一种造影材料、其制备方法及应用

摘要

本申请公开了一种超声、磁共振及荧光的多模态靶向型造影材料、其制备方法及应用。该造影材料理化性质稳定，可提供更快捷、精确、高解析度、高分辨率的成像效果，可广泛用于生物分析、医学诊断与成像等领域。

权利要求

1.一种造影材料，其特征在于，所述造影材料为至少包裹有亲水性磁性纳米粒子和气体A的牛血清白蛋白微球；所述牛血清白蛋白微球表面含有牛血清白蛋白中的赖氨酸残基与至少含有2个醛基的化合物交联形成的西佛碱；所述牛血清白蛋白微球表面含有具有肿瘤靶向功能的靶向配基；

所述亲水性磁性纳米粒子为亲水性聚合物包覆的磁性纳米粒子，所述亲水性聚合物任选自葡聚糖及其衍生物、壳聚糖及其衍生物、纤维素及其衍生物中的一种或几种，所述磁性纳米粒子任选自具有磁性的金属氧化物纳米粒子中的一种或几种；所述气体A任选自空气、氮气、氦气、氩气、二氧化碳中的一种或几种；

所述磁性纳米粒子任选自铁的氧化物纳米粒子、钴的氧化物纳米粒子、镍的氧化物纳米粒子中的一种或几种；

所述具有肿瘤靶向功能的靶向配基为叶酸活性酯；

所述至少含有2个醛基的化合物任选自碳原子为2～20含有2个醛基的化合物。

2.根据权利要求1所述的造影材料，其特征在于，所述造影材料的粒径为0.5μm～3μm。

3.根据权利要求1所述的造影材料，其特征在于，所述亲水性聚合物任选自右旋糖酐、右旋糖酐衍生物中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的造影材料，其特征在于，所述磁性纳米粒子优选为Fe3O4和/或γ-Fe2O3纳米粒子。

5.根据权利要求1所述的造影材料，其特征在于，所述至少含有2个醛基的化合物优选为戊二醛。

6.一种制备权利要求1所述造影材料的方法，其特征在于，至少含有如下步骤：a)向分散有磁性纳米粒子的体系中，加入亲水性聚合物，搅拌均匀后，经磁分离、洗涤后，得到亲水性磁性纳米粒子；

b)将步骤a)所得到的亲水性磁性纳米粒子，加入到含有牛血清白蛋白和至少含有2个醛基的化合物的液相体系中，混合均匀后，在与液相体系表面接触的气体中含有气体A的条件下，对气、液两相界面进行超声处理，得到包裹有亲水性磁性纳米粒子和气体A且表面含有西佛碱的牛血清白蛋白微球；

c)将含有具有肿瘤靶向功能的靶向配基的化合物与步骤b)所得到的包裹有亲水性磁性纳米粒子和气体A且表面含有西佛碱的牛血清白蛋白微球混合均匀，经过分离得到所述造影材料。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤a)所述亲水性聚合物与磁性纳米粒子的质量比不小于1∶5。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤a)所述亲水性磁性纳米粒子为包覆右旋糖酐的磁性纳米粒子。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤b)所述含有牛血清白蛋白和至少含有

2个醛基的化合物的液相体系，为牛血清白蛋白和至少含有2个醛基的化合物溶解于磷酸缓冲盐溶液后形成。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤c)所述含有具有肿瘤靶向功能的靶向配基的化合物为叶酸活性酯。

