一种用于非诊断用途的检测端粒酶活性的方法

摘要

本发明公开了一种检测端粒酶活性的方法，通过带正电基团的聚集诱导发光化合物、端粒酶引物、dNTPs、RNA酶抑制剂以及待测样品在端粒酶扩增缓冲溶液中，23℃～37℃的温度下恒温孵育，使得反应体系中端粒酶引物发生端粒酶延伸反应，再将反应体系于80℃～100℃下灭活，使得延伸反应停止；由于DNA分子磷酸骨架带有负电荷，随着端粒酶引物序列的延长，每条链上能够结合的聚集诱导发光化合物增加，反应溶液中的荧光效果也增强，通过检测反应溶液中的荧光强度即可检测待测样品中的端粒酶活性。通过本发明，可以实现对端粒酶活性的特异性检测。

权利要求

1.一种用于非诊断用途的检测端粒酶活性的方法，其特征在于，具体步骤为：步骤一：将待测样本、端粒酶引物、AIE染料以及端粒酶扩增试剂混合成为反应体系；其中，所述端粒酶引物的核苷酸序列如SEQ NO:1所示，所述AIE染料为带正电基团的聚集诱导发光化合物；

步骤二：将所述反应体系先于23℃～37℃下恒温孵育，使端粒酶引物的核苷酸序列在端粒酶的催化下发生延伸反应，AIE染料通过静电引力聚集于所述核苷酸序列而发出荧光；

再于80℃～100℃下灭活，使得延伸反应停止；

步骤三：检测反应体系中荧光强度的变化值，得知待测样本中的端粒酶活性。

2.如权利要求1所述检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述端粒酶扩增试剂包括dNTPs、RNA酶抑制剂以及端粒酶扩增缓冲溶液。

3.如权利要求1所述检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述待测样本为细胞的端粒酶提取物。

4.如权利要求1所述检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述AIE染料在反应体系中的浓度为1μM～100μM。

5.如权利要求1所述检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述AIE染料为TPE-Z，其结构式如下所示或为SiloleR，其结构式如下所示

6.如权利要求1所述检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述端粒酶引物核苷酸序列的5’端修饰有猝灭基团，和/或3’端修饰有荧光基团。

7.如权利要求6所述检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述猝灭基团为Dabcyl。

8.如权利要求1所述检测端粒酶活性的方法，其特征在于，以肿瘤细胞的端粒酶提取物作为阳性对照。

9.一种以权利要求1-8中任意一项所述方法检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于，包括：带正电基团的聚集诱导发光化合物、端粒酶引物、dNTPs、RNA酶抑制剂以及端粒酶扩增缓冲溶液。

说明书

一种用于非诊断用途的检测端粒酶活性的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物检测领域，更具体地，涉及一种检测端粒酶活性的方法。

背景技术

[0002] 真核生物的细胞染色体末端具有端粒结构，它是由重复DNA序列与蛋白质构成的复合物。端粒在细胞染色体中起重要作用，可以维持染色体完整与稳定，其长度反映了细胞继续复制的潜在可能性。端粒能够防止染色体末端DNA碱基对自然丢失时影响有意义的基因序列的结构。因此，随着细胞分裂的持续进行，正常细胞的端粒会不断缩短，最终过短的端粒会使细胞无法继续分裂，从而使细胞寿命受到限制，防止细胞过度分裂。

[0003] 1984年，Ssampay等发现了由蛋白质与一段短RNA链组成的核糖核蛋白酶——端粒酶，它是一种能够在真核生物染色体末端DNA重复添加序列(TTAGGG)n并使DNA得以延长的逆转录酶。端粒酶在肿瘤细胞中大量表达且活性明显增强，而在正常组织细胞中活性极低甚至无活性，这一特点使得端粒酶的检测成为了肿瘤检测与治疗中的新课题。

