本发明公开了一种制备构树体细胞胚的方法及其在构树扩繁中的应用。本发明提供了一种制备构树体细胞胚的方法，包括如下步骤：(1)将构树的胚性愈伤组织加至培养基乙中进行培养；所述培养基乙为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和30g/L蔗糖的1/2MS培养基；(2)完成步骤(1)后，将培养体系转接至培养基丙中进行培养；所述培养基丙为含0.5mg/L NAA、0.2mM TDZ、0.4mg/L IBA、0.4mg/L 6-BA和30g/L蔗糖的1/2MS培养基。本发明首次完成了构树从外植体高效诱导体细胞并液体悬浮培养的整个技术体系，为大规模工厂化生产提供技术，解决了构树种苗制备繁琐和市场紧缺的问题。
(Ⅰ)取构树无菌苗的叶片，切成0.5×0.5cm2，接种到培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天；
(Ⅱ)取步骤(Ⅰ)得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天；
(Ⅲ)取步骤(Ⅱ)得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天；
(Ⅳ)将1g步骤(Ⅲ)得到的胚性愈伤组织加至10ml培养基乙中，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(Ⅴ)完成步骤(Ⅳ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(Ⅵ)完成步骤(Ⅴ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(Ⅶ)完成步骤(Ⅵ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(Ⅷ)完成步骤(Ⅶ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(Ⅸ)将1体积份步骤(Ⅷ)得到的培养体系与2体积份培养基丙混合，23±2℃、12小时光照/12小时黑暗、100rpm振荡培养30天；
所述培养基甲为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的MS培养基；
所述培养基乙为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和30g/L蔗糖的1/2MS培养基；所述培养基丙为含0.5mg/L NAA、0.2mM TDZ、0.4mg/L IBA、0.4mg/L 6-BA和30g/L蔗糖的1/2MS培养基；
步骤(Ⅸ)中，所述光照的条件为1500-2000lx。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(Ⅸ)中，所述光照的条件为1500lx。
(1)将构树的胚性愈伤组织加至培养基乙中进行培养；所述培养基乙为含0.5mg/L 2,
4-二氯苯氧乙酸和30g/L蔗糖的1/2MS培养基；
(2)完成步骤(1)后，将培养体系转接至培养基丙中进行培养；所述培养基丙为含
0.5mg/L NAA、0.2mM TDZ、0.4mg/L IBA、0.4mg/L 6-BA和30g/L蔗糖的1/2MS培养基。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述构树的胚性愈伤组织的制备方法如下：取构树的外植体，接种到培养基甲上，进行培养；所述培养基甲为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的MS培养基。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述构树的胚性愈伤组织的制备方法如下：①取构树的外植体，接种到培养基甲上，培养；
②取步骤①得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，培养；
③取步骤②得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，培养；
所述培养基甲为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的MS培养基。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述构树的外植体为构树无菌苗的叶或构树无菌苗的茎。
7.如权利要求3至5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)包括如下步骤：
(1-1)将1g构树的胚性愈伤组织加至10ml所述培养基乙中，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(1-2)完成步骤(1-1)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(1-3)完成步骤(1-2)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(1-4)完成步骤(1-3)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(1-5)完成步骤(1-4)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天。
8.如权利要求3至5中任一所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述培养的条件为：23±2℃、12小时光照/12小时黑暗、振荡培养30天。
按照权利要求1至8中任一所述的方法制备构树体细胞胚；
将所述构树体细胞胚放入海藻酸钠溶液中并室温浸泡3-4min，然后转移至0.5g/100mL CaCl2水溶液中并室温浸泡3min，得到人工种子；
将所述人工种子置于培养基丁上，24℃、12小时光照/12小时黑暗、静置培养30d；
所述培养基丁为含0.5mg/L NAA、0.5mg/L 6-BA、1mg/L GA3、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/
10.一种制备构树体细胞胚的试剂盒，由培养基甲、培养基乙和培养基丙组成；