11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤c)所述分离，方法为透析分离和/或柱层析分离。

12.权利要求1-5所述任一造影材料或根据权利要求6-11所述任一方法制备的造影材料在制备检测肿瘤的荧光造影材料方面的应用。

13.权利要求1-5所述任一造影材料或根据权利要求6-11所述任一方法制备的造影材料在制备检测肿瘤的超声造影材料方面的应用。

14.权利要求1-5所述任一造影材料或根据权利要求6-11所述任一方法制备的造影材料在制备检测肿瘤的磁共振造影材料方面的应用。

说明书

一种造影材料、其制备方法及应用

技术领域

[0001] 本申请涉及一种造影材料，具体涉及一种可用于超声、磁共振及荧光的多模态靶向型造影材料。

背景技术

[0002] 癌症已成为世界范围内危害人类生命与健康的重大疾病之一，近三十年来癌症已成为人类第一位死因，超过艾滋病、结核、疟疾致死病例的总和。目前针对癌症最好的治疗手段即早发现、早治疗。按目前的医疗水平，80％～90％早期癌症病人是可以治愈的。据报道，世界水平的癌症检测，可发现15mm左右大小的早期肿瘤细胞，而在我国，通过仪器可以发现的，大概是几厘米以上的中晚期肿瘤细胞，因此造影剂的造影信号增强功能作用显得尤为重要。但目前上市的造影剂只针对单一检测模式，靶向能力差，很难或无法到达肿瘤病灶部位发挥造影效果。

[0003] 为实现肿瘤早期的准确诊断，减少多次用药产生的毒副作用，多模态成像技术应运而生，它通过将多种成像诊断模式相互融合以达到取长补短，优势互补的目的。随着多模态成像技术的发展，为提高新型成像设备的临床和经济效益，迫切需要开发与多模态成像系统相应的新型多模态造影剂，即只需使用一种造影剂则可实现两种或多种成像功能。它能够提供更快捷、精确、高解析度、高分辨率的结构与功能成像。随着可视化治疗技术的发展，兼具成像、靶向、甚至治疗功能的多模态造影剂已成为当前生物医学领域的研究前沿与热点。因此，为提高肿瘤诊断效率、降低毒副作用、提升造影材料的靶向能力，有必要发展一种水溶性好、造影功能强的靶向型多模态造影材料。

发明内容

[0004] 为解决上述问题，本申请的一个目的在于提供一种超声、磁共振及荧光的多模态靶向型造影材料，以提高肿瘤诊断效率、降低毒副作用、提升造影材料的靶向能力。所述造影材料为至少包裹有亲水性磁性纳米粒子和气体A的牛血清白蛋白微球；所述牛血清白蛋白微球表面含有牛血清白蛋白中的赖氨酸残基与至少含有2个醛基的化合物交联形成的西佛碱；所述牛血清白蛋白微球表面含具有肿瘤靶向功能的靶向配基；所述亲水性磁性纳米粒子为亲水性聚合物包覆的磁性纳米粒子，所述亲水性聚合物任选自葡聚糖及其衍生物、壳聚糖及其衍生物、纤维素及其衍生物中的一种或几种，所述磁性纳米粒子任选自具有磁性的金属氧化物纳米粒子中的一种或几种；所述气体A任选自空气、氮气、氦气、氩气、二氧化碳中的一种或几种。

[0005] 优选地，所述造影材料的粒径为0.5μm～3μm。进一步优选地，所述造影材料的粒径范围上限任选自2.5μm、2μm、1.5μm或1.3μm；粒径范围下限任选0.8μm或1μm。

[0006] 所述亲水性磁性纳米粒子为亲水性聚合物包覆的磁性纳米粒子，其中亲水性聚合物与磁性纳米粒子的质量比不小于1∶5；优选地，亲水性聚合物与磁性纳米粒子的质量比为1∶4～2∶1；进一步优选地，亲水性聚合物与磁性纳米粒子的质量比为1∶3～2∶1；进一步优选地，亲水性聚合物与磁性纳米粒子的质量比为1∶2～1∶1。

[0007] 优选地，所述牛血清白蛋白微球中的亲水性磁性纳米粒子的质量百分含量为10～95％。进一步优选地，所述牛血清白蛋白微球中的亲水性磁性纳米粒子的质量百分含量范围上限任选自90％、85％、80％、75％、70％、65％；下限任选自15％、20％、25％、30％、35％、
40％、45％。