[0004] 端粒酶本身带有一段模板RNA，利用这段RNA，端粒酶能够在端粒末端逆转录合成端粒DNA的重复序列，以此维持端粒长度，目前对端粒酶的检测方法皆基于此特性。最早的端粒酶活性检测方法为端粒重复序列延伸法，该方法灵敏度低，检测时间长，检测所需样品量大，但检测中放射性同位素用量较高，易污染环境。常用的端粒酶活性检测方法还包括荧光素标记的端粒重复序列扩增法和杂交保护法等，但这两种方法对微量端粒酶活性的定量检测结果不可靠或灵敏度较低。转录介导的扩增/杂交保护法虽然特异性好、灵敏度高，但需要用到特殊仪器，且所需探针难以获取，因而不易推广。

[0005] 在泌尿外科肿瘤领域，由于患者的尿液中含有脱落细胞，对新鲜尿液中细胞的端粒酶的检测，可以对泌尿肿瘤的诊断起到参考作用。这作为一种无创检查手段，在膀胱癌等泌尿肿瘤的早期诊断中有着重要意义。

发明内容

[0006] 针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种检测端粒酶活性的方法，其目的在于端粒酶能够延长引物序列，而使引物序列上结合的AIE染料聚集发光，由此解决对端粒酶活性特异性检测的技术问题。

[0007] 为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种检测端粒酶活性的方法，其特征在于，利用端粒酶引物的核苷酸序列在端粒酶的催化下延伸的特性，使得AIE染料聚集于延伸的核苷酸序列而发出荧光；通过荧光强度得知端粒酶的活性；

[0008] 其中，所述端粒酶引物核苷酸序列包括如SEQ NO:1所示的序列；所述AIE染料为带正电基团的聚集诱导发光化合物，正电基团用于与带负电荷的核苷酸序列相结合。

[0009] 优选地，该方法的具体步骤为：

[0010] 步骤一：将待测样本、端粒酶引物、AIE染料以及端粒酶扩增试剂混合成为反应体系；

[0011] 步骤二：将所述反应体系先于23℃～37℃下恒温孵育，使端粒酶引物发生延伸反应，再于80℃～100℃下灭活，使得延伸反应停止；

[0012] 步骤三：检测反应体系中荧光强度的变化值，得知待测样本中的端粒酶活性。

[0013] 作为进一步优选地，所述端粒酶扩增试剂包括dNTPs、RNA酶抑制剂以及端粒酶扩增缓冲溶液。

[0014] 作为进一步优选地，反应体系中dNTPs的浓度为0.05mM～2.0mM，RNA酶抑制剂的浓度为0.1U/μL～1.0U/μL，端粒酶引物的浓度为1.0μM～10.0μM；端粒酶扩增缓冲溶液包括10mM～40mM的Tris、1.0mM～2.0mM的MgCl2，pH值为7.0～8.0。

[0015] 作为进一步优选地，所述待测样本为细胞的端粒酶提取物。

[0016] 作为进一步优选地，待测样本的提取方法为，4℃以下离心分离出细胞后用CHAPS裂解液裂解细胞，再离心后取上清液即得所需待测样本；上述细胞包括人体中取样或者自然脱落的细胞，例如尿液中的沉降细胞、膀胱洗出液中的细胞、外周血细胞、活检组织等；其中CHAPS裂解液包括10mM pH7.5的Tris-HCl、1mM MgCl2、1mM EGTA、0.1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、5mMβ-巯基乙醇、质量分数为0.5％的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)以及质量分数为10％的甘油。

[0017] 作为进一步优选地，所述AIE染料在反应体系中的浓度为1μM～100μM。

[0018] 优选地，AIE染料为TPE-Z，其结构式如下所示

[0019]

[0020] 或为SiloleR，其结构式如下所示

[0021]

[0022] 为了达到降低背景荧光、提高检测特异性的效果，可以在端粒酶引物的核苷酸序列的5’端修饰猝灭基团，使得体系中不存在端粒酶时，AIE染料的背景荧光由于荧光共振能量转移(FRET)效应而降低，加入端粒酶后，端粒酶引物发生延伸反应，AIE染料与猝灭基团之间的距离增大，FRET效应减弱，体系荧光大幅增加。同时，为了获得不同发射波长的荧光检测效果，可以在端粒酶引物的核苷酸序列的3’端修饰荧光基团，使得体系中不存在端粒酶时，荧光基团的背景荧光较低，而加入端粒酶后，端粒酶引物发生延伸反应，每根端粒酶引物上聚集的AIE染料分子数目增大，AIE染料与荧光基团间的FRET效应增强，使得荧光基团的荧光强度增大。

