养和蛋白表达的最佳条件，同时通过中央控制装置控制灌注参数，设定该反应器的灌注参数、回流速度、废细胞排出速度等；

[0026] （5）按照具体的蛋白表达水平的变化，在灌注培养一定时间后，再次加入适量的转染复合物，按照上述步骤（3）中的转染条件再次转染，此过程可重复数次；

[0027] （6）每个工作周期例如每日收集细胞培养液进行蛋白含量的检测和后续重组蛋白纯化处理，收集足够的蛋白后，终止细胞培养和蛋白表达过程。

[0028] 所述最佳转染条件（质粒浓度，转染试剂浓度，孵育时间）可以是：质粒DNA浓度为0.5-3μg/mL，DNA:转染介导试剂比例为1:2-1:10，孵育时间为5-30分钟，以形成稳定的DNA-转染介导试剂复合物。转染介导试剂可选用业内常用各种试剂，例如Lipofectamine2000，
25KD PEI，PEI MAX等，但不限于仅为上述试剂。

[0029] 所述的步骤（4）中，细胞培养和蛋白表达的最佳条件可以为技术人员所熟知的各生物反应器细胞培养所设定的温度，PH值，溶氧浓度值等。例如可以是：培养液使用T39（CHO）或Free Style（293），预处理至37℃±0.2℃，PH值7.1±0.1，DO25%～55%，以50～150转的速度实现培养液的指标均匀。

[0030] 所述的步骤（4）中，控制灌注参数是根据细胞生长状况和蛋白表达过程进行试验确定的，其具体数值可由本领域一般技术人员经过试验确定，例如可以是0.05个反应器培养体积/天到20个反应器培养体积/天。

[0031] 所述步骤（5）中，重复瞬时转染过程的重复次数的确定是根据不同的细胞、不同的重组质粒条件下的蛋白表达水平不同，以达到最终收获足量目的蛋白为目的来确定的，可以是2次以上或者更多次的进行转染操作。

[0032] 与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

[0033] 本发明提供的大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的装置和方法与传统的瞬时转染方法相比具有周期长，产量高，可自动化等优势，故可以在较短的时间提供比较大量的重组蛋白，用于新药开发与筛选，满足临床前对重组蛋白需求。

附图说明

[0034] 图1为本发明一实例的大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的装置的示意图；

[0035] 图2为本发明一实例的转染过程中细胞密度与转染后培养天数的变化图；

[0036] 图3为本发明一实例的转染过程中转染效率与转染后培养天数的变化图；

[0037] 图4为本发明一实例的一转染工艺周期过程中累积细胞表达的凝血II因子的总量。

具体实施方式

[0038] 以下结合附图对本发明的一些具体实施方式做详细描述，以助于理解本发明，但以下详细说明内容不用于限定本发明的保护范围。以上的描述大致上说明了本发明的内容，下面的具体实施例将会更直接的体现本发明的情况，但必须指出的是，在此举出的实例仅仅是为了加以说明的目的，本发明并非局限于此。

[0039] 请参见图1，为本发明提供的一种大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的装置的具体结构示意图。如图所示，该装置包括储液装置1、转染复合物混合装置2、细胞培养装置3、中央控制装置4、细胞截留装置5、上清液收集装置6、细胞收集装置7、五个液体无菌推动装置（8、9、10、11、12）、多个可控速液体流动管道；其连接方式为：储液装置1通过一第一可控速液体流动管道（如硅胶管）与细胞培养装置3相连，储液装置与细胞培养装置之间设有一第一液体无菌推动装置9；转染复合物混合装置2通过一第二可控速液体流动管道与细胞培养装置3相连，该两者中间设有一第二液体无菌推动装置8；细胞培养装置3与中央控制装置4通过信号转化输出线相连；细胞培养装置3一端通过一第三可控速液体流动管道与细胞截留装置5截留前部分相连，另一端通过一第四可控速液体流动管道与截流后的细胞截留装置5相连，细胞培养装置3与截流后的细胞截留装置5之间设有一第三液体无菌推动装置12；细胞截留装置5截留前一端与上清液收集装置6相连，上清收集装置6与截流前的细胞截留装置5之间设有一第四液体无菌推动装置10；细胞截留装置5截留后另一端通过一第四可控速液体流动管道与细胞收集装置7相连，细胞收集装置7与截流后的细胞截留装置5之间设有一第五液体无菌推动装置11。