[0008] 所述牛血清白蛋白微球表面所含有的牛血清白蛋白中的赖氨酸残基与至少含有2个醛基的化合物形成的西佛碱，由含有2个醛基的化合物中的任一个醛基与赖氨酸残基的氨基中的氮原子，通过-N＝C-双键连接形成。优选地，所述牛血清白蛋白微球表面所含的西佛碱与牛血清白蛋白中赖氨酸残基的摩尔比例不小于1∶9；进一步优选地，所述牛血清白蛋白微球表面所含的西佛碱与牛血清白蛋白中赖氨酸残基的摩尔比例为3∶7～7∶3；进一步优选地，所述牛血清白蛋白微球表面所含的西佛碱与牛血清白蛋白中赖氨酸残基的摩尔比例为2∶3～3∶2。

[0009] 优选地，所述牛血清白蛋白微球表面的靶向配基在所述牛血清白蛋白微球中的质量占比为1～20％。进一步优选地，所述牛血清白蛋白微球表面的靶向配基在所述牛血清白蛋白微球中的质量占比范围上限任选自20％、18％、15％；下限任选自1％、3％或5％。

[0010] 优选地，所述亲水性聚合物任选自右旋糖酐、右旋糖酐衍生物中的一种或几种。

[0011] 本申请中，所述磁性纳米粒子任选自含有铁磁性的物质，优选地，任选自铁的氧化物纳米粒子、钴的氧化物纳米粒子、镍的氧化物纳米粒子中的一种或几种。

[0012] 本申请中，所述磁性纳米粒子具有纳米尺度的粒径。根据本领域公职常识，纳米尺度为1nm至100nm。本领域技术人员，可以根据实际检测的需要，在1nm至100nm范围内选择合适尺度的磁性纳米粒子。优选地，所述亲水性磁性纳米粒子的粒径范围为5～25nm。

[0013] 优选地，所述磁性纳米粒子为Fe3O4和/或γ-Fe2O3纳米粒子。

[0014] 优选地，所述至少含有2个醛基的化合物任选自碳原子为2～20含有2个醛基的化合物。碳原子为2～20含有2个醛基的化合物，指碳原子数为2～20含有2个醛基的有机物，所述有机物可以仅含有两个醛基官能团，也可以包含其他官能团，如脂基、羧基、卤素取代基等等。所述有机物的结构式即可以为直链也可以含有支链。

[0015] 优选地，所述至少含有2个醛基的化合物所含碳原子数的上限任选自18、15、10；所述至少含有2个醛基的化合物所含碳原子数的下限任选自3、5、8。

[0016] 优选地，所述至少含有2个醛基的化合物为戊二醛。

[0017] 本申请中，所述具有肿瘤靶向功能的靶向配基是指能够针对已经明确的致癌位点(肿瘤细胞内部的一个蛋白分子，或者一个基因片段)结合发生作用的基团。

[0018] 优选地，所述具有肿瘤靶向功能的靶向配基为与牛血清白蛋白偶联的叶酸。

[0019] 本申请又一目的在于提供一种制备所述造影材料的方法，其特征在于，至少含有如下步骤：

[0020] a)向分散有磁性纳米粒子的体系中，加入亲水性聚合物，搅拌均匀后，经磁分离、洗涤后，得到亲水性磁性纳米粒子；

[0021] b)将步骤a)所得到的亲水性磁性纳米粒子，加入到含有牛血清白蛋白和至少含有2个醛基的化合物的液相体系中，混合均匀后，在与液相体系表面接触的气体中含有气体A的条件下，对气、液两相界面进行超声处理，得到包裹有亲水性磁性纳米粒子和气体A且表面含有西佛碱的牛血清白蛋白微球；

[0022] c)将含有肿瘤靶向功能的靶向配基的化合物与步骤b)所得到的包裹有亲水性磁性纳米粒子和气体A且表面含有西佛碱的牛血清白蛋白微球混合均匀，经过分离得到所述造影材料。