[0023] 优选地，所述核苷酸序列的5’端修饰有猝灭基团，和/或3’端修饰有荧光基团。

[0024] 作为进一步优选地，所述核苷酸序列的5’端修饰有猝灭基团且3’端修饰有荧光基团。

[0025] 作为进一步优选地，所述猝灭基团为Dabcyl。

[0026] 优选地，由于体外培养的肿瘤细胞中含有大量的端粒酶，检测中以肿瘤细胞的端粒酶提取物作为阳性对照，例如E-J细胞、MCF-7细胞、HeLa细胞。

[0027] 按照本发明的另一方面还提供了一种以上述方法检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于，包括：带正电基团的聚集诱导发光化合物、端粒酶引物、dNTPs、RNA酶抑制剂以及端粒酶扩增缓冲溶液，所述端粒酶引物核苷酸序列包括如SEQ NO:1所示的序列。

[0028] 总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于利用了带正电基团的聚集诱导发光化合物能与带负电的DNA分子磷酸骨架结合的特性，能够取得下列有益效果：

[0029] 1、利用端粒酶特异性对端粒酶引物序列的延伸，从而使聚集诱导发光化合物聚集发出荧光，实现了特异性的检测；

[0030] 2、AIE染料与端粒酶引物之间通过静电引力连接，无需共价键连接，操作简便；

[0031] 3、优选在端粒酶引物的核苷酸序列的5’端修饰猝灭基团，或在3’端修饰荧光基团，利用FRET效应进一步提高了检测的灵敏度和特异性；

[0032] 4、检测限低，可检测出低至10个肿瘤细胞中提取的端粒酶。

附图说明

[0033] 图1为本发明的原理示意图；

[0034] 图2为实施例1-3中对不同样本进行检测的结果；

[0035] 图3为实施例4-6对膀胱癌细胞E-J、子宫颈癌细胞HeLa、乳腺癌细胞MCF-7进行检测所得的浓度曲线，其中I为实验组在478nm处的荧光强度，I0为对照组在478nm处的荧光强度；N表示细胞个数；误差棒为3组平行实验的标准差；

[0036] 图4为实施例7对23例膀胱癌病人清尿样本和18例膀胱癌病人血尿样本进行检测的结果。

具体实施方式

[0037] 按照本发明的一个方面，提供了一种检测端粒酶活性的方法，其特征在于，利用端粒酶引物的核苷酸序列在端粒酶的催化下延伸的特性，使得AIE染料聚集于延伸的核苷酸序列而发出荧光；通过荧光强度得知端粒酶的活性；

[0038] 其中，所述端粒酶引物核苷酸序列包括如SEQ NO:1所示的序列；所述AIE染料为带正电基团的聚集诱导发光化合物，正电基团用于与带负电荷的核苷酸序列相结合。

[0039] 优选地，该方法的具体步骤为：

[0040] 步骤一：将待测样本、端粒酶引物、AIE染料以及端粒酶扩增试剂混合成为反应体系；

[0041] 步骤二：将所述反应体系先于23℃～37℃下恒温孵育，使端粒酶引物发生延伸反应，再于80℃～100℃下灭活，使得延伸反应停止；

[0042] 步骤三：检测反应体系中荧光强度的变化值，得知待测样本中的端粒酶活性。

[0043] 作为进一步优选地，所述端粒酶扩增试剂包括dNTPs、RNA酶抑制剂以及端粒酶扩增缓冲溶液。

[0044] 作为进一步优选地，反应体系中dNTPs的浓度为0.05mM～2.0mM，RNA酶抑制剂的浓度为0.1U/μL～1.0U/μL，端粒酶引物的浓度为1.0μM～10.0μM；端粒酶扩增缓冲溶液包括10mM～40mM的Tris、1.0mM～2.0mM的MgCl2，pH值为7.0～8.0。