[0040] 其中，细胞截留装置5设有细胞混合液入口、细胞上清液出口、细胞回流出口、截留出口，其中细胞混合液入口通过所述第三可控速液体流动管道与细胞培养装置3连接，用于将从细胞培养装置3中排出的细胞混合液中的细胞进行截留；细胞上清液出口经第四液体无菌推动装置10与上清液收集装置6连接，使细胞截留装置中的细胞上清液通过第四液体无菌推动装置10被推入到上清液收集装置6中；细胞回流出口经第三液体无菌推动装置12连接细胞培养装置3，用于将细胞截留装置5截留下来的细胞经细胞回流出口通过第三液体无菌推动装置12被推入细胞培养装置3中；截留出口经第五液体无菌推动装置11连接于细胞收集装置7，用于将细胞截留装置5截留下来的细胞通过截留出口处的第五液体无菌推动装置11被推入到细胞收集装置7中。

[0041] 在以下的本发明一具体实施例中，液体无菌推动装置均采用蠕动泵。

[0042] 以下以使用本发明的方法瞬时转染表达人重组凝血II因子为例，详细说明本发明的大规模连续多次悬浮瞬转表达重组蛋白的方法。

[0043] 实例：生物反应器连续多次瞬时转染表达人重组凝血II因子

[0044] 细胞：无血清悬浮驯化HEK293细胞株；

[0045] 培养液：美国Sigma生产的Excell293无血清培养液；

[0046] 细胞培养装置：荷兰Applicon公司生产的3L动物细胞反应器；

[0047] 1)接种前的系统的无菌性检测与稳定性检测

[0048] 在荷兰Applicon公司生产的控制塔上设定温度37℃，PH值7.2，溶氧浓度值50%，由恒温水套控制温度，控制塔上的流量阀自动控制CO2、N2、O2三路进气用鼓泡供氧的方法控制溶氧浓度和溶二氧化碳浓度，控制塔上连接有1mol/L NaOH和1mol/L HCL的蠕动泵以控制PH，根据灌注的称重系统信号控制添加培养液到设定值，生物反应器的罐体上同时连接有补充新鲜培养液的入液口，以及用于细胞回流的细胞截留装置，整套装置连接安装好后121℃，高压蒸汽灭菌30min。待冷却后，置于无菌室内，向系统内通入无菌的PBS缓冲液，循环清洗整个系统。随后，排出PBS，加入新鲜培养液，启动控制塔的温度控制与搅拌，持续24h，检查是否染菌和系统运行稳定性。检验无菌后，以80rpm的速度实现培养液的指标均匀。