[0023] 本申请中，步骤a)亲水性磁性纳米粒子的制备过程中，亲水聚合物的加入量应能够充分包覆磁性纳米粒子，在此范围内，本领域技术人员可以根据具体的要求，选择合适的亲水性聚合物与磁性纳米粒子的比例。优选地，步骤a)所述亲水性聚合物与磁性纳米粒子的质量比不小于1∶5。进一步优选的范围为，所述亲水性聚合物与磁性纳米粒子的质量比为1∶2～1∶1。

[0024] 优选地，步骤a)所述亲水性聚合物为右旋糖酐和/或右旋糖酐的衍生物。

[0025] 优选地，步骤a)所述亲水性磁性纳米粒子为包覆右旋糖酐的磁性纳米粒子。

[0026] 优选地，步骤a)所述分散有磁性纳米粒子的体系的制备至少含有以下步骤：在充满气体A的容器中，搅拌条件下，向含有金属离子的溶液滴加氨水至沉淀完全后，持续搅拌一段时间，即得所述分散有磁性纳米粒子的体系；所述金属离子任选自二价钴离子、三价钴离子、二价铁离子、三价铁离子或二价镍离子中的至少一种；所述持续搅拌一段时间，为在30～80℃下持续搅拌0.5～24小时。优选地，在30～60℃下持续搅拌0.5～12小时；进一步优选地，在40～60℃下持续搅拌0.5～2小时。

[0027] 优选地，步骤b)所述含有牛血清白蛋白和至少含有2个醛基的化合物的液相体系，为牛血清白蛋白和至少含有2个醛基的化合物溶解于pH为6.5～7.5磷酸缓冲盐溶液后形成。

[0028] 优选地，步骤b)所述亲水性磁性纳米粒子与液相体系中牛血清白蛋白的质量比为0.1～19。进一步优选地，所述亲水性磁性纳米粒子与液相体系中牛血清白蛋白的质量比例范围上限任选自18、15、12或10；下限任选自0.2、0.5、1、2、5、6或8。

[0029] 优选地，步骤b)所述含有牛血清白蛋白和至少含有2个醛基的化合物的液相体系中，牛血清白蛋白的质量浓度为1～8％；至少含有2个醛基的化合物的体积浓度为3～6％。

[0030] 根据本领域公知常识，步骤b)中所述对气、液两相界面进行超声处理，指在气、液两相界面处放置频率高于20000赫兹的超声波。优选地，所使用的超声波频率范围为20K～25K赫兹。

[0031] 优选地，步骤c)所述含有肿瘤靶向功能的靶向配基的化合物为叶酸活性酯。所述叶酸活性脂由叶酸、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺反应制备得到。叶酸活性酯与牛血清白蛋白通过脱除酰胺基的偶联反应，连接在牛血清白蛋白的微球表面。

[0032] 优选地，步骤c)中，将含有肿瘤靶向功能的靶向配基的化合物与步骤b)所得到的包裹有亲水性磁性纳米粒子和气体A且表面含有西佛碱的牛血清白蛋白微球混合均匀，避光反应一段时间后，经过分离得到所述造影材料。

[0033] 优选地，所述避光反应的时间为4～48小时；进一步优选的范围为8～36小时；进一步优选的范围为12～24小时。

[0034] 优选地，步骤c)所述分离方法为透析分离和/或柱层析分离。

[0035] 作为本申请一个优选的实施方式，所述造影材料的制备过程为：

[0036] (1)制备右旋糖酐包裹的Fe3O4纳米粒子：向250mL三角烧瓶通入氮气(N2)10～30min备用，称取二价铁盐(FeCl2·6H2O)0.25～0.35g，按摩尔比(二价铁盐∶三价铁盐＝1∶1～1∶2)称取适量三价铁盐，混匀后溶解于30～50mL水中，置于N2保护的三角烧瓶中并快速搅拌(200～1000rpm)，以0.2～2mL/s速度滴加30～80mL氨水至混合溶液中，30～60℃温度下快速搅拌10～60min；搅拌完成后按质量比称取适量右旋糖酐滴加至混合溶液中，30～60℃温度下快速搅拌30～120min；所得混合溶液经磁分离，8000～15000rpm离心沉淀，用去离子水清洗1～3次后重悬，滴加柠檬酸0.004～0.009g，0～4℃保存。