[0045] 作为进一步优选地，所述待测样本为细胞的端粒酶提取物。

[0046] 作为进一步优选地，待测样本的提取方法为，4℃以下离心分离出细胞后用CHAPS裂解液裂解细胞，再离心后取上清液即得所需待测样本；上述细胞包括人体中取样或者自然脱落的细胞，例如尿液中的沉降细胞、膀胱洗出液中的细胞、外周血细胞、活检组织等；其中CHAPS裂解液包括10mM pH7.5的Tris-HCl、1mM MgCl2、1mM EGTA、0.1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、5mMβ-巯基乙醇、质量分数为0.5％的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)以及质量分数为10％的甘油。

[0047] 作为进一步优选地，所述AIE染料在反应体系中的浓度为1μM～100μM。

[0048] 优选地，AIE染料为TPE-Z，其结构式如下所示

[0049]

[0050] 或为SiloleR，其结构式如下所示

[0051]

[0052] 为了达到降低背景荧光、提高检测特异性的效果，可以在端粒酶引物的核苷酸序列的5’端修饰猝灭基团，使得体系中不存在端粒酶时，AIE染料的背景荧光由于荧光共振能量转移(FRET)效应而降低，加入端粒酶后，端粒酶引物发生延伸反应，AIE染料与猝灭基团之间的距离增大，FRET效应减弱，体系荧光大幅增加。同时，为了获得不同发射波长的荧光检测效果，可以在端粒酶引物的核苷酸序列的3’端修饰荧光基团，使得体系中不存在端粒酶时，荧光基团的背景荧光较低，而加入端粒酶后，端粒酶引物发生延伸反应，每根端粒酶引物上聚集的AIE染料分子数目增大，AIE染料与荧光基团间的FRET效应增强，使得荧光基团的荧光强度增大。

[0053] 优选地，所述核苷酸序列的5’端修饰有猝灭基团，和/或3’端修饰有荧光基团。

[0054] 作为进一步优选地，所述核苷酸序列的5’端修饰有猝灭基团且3’端修饰有荧光基团。

[0055] 作为进一步优选地，所述猝灭基团为Dabcyl。

[0056] 优选地，由于体外培养的肿瘤细胞中含有大量的端粒酶，检测中以肿瘤细胞的端粒酶提取物作为阳性对照，例如E-J细胞、MCF-7细胞、HeLa细胞。

[0057] 按照本发明的另一方面还提供了一种以上述方法检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于，包括：带正电基团的聚集诱导发光化合物、端粒酶引物、dNTPs、RNA酶抑制剂以及端粒酶扩增缓冲溶液，所述端粒酶引物核苷酸序列包括如SEQ NO:1所示的序列。

[0058] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

[0059] 实施例1

[0060] 步骤一：端粒酶提取物的制备

[0061] 首先利用CHAPS法分别提取膀胱癌细胞E-J、乳腺癌细胞MCF-7、子宫颈癌细胞HeLa以及人胚肺成纤维细胞中的端粒酶。将含有待测样本细胞的胰蛋白酶溶液置于离心管中，以160g离心5min，弃去上清液，细胞用PBS洗3次，每次洗涤后均以160g离心5min，并取第3次洗涤后含有细胞的PBS悬液10μL进行计数。将细胞加入一定体积RNA酶抑制剂处理过的冰镇CHAPS裂解液中，控制浓度为5000个细胞/μL，将混合物置于冰中反应30min，然后在4℃下以12000g离心20min，取上清液，即为端粒酶提取物，将其储存于-75℃下备用。其中CHAPS裂解液包括10mM pH7.5的Tris-HCl、1mM MgCl2、1mM EGTA、0.1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、5mMβ-巯基乙醇、质量分数为0.5％的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)以及质量分数为10％的甘油。

[0062] 步骤二：端粒酶引物的延伸

[0063] 取10只0.2mL EP离心管，分别加入荧光染料SiloleR、端粒酶引物(序列为：5’-Dabcyl-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’)、dNTPs、RNA酶抑制剂、步骤一制备的端粒酶提取物以及端粒酶扩增缓冲溶液，调整一个反应体系的总体积为50μL。其中端粒酶扩增缓冲溶液包括20mM的Tris、1.5mM的MgCl2，pH值为7～8。一个反应体系中包括40.0μM的SiloleR、2μM的端粒酶引物、1mM的dNTPs、20U的RNA酶抑制剂以及相当于10000个细胞的端粒酶提取物。将反应体系37℃下恒温孵育1h使得引物发生端粒酶延伸反应；再在94℃下灭活10min，使得端粒酶失活，延伸反应停止。