所述培养基甲为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的MS培养基；
所述培养基乙为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和30g/L蔗糖的1/2MS培养基；所述培养基丙为含0.5mg/L NAA、0.2mM TDZ、0.4mg/L IBA、0.4mg/L 6-BA和30g/L蔗糖的1/2MS培养基。
11.一种扩繁构树的试剂盒，由权利要求10所述的制备构树体细胞胚的试剂盒和培养基丁组成；所述培养基丁为含0.5mg/L NAA、0.5mg/L 6-BA、1mg/L GA3、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基。
一种制备构树体细胞胚的方法及其在构树扩繁中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备构树体细胞胚的方法及其在构树扩繁中的应用。
背景技术
[0002] 构树又称楮树，Broussoneti Papyrifera(L)Vent，属桑科植物的落叶乔木，各种类型的土壤几乎都能生长，极少病虫害，耐干冷，耐湿热，根系发达，是保护生态环境和水土保持的一种优良树种。构树一年栽植，多年收获。构树全身都能利用：树皮纤维洁白、细长，是高档的造纸和纺织原料，价值高，市场需求量大；木杆是生产纸张、纤维板的好原料；树叶含有丰富的粗蛋白、氨基酸、微量元素，是动物的优质饲料原料。采用高密度栽培技术种植构树，亩产韧皮纤维200公斤，木杆1500公斤，优质饲料树叶1500公斤。由于构树具有绿化和其他经济价值，市场对于构树种苗的需求非常大，每年将达到2000万株。
[0003] 目前构树的种苗制备主要靠扦插和组培苗供应。扦插存在着季节性、场地占用面积大、效率低等问题。常规组培方法存在着人工成本高、劳动量大、成本高等问题。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种制备构树体细胞胚的方法及其在构树扩繁中的应用。
[0005] 本发明提供了一种制备构树体细胞胚的方法(方法甲)，包括如下步骤：
[0006] (Ⅰ)取构树无菌苗的叶片，切成0.5×0.5cm2，接种到培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天；
[0007] (Ⅱ)取步骤(Ⅰ)得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天；
[0008] (Ⅲ)取步骤(Ⅱ)得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天；
[0009] (Ⅳ)将1g步骤(Ⅲ)得到的胚性愈伤组织加至10ml培养基乙中，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
[0010] (Ⅴ)完成步骤(Ⅳ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
[0011] (Ⅵ)完成步骤(Ⅴ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
[0012] (Ⅶ)完成步骤(Ⅵ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
[0013] (Ⅷ)完成步骤(Ⅶ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
[0014] (Ⅸ)将1体积份步骤(Ⅷ)得到的培养体系与2体积份培养基丙混合，23±2℃、12小时光照/12小时黑暗、100rpm振荡培养30天；
[0015] 所述培养基甲为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的MS培养基；所述培养基乙为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和30g/L蔗糖的1/2MS培养基；所述培养基丙为含0.5mg/L NAA、0.2mM TDZ、0.4mg/L IBA、0.4mg/L 6-BA和30g/L蔗糖的1/2MS培养基。
[0016] 步骤(Ⅸ)中，所述光照的条件可为1500-2000lx，具体可为1500lx。
[0017] 本发明还提供了另一种制备构树体细胞胚的方法(方法乙)，包括如下步骤：
[0018] (1)将构树的胚性愈伤组织加至培养基乙中进行培养；所述培养基乙为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和30g/L蔗糖的1/2MS培养基；
[0019] (2)完成步骤(1)后，将培养体系转接至培养基丙中进行培养；所述培养基丙为含0.5mg/L NAA、0.2mM TDZ、0.4mg/L IBA、0.4mg/L 6-BA和30g/L蔗糖的1/2MS培养基。
[0020] 方法乙中，所述构树的胚性愈伤组织的制备方法如下：取构树的外植体，接种到培养基甲上，进行培养；所述培养基甲为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的MS培养基。
[0021] 方法乙中，所述构树的胚性愈伤组织的制备方法如下：
[0022] ①取构树的外植体，接种到培养基甲上，培养；
[0023] ②取步骤①得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，培养；
[0024] ③取步骤②得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，培养；
[0025] 所述培养基甲为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的MS培养基。
[0026] 所述构树的外植体为构树无菌苗的叶或构树无菌苗的茎。所述构树的外植体具体如下：取构树无菌苗的叶片，切成0.5×0.5cm2。所述构树的外植体具体如下：取构树无菌苗的茎，切成1cm的茎段。
[0027] ①、②和③中，所述培养的条件均为：23±2℃黑暗培养25天。
[0028] 所述步骤(1)具体包括如下步骤：