[0037] (2)超声空化法制备包裹有右旋糖酐的Fe3O4磁性纳米粒子和氮气且表面含有西佛碱的牛血清白蛋白微球：称取质量分数(1～8％)的牛血清白蛋白(BSA)溶解于1～5mL的PBS缓冲液中混匀，同时加入适量戊二醛溶液并混匀，静置20～60sec；滴加步骤(1)所得的右旋糖酐包裹Fe3O4纳米粒子0.5～2mL至混合溶液中并混匀；将超声探头置于液相与气相(N2)界面表层，超声后取出超声探头，收集包裹有右旋糖酐的Fe3O4磁性纳米粒子和氮气且表面含有西佛碱的牛血清白蛋白微球的微泡并0～4℃保存。

[0038] (3)步骤(2)所得牛血清白蛋白微球表面的叶酸偶联：称取叶酸0.2～0.4g，溶于5～20mL的无水二甲亚砜(DMSO)中，滴加三乙胺20～60μL避光搅拌，完全溶解后滴加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.05～0.15g和二环己基碳二亚胺(DCC)0.1～0.2g到混合溶液中并继续避光反应过夜，次日抽虑后所得叶酸活性酯；滴加0.5～2mL叶酸活性酯到步骤(2)中收集的微泡1～4mL中，室温避光反应30～120min，经透析，柱分离后所得即所述造影材料。

[0039] 所述步骤(2)中超声探头的直径为4～8mm。

[0040] 所述步骤(2)中超声时间为10～180sec，有效超声时间为20～50sec。

[0041] 所述步骤(3)叶酸∶NHS∶DCC摩尔比为1∶1∶1～1∶1.5∶1.5。

[0042] 根据本领域公职常识，所述右旋糖酐是一种由许多葡萄糖分子构成且支链的葡聚糖，化学式可简写为H(C6H10O5)xOH。

[0043] 所述西佛碱也称席夫碱，含有N＝C双键。本申请中，牛血清白蛋白微球表面的赖氨酸残基与至少含有2个醛基的化合物交联形成西佛碱，由至少含有2个醛基的化合物中的醛基碳原子，与牛血清白蛋白微球表面的赖氨酸残基的氨基中的氮原子，通过-N＝C-双键连接形成。所述具有肿瘤靶向功能的靶向配基，即与牛血清白蛋白偶联的叶酸，通过叶酸活性酯与牛血清白蛋白上的氨基发生偶联反应得到。

[0044] 本申请中，MRI为核磁共振成像的简写；BSA为牛血清白蛋白的简写；PBS缓冲液为磷酸缓冲盐溶液的简写；GA为戊二醛的简写；FA为叶酸的简写。

[0045] 本申请所述技术方案的有益效果为：

[0046] (1)所提供的造影材料，具有粒径分布均匀、尺寸可控、水溶性好、生物相容性好等优点；

[0047] (2)所提供的造影材料，均可用于磁共振成像造影剂、超声成像造影剂、荧光造影剂及靶向药物以及细胞分离等方面；

[0048] (3)所提供的造影材料，具有医学MRI、超声及荧光造影功能，与医学上临床应用的MRI、超声及荧光造影剂相比，造影性能得到显著提高，可用于肿瘤的早期发现和诊断。

[0049] (4)所提供的制备造影材料的方法，采用温和水相体系，方法简单，易于扩大化生产。

[0050] 应理解，在本申请披露的技术方案范围内，本申请的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