[0064] 步骤三：荧光检测

[0065] 立即向反应体系中加入150μL超纯水，并在荧光光谱仪上测量荧光值。荧光检测所用仪器为荧光分光光度计(Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer，Agilent Technologies)。荧光仪的参数设置如下：激发狭缝宽度为10nm，发射狭缝宽度为5nm，电压600V，激发波长360nm，发射波长扫描范围400nm～600nm；用350μL石英比色皿进行测量。

[0066] 实施例2

[0067] 以所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，待测样本为膀胱癌细胞E-J、乳腺癌细胞MCF-7以及子宫颈癌细胞HeLa；步骤一之后，还进行了端粒酶的热灭活，即将端粒酶提取物在94℃水浴中保持20min，使端粒酶失活；步骤二中一个反应体系中包括相当于10000个细胞的端粒酶提取物。

[0068] 实施例3

[0069] 以所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，不经过步骤一而直接进入步骤二，分别以8U/μL BstDNA聚合酶2μL、0.05％胰蛋白酶2μL、1μM凝血酶2μL、1mg/mL牛血清白蛋白2μL，以及细胞裂解缓冲液2μL代替端粒酶提取物。

[0070] 实施例1-3的荧光检测结果如图2所示。其中，A为提取自膀胱癌细胞E-J的活性端粒酶，B为提取自膀胱癌细胞E-J的热灭活端粒酶，C为提取自乳腺癌细胞MCF-7的活性端粒酶，D为提取自乳腺癌细胞MCF-7的热灭活端粒酶，E为提取自子宫颈癌细胞HeLa的活性端粒酶，F为提取自子宫颈癌细胞HeLa的热灭活端粒酶，G为提取自人胚肺成纤维细胞的活性端粒酶，H为细胞裂解缓冲液，I为Bst DNA聚合酶，J为胰蛋白酶，K为凝血酶，L为牛血清白蛋白。误差棒为3组平行实验的标准差。可以看出，由于肿瘤细胞中含有大量的端粒酶，提取自膀胱癌细胞E-J、乳腺癌细胞MCF-7以及子宫颈癌细胞HeLa的活性端粒酶的荧光强度对比值明显高于其它组，证明该检测方法对活性端粒酶具有较好的特异性。

[0071] 实施例4

[0072] 步骤一：端粒酶提取物的制备

[0073] 首先利用CHAPS法提取样本细胞膀胱癌细胞E-J中的端粒酶。将含有膀胱癌细胞E-J的胰蛋白酶溶液置于离心管中，以160g离心5min，弃去上清液，细胞用PBS洗3次，每次洗涤后均以160g离心5min，并取第三次含有细胞的PBS悬液10μL进行计数。将细胞加入一定体积RNA酶抑制剂处理过的冰镇CHAPS裂解液中，控制浓度为5000个细胞/μL，将混合物置于冰中反应30min，然后在4℃下以12000g离心20min，取上清液，即为端粒酶提取物，将其储存于-75℃下备用。

[0074] 步骤二：端粒酶引物的延伸

[0075] 取10只0.2mL EP离心管，分别加入荧光染料TPE-Z、端粒酶引物(序列为：5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’)、dNTPs、RNA酶抑制剂、步骤一制备的端粒酶提取物以及端粒酶扩增缓冲溶液，调整一个反应体系的总体积为50μL。其中端粒酶扩增缓冲溶液包括20mM的Tris、1.5mM的MgCl2，pH值为7～8。一个反应体系中包括31.2μM的TPE-Z、2μM的端粒酶引物、1mM的dNTPs、20U的RNA酶抑制剂以及步骤一制备的端粒酶提取物；端粒酶提取物在反应体系中的量分别相当于(0、10、25、100、250、500、1000、2500、5000和10000个膀胱癌细胞E-J的端粒酶提取物，以端粒酶扩增缓冲溶液补足反应体系的体积至50μL。将反应体系37℃下恒温孵育1h使得引物发生端粒酶延伸反应；再在94℃下灭活10min，使得端粒酶失活，延伸反应停止。