[0029] (1-1)将1g构树的胚性愈伤组织加至10ml所述培养基乙中，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
[0030] (1-2)完成步骤(1-1)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
[0031] (1-3)完成步骤(1-2)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
[0032] (1-4)完成步骤(1-3)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
[0033] (1-5)完成步骤(1-4)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天。
[0034] 所述步骤(2)中，所述培养的条件为：23±2℃、12小时光照/12小时黑暗、振荡培养30天。
[0035] 所述步骤(2)中，培养体系和所述培养基丙的配比为：
[0036] 1体积份培养体系：2体积份培养基丙。
[0037] 所述步骤(2)中，所述振荡培养具体可为100rpm振荡培养。
[0038] 所述步骤(2)中，所述光照的条件可为1500-2000lx，具体可为1500lx。
[0039] 本发明还保护一种扩繁构树的方法，包括如下步骤：将以上任一所述方法制备得到的构树体细胞胚放入海藻酸钠溶液中并室温浸泡3-4min，然后转移至0.5g/100mL水CaCl2溶液中并室温浸泡3min，得到人工种子；
[0040] 将所述人工种子置于培养基丁上，24℃、12小时光照/12小时黑暗、静置培养30d；
[0041] 所述培养基丁为含0.5mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA、1mg/L GA3、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基。
[0042] 所述海藻酸钠溶液中，海藻酸钠的浓度可为2.0g/100mL-3.5g/100mL。
[0043] 所述海藻酸钠溶液具体如下：将海藻酸钠溶于1/2MS培养基，得到3.0g/100mL的海藻酸钠溶液。
[0044] 所述光照的条件可为1500-2000lx，具体可为1500lx。
[0045] 本发明还保护一种制备构树体细胞胚的试剂盒，由所述培养基甲、所述培养基乙和所述培养基丙组成。
[0046] 本发明还保护一种扩繁构树的试剂盒，由所述培养基甲、所述培养基乙、所述培养基丙和所述培养基丁组成。
[0047] 本发明中，首先利用构树无菌苗的愈伤组织建立悬浮体细胞胚培养体系并优化培养条件，可以短时间内获得大量体细胞胚，进一步将体细胞胚制备为人工种子，再进一步培育人工种子得到了构树幼苗。本发明首次完成了构树从外植体高效诱导体细胞并液体悬浮培养的整个技术体系，为大规模工厂化生产提供技术，解决了构树种苗制备繁琐和市场紧缺的问题。
具体实施方式
[0048] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。本实施例中所用的构树为大连中植环境生物科技有限公司培育的快活林品牌杂交构树。
[0049] 实施例1、制备体细胞胚
[0050] 1、制备胚性愈伤组织
[0051] (1)取构树无菌苗的叶片，切成0.5×0.5cm2，接种到培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天。此时可以观察到从叶片切口处生长出浅黄色愈伤组织，即胚性愈伤组织。
[0052] (2)取步骤(1)得到的胚性愈伤组织，接种到培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天。
[0053] (3)取步骤(2)得到的胚性愈伤组织，接种到培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天。
[0054] 实际操作中，可以持续按照步骤(2)的方法进行继代培养。
[0055] 培养基甲(固体)：含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的MS培养基。
[0056] 2、液体悬浮培养
[0057] (1)将1g步骤1的(3)得到的胚性愈伤组织加至10ml培养基乙中，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天。
[0058] (2)完成步骤(1)后，将1体积份培养体系与1体积份培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天。
[0059] (3)完成步骤(2)后，将1体积份培养体系与1体积份培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天。
[0060] (4)完成步骤(3)后，将1体积份培养体系与1体积份培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天。
[0061] (5)完成步骤(4)后，将1体积份培养体系与1体积份培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天。
[0062] 实际操作中，可以按照步骤(2)的方法进行3-5次继代培养，得到稳定的悬浮细胞体系。
[0063] 培养基乙(液体)：含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和30g/L蔗糖的1/2MS培养基。
[0064] 3、制备体细胞胚
[0065] 将1体积份步骤2的(5)得到的培养体系与2体积份培养基丙混合，23±2℃、12小时光照(光照强度为1500lx)/12小时黑暗、100rpm振荡培养30天，此时培养体系中体细胞胚的浓度大于等于15000个/L。
[0066] 培养基丙(液体)：含0.5mg/L NAA(α-萘乙酸)、0.2mM TDZ(thidiazuron)、0.4mg/LIBA(3-吲哚丁酸)、0.4mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤)和30g/L蔗糖的1/2MS培养基。
[0067] 实施例2、体细胞胚植株再生
[0068] 将海藻酸钠溶于1/2MS培养基，得到海藻酸钠溶液。