[0051] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

附图说明

[0052] 图1是样品1#的结构示意图和实施例1中主要制备过程示意图；(a)为结构示意图，(b)为制备过程示意图。

[0053] 图2是样品1#的粒径分布图。

[0054] 图3是牛血清白蛋白-戊二醛荧光光谱图；(a)为激发波长为468nm牛血清白蛋白、戊二醛、牛血清白蛋白-戊二醛的荧光光谱图；(b)为激发波长为536nm牛血清白蛋白、戊二醛、牛血清白蛋白-戊二醛的荧光光谱图；(c)为激发波长为630nm牛血清白蛋白、戊二醛、牛血清白蛋白-戊二醛的荧光光谱图。

[0055] 图4是样品1#的细胞毒性分析图。

[0056] 图5是样品1#的超声成像图；(a)为对比图；(b)为包裹有右旋糖酐的Fe3O4磁性纳米粒子和氮气且表面含有西佛碱的牛血清白蛋白微球的微泡超声成像图。

[0057] 图6是样品1#的荧光成像图；(a)为荧光显微镜普通视野下的成像图；(b)为荧光显微镜在激发波长为536nm下的绿色荧光成像图；(c)为荧光显微镜在激发波长为630nm下的红色荧光成像图；(d)为b图和c图的合并图。

[0058] 图7是样品1#的磁共振成像图。

具体实施方式

[0059] 本申请提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

[0060] 下面结合实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

[0061] 未做特殊说明的情况下，本申请所使用原料，均通过商业途径购买，不经特殊处理直接使用。

[0062] 未做特殊说明，实施例中采用的仪器及测试条件如下：

[0063] 样品制备过程中，采用Biosafer900-92型超声仪在气、液两相界面处加入超声波，超声波范围为20K～25K赫兹。

[0064] 粒径分布在zetasizer Nano ZS型动态光散射粒度分析仪上进行材料粒径测试。

[0065] 荧光光谱分析在日立F-4600型荧光光谱仪进行样品光谱分析。

[0066] 细胞毒性分析利用MTT法在UV754PC型紫外可见分光光度计上进行细胞毒性分析。

[0067] 超声成像分析在DP-10型迈瑞超声诊断仪上进行样品成像研究。

[0068] 荧光成像分析在LWD300-38LFT型倒置荧光显微镜上进行样品成像研究。

[0069] 磁共振成像分析在Micro MR型低场磁共振成像仪上进行样品成像研究。

[0070] 实施例1样品1#的制备

[0071] (1)制备右旋糖酐包覆的Fe3O4纳米粒子：向250mL三角烧瓶通入氮气30min备用，称取二价铁盐(FeCl2·4H2O)0.2982g，称取三价铁盐(FeCl3·6H2O)0.5406g，混匀后溶解于30mL水中，置于N2保护的三角烧瓶中并快速搅拌(800rpm)，以1mL/s速度滴加10mL氨水至混合溶液中，50℃温度下快速搅拌30min；搅拌完成后按质量比称取0.15g右旋糖酐滴加至混合溶液中，50℃温度下快速搅拌60min；所得混合溶液经磁分离，10000rpm离心沉淀，用去离子水清洗1～3次后，加入30ml超纯水重悬，滴加柠檬酸0.006g，得到含有右旋糖酐包裹Fe3O4纳米粒子的液体，于4℃保存。

[0072] (2)称取质量分数为5％的牛血清白蛋白0.05g溶于1mL由十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠配置pH为7.2的PBS缓冲液中混匀，同时加入120μL质量浓度为25％戊二醛溶液并混匀，静置60sec；滴加步骤(1)所得的含有右旋糖酐包裹Fe3O4纳米粒子的液体1mL至混合溶液中并混匀；将超声探头置于液相与气相氮气界面处，超声60sec后取出超声探头，得到具有包裹右旋糖酐包覆的Fe3O4纳米粒子和氮气且表面含有西佛碱的牛血清白蛋白微球的体系。