[0049] 2）细胞的转染前培养及第一次瞬时转染

[0050] 以1×106个细胞/mL的密度制备细胞悬液，向上述3L（工作体积2L）生物反应器中接种细胞悬液至终浓度2.5×105个细胞/mL，批培养48小时后，待细胞扩增到1×106个细胞/mL的密度时进行第一次瞬时转染，本实例选用直接转染法，向转染复合物混合装置（在本实例中为圆柱形装置，有一个进液口和一个出液口，用多孔橡胶塞密封，橡胶塞孔上插入可控速、可定时搅拌装置）中加入重组质粒pGMAX-FII和细胞转染液，120rpm搅拌5min，然后加入转染介导试剂PEI MAX，120rpm搅拌5min，搅拌结束后静置孵育10min。其中质粒pGMAX-FII量为2μg/106个细胞，DNA:PEI=1:2.5。通过蠕动泵将转染复合物推入到细胞培养装置中，细胞进行转染。转染后48小时开启灌注，设定各指标值分别为温度37℃，PH值7.0，溶氧浓度值40%，葡萄糖浓度1.5g/L，通过中央控制系统控制自动调节细胞培养装置的进液口和出液口的蠕动泵转速，以维持设定的细胞生长环境，同时中央控制系统根据生物反应器液位电极和温度，PH，溶氧，溶二氧化碳电极的信号自动调节控制储液装置中培养液添加的蠕动泵的转速和控制装置，以保证培养液的供应。灌注速率设为1个反应器罐体体积/天，废细胞排出速率设为1/3个反应器罐体体积/天。每天收集上清液并于-80℃储存，用于进行下一步的凝血II因子蛋白纯化、质量检验及制剂准备过程。

[0051] 3）细胞多次瞬时转染

[0052] 第一次瞬时转染后第6天，停止灌注培养，丢弃一部分细胞并加入新鲜培养液，调6 6
节细胞密度至1×10个细胞/mL，过夜培养24小时，再次调节细胞至1×10个细胞/mL进行第二次瞬时转染。向转染复合物混合装置（在本实例中为圆柱形装置，有一个进液口和一个出液口，用多孔橡胶塞密封，橡胶塞孔上插入可控速、可定时搅拌装置）中加入重组质粒pGMAX-FII和细胞转染液，120rpm搅拌5min，然后加入转染介导试剂PEI MAX，120rpm搅拌
5min，搅拌结束后静置孵育10min。其中质粒pGMAX-FII量为1.5μg/106个细胞，DNA:PEI=1:
2.5。通过蠕动泵将转染复合物推入到细胞培养装置中，细胞进行转染。转染后48小时开启灌注，灌注培养与第一次瞬时转染培养过程一致。

[0053] 第一次瞬时转染后第13天，重复上述步骤3）所述的第二次瞬时转染的处理过程，在第一次瞬时转染后第14天进行第三次瞬时转染，转染条件和转染后培养条件与第二次瞬时转染过程完全一致。

[0054] 细胞培养过程中每日收集上清液置于-80℃保存，用于进行下一步的凝血II因子蛋白纯化、质量检验及制剂准备过程。

[0055] 4）生产完成

[0056] 培养结束后，关闭反应器并清洗实验设备。

[0057] 本实施例的培养过程参数请参见图2和图3。其中图2所示为上述实例的转染过程中细胞密度与转染后培养天数的变化图。由图2可以看出，在本实例中多次瞬时转染组的细胞状态在连续三次的瞬时转染过程中细胞活率基本平稳，后期出现略微下降，细胞活率在整个转染周期中没有明显的下降，增殖没有受到影响。整个培养过程中细胞保持良好的生长状态，细胞活率保持在90％以上。

[0058] 请参见图3所示，为上述实例的转染过程中转染效率与转染后培养天数的变化图。图中可见，在本实例中，第一次瞬时转染后细胞的转染效率和凝血II因子蛋白表达量呈现先上升后下降的趋势，第二次瞬时转染和第三次瞬时转染后细胞的转染效率和凝血II因子蛋白的表达量出现明显的上升。整个连续多次瞬时转染工艺周期21天，瞬时转染的工艺周期较传统批培养明显延长。

[0059] 请参见图4，其示出了整个工艺周期过程中累积计算细胞表达的凝血II因子的总量,本发明该实例的瞬时转染工艺得到凝血II因子总量比传统瞬时转染工艺增加了97％。

[0060] 以上所示仅为本发明的一个具体实例，在本发明及上述实施例的教导下，本领域技术人员很容易预见到，本发明所列举或例举的各原料或其等同替换物、各加工方法或其等同替换物都能实现本发明，以及各原料和加工方法的参数上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。