[0069] 1、将实施例1得到的体细胞胚放入3.0g/100mL的海藻酸钠溶液中并室温浸泡3-4min，然后转移至0.5g/100mL CaCl2水溶液中并室温浸泡3min，形成具有一定硬度的人工种子，然后用无菌去离子水冲洗3-4次以终止反应，置于无菌纸上吸去人工种子表面水分。
[0070] 2、将人工种子置于培养基丁上，24℃、12小时光照(本实施例中的光照强度为1500lx；实际操作中，光照强度为1500-2000lx均可)/12小时黑暗、静置培养30d。
[0071] 培养基丁(固体)：含0.5mg/L NAA、0.5mg/L 6-BA、1mg/L GA3(赤霉素)、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基。
[0072] 进行三次重复实验。
[0073] 三次重复实验中，人工种子的萌发率依次为92％、93％、91％，成活率依次为75％、74％、75％。结果表明，人工种子的萌发率达到90％以上，成活率达到70％以上。
[0074] 对比例、
[0075] 一、对比实验一
[0076] 1、制备胚性愈伤组织
[0077] (1)取构树无菌苗的叶片，切成0.5×0.5cm2，接种到培养基甲Ⅰ上，23±2℃黑暗培养25天。
[0078] (2)取步骤(1)得到的胚性愈伤组织，接种到培养基甲Ⅰ上，23±2℃黑暗培养20天。
[0079] (3)取步骤(2)得到的胚性愈伤组织，接种到培养基甲Ⅰ上，23±2℃黑暗培养20天。
[0080] 培养基甲Ⅰ(固体)：含0.6mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、32g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的MS培养基。
[0081] 2、液体悬浮培养
[0082] (1)将1g步骤1的(3)得到的胚性愈伤组织加至10ml培养基乙Ⅰ中，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养20天。
[0083] (2)完成步骤(1)后，将1体积份培养体系与1体积份培养基乙Ⅰ混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养20天。
[0084] (3)完成步骤(2)后，将1体积份培养体系与1体积份培养基乙Ⅰ混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养20天。
[0085] (4)完成步骤(3)后，将1体积份培养体系与1体积份培养基乙Ⅰ混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养20天。
[0086] (5)完成步骤(4)后，将1体积份培养体系与1体积份培养基乙Ⅰ混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养20天。
[0087] (6)完成步骤(5)后，将1体积份培养体系与1体积份培养基乙Ⅰ混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养20天。
[0088] 培养基乙Ⅰ(液体)：含0.6mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和32g/L蔗糖的1/2MS培养基。
[0089] 3、制备体细胞胚
[0090] 将1体积份步骤2的(6)得到的培养体系与2体积份培养基丙Ⅰ混合，23±2℃、12小时光照(光照强度为1500lx)/12小时黑暗、100rpm振荡培养32天，此时培养体系中体细胞胚的浓度为10000-12000个/L。
[0091] 培养基丙Ⅰ(液体)：含0.6mg/L NAA、0.25mM TDZ(thidiazuron)、0.5mg/L IBA、0.5mg/L 6-BA和32g/L蔗糖的1/2MS培养基。
[0092] 二、对比实验二
[0093] 1、制备胚性愈伤组织
[0094] (1)取构树无菌苗的叶片，切成0.5×0.5cm2，接种到培养基甲Ⅱ上，23±2℃黑暗培养25天。
[0095] (2)取步骤(1)得到的胚性愈伤组织，接种到培养基甲Ⅱ上，23±2℃黑暗培养30天。
[0096] (3)取步骤(2)得到的胚性愈伤组织，接种到培养基甲Ⅱ上，23±2℃黑暗培养30天。
[0097] 培养基甲Ⅱ(固体)：含0.4mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、28g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的MS培养基。
[0098] 2、液体悬浮培养
[0099] (1)将1g步骤1的(3)得到的胚性愈伤组织加至10ml培养基乙Ⅱ中，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养30天。
[0100] (2)完成步骤(1)后，将1体积份培养体系与1体积份培养基乙Ⅱ混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养30天。
[0101] (3)完成步骤(2)后，将1体积份培养体系与1体积份培养基乙Ⅱ混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养30天。
[0102] (4)完成步骤(3)后，将1体积份培养体系与1体积份培养基乙Ⅱ混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养30天。
[0103] 培养基乙Ⅱ(液体)：含0.4mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和28g/L蔗糖的1/2MS培养基。
[0104] 3、制备体细胞胚
[0105] 将1体积份步骤2的(4)得到的培养体系与2体积份培养基丙Ⅱ混合，23±2℃、12小时光照(光照强度为1500lx)/12小时黑暗、100rpm振荡培养28天，此时培养体系中体细胞胚的浓度为9000-11000个/L。
[0106] 培养基丙Ⅱ(液体)：含0.4mg/L NAA、0.15mM TDZ(thidiazuron)、0.3mg/L IBA、0.3mg/L 6-BA和28g/L蔗糖的1/2MS培养基。