[0076] 步骤三：荧光检测

[0077] 立即向反应体系中加入150μL超纯水，并在荧光光谱仪上测量荧光值。荧光检测所用仪器为荧光分光光度计(Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer，Agilent Technologies)。荧光仪的参数设置如下：激发和发射狭缝宽度均为10nm，电压700V，激发波长350nm，发射波长扫描范围400nm～600nm；用350μL石英比色皿进行测量。检测结果如图3a所示，其中I为实验组在478nm处的荧光强度，I0为对照组(即端粒酶提取物含量为0时)在478nm处的荧光强度，N表示细胞个数，误差棒为3组平行实验的标准差。可以看出细胞数量越多，I/I0越大，I/I0值与细胞个数的对数值基本呈线性关系，并且细胞数量为10时，荧光值即与对照组有明显区别，证实该方法可检测出低至10个肿瘤细胞中提取的端粒酶。

[0078] 实施例5

[0079] 以所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，以子宫颈癌细胞HeLa取代膀胱癌细胞E-J，检测结果如图3b所示。

[0080] 实施例6

[0081] 以所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，以乳腺癌细胞MCF-7取代膀胱癌细胞E-J。端粒酶提取物在反应体系中的量分别相当于0、10、100、1000和10000个乳腺癌细胞MCF-7的端粒酶，检测结果如图3c所示。

[0082] 从图3b和图3c中可以得出与图3a类似的检测结果，证实用该方法检测多种肿瘤细胞中的端粒酶，都有较好的相关性效果。而肿瘤细胞端粒酶提取物的荧光强度结果，可作为待测样本的检测结果的阳性对照。

[0083] 实施例7

[0084] 步骤一：取新鲜尿液样本，在4℃下以850g离心10min，用PBS洗涤一次，再于4℃下以2300g离心5min。弃去上清液，将细胞分散于200μL细胞裂解液中，于冰中孵育30min。将混合物于4℃下以10000g离心20min，取上清液，即为尿液样本端粒酶提取物，置于-75℃下保存。

[0085] 其中，新鲜尿液样本为不同地区、不同类型的膀胱癌病人尿液样本，尿液中的端粒酶提取物即为尿中的沉降细胞的端粒酶提取物；包括18例南昌清尿样本、5例武汉清尿样本、10例南昌血尿样本和8例武汉血尿样本。

[0086] 步骤二：以所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，尿液样本端粒酶提取物在反应体系中的量为5μL。

[0087] 步骤三：以所述的相同步骤重复实施例1。

[0088] 图4a为23例清尿和18例血尿样本于478nm处的荧光峰值，图中虚线为本方法检测限，其计算方法为I0+3σ，误差棒为3组平行实验的标准差；图4b为不同尿液样本478nm处的荧光峰值统计图。可以看出，全部清尿样本及大部分血尿样本的荧光峰值都在检测限之上，证实该方法可用于检测尿液样本提取的端粒酶提取物。

[0089] 实施例8

[0090] 一种检测端粒酶活性的试剂盒，包括：反应试剂100份、阳性对照样本和阴性对照样本；阳性对照样本为膀胱癌细胞E-J的端粒酶提取物；阴性对照为端粒酶扩增缓冲溶液；储存于-75℃以下。

[0091] 其中，每一份反应试剂包括：100μM端粒酶引物分子1μL，序列为5’-Eclipse-AATCCGTCGAGCAGAGTT-FAM-3’；40U/μLRNA酶抑制剂0.5μL；780μMTPE-Z2μL；10mM的dNTPs 5μL；端粒酶扩增缓冲溶液,包括20mM的Tris、1.5mM的MgCl2，pH值为7～8；

[0092] 使用时，按实施例7所述的相同步骤进行，并以阳性对照和阴性对照样本对荧光强度结果进行对比验证。

[0093] 通过以上实施例可以看出，用本发明的方法可以特异性地检测端粒酶的活性，且荧光强度与端粒酶浓度正相关。

[0094] 本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。