[0073] (3)称取叶酸0.25g，溶于10mL的无水二甲亚砜(DMSO)中，滴加三乙胺40μL避光搅拌，完全溶解后滴加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.1g和二环己基碳二亚胺(DCC)0.15g到混合溶液中并继续避光反应过夜，次日抽虑后所得叶酸活性酯；滴加0.005g叶酸活性酯到步骤(2)所得体系2mL中，室温避光反应60min，经透析、柱分离后，所得即为包裹右旋糖酐包裹的Fe3O4纳米粒子和氮气、表面含有西佛碱和叶酸靶向配基的牛血清白蛋白微球材料，记为样品1#。所得样品1#的结构示意图见图1(a)，步骤(2)和(3)的示意图见图1(b)。

[0074] 实施例2样品2#的制备

[0075] (1)制备右旋糖酐包裹的γ-Fe2O3纳米粒子：向250mL三角烧瓶通入氮气(N2)10～30min备用，称取二价铁盐(FeCl2·6H2O)0.5964g，称取1.0812g三价铁盐(FeCl3·6H2O)，混匀后溶解于60mL水中，置于N2保护的三角烧瓶中并快速搅拌(1000rpm)，以1.2mL/s速度滴加60mL氨水(20％)至混合溶液中，95℃温度下加热回流90min；搅拌完成后称取0.32g右旋糖酐滴加至混合溶液中，50℃温度下快速搅拌30min；所得混合溶液经磁分离，12000rpm离心沉淀，用去离子水清洗1～3次后加入60ml超纯水重悬，滴加柠檬酸0.012g，得到含有右旋糖酐包裹γ-Fe2O3纳米粒子的液体，于4℃保存。

[0076] (2)称取质量分数为5％的牛血清白蛋白(BSA)0.05g溶于1mL由十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠配置pH为6.8的PBS缓冲液中混匀，同时加入120μL质量浓度为25％戊二醛溶液并混匀，静置60sec；滴加步骤(1)所得的含有右旋糖酐包裹γ-Fe2O3纳米粒子的液体1mL至混合溶液中并混匀；将超声探头置于液相与气相(N2)界面表层，超声60sec后取出超声探头，得到具有包裹右旋糖酐包覆的γ-Fe2O3纳米粒子和氮气且表面含有西佛碱的牛血清白蛋白微球的体系。

[0077] (3)称取叶酸0.25g，溶于10mL的无水二甲亚砜(DMSO)中，滴加三乙胺40μL避光搅拌，完全溶解后滴加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.1g和二环己基碳二亚胺(DCC)0.15g到混合溶液中并继续避光反应过夜，次日抽虑后所得叶酸活性酯；滴加0.005g叶酸活性酯到步骤(2)所得体系2mL中，室温避光反应60min，经透析，柱分离后，所得即为包裹右旋糖酐包裹的γ-Fe2O3纳米粒子和氮气、表面含有西佛碱和叶酸靶向配基的牛血清白蛋白微球材料，记为样品2#。

[0078] 实施例3样品3#的制备

[0079] (1)制备右旋糖酐包裹的γ-Fe2O3纳米粒子：向250mL三角烧瓶通入氮气(N2)10～30min备用，称取二价铁盐(FeCl2·6H2O)0.2982g，称取0.5406g三价铁盐(FeCl3·6H2O)，混匀后溶解于30mL水中，置于N2保护的三角烧瓶中并快速搅拌(900rpm)，以1mL/s速度滴加
30mL氨水(20％)至混合溶液中，95℃温度下加热回流90min；搅拌完成后称取0.5g甘露醇后快速搅拌20min，搅拌完成后称取0.32g右旋糖酐滴加至混合溶液中，50℃温度下快速搅拌
30min；所得混合溶液经磁分离，12000rpm离心沉淀，用去离子水清洗1～3次后，加入30ml超纯水重悬，滴加柠檬酸0.01g，得到含有右旋糖酐包裹γ-Fe2O3纳米粒子的液体，于4℃保存。

[0080] (2)称取质量分数为5％的牛血清白蛋白(BSA)0.05g溶于1mL由十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠配置pH为7.0的PBS缓冲液中混匀，同时加入120μL质量浓度为20％戊二醛溶液并混匀，静置60sec；滴加步骤(1)所得的含有右旋糖酐包裹γ-Fe2O3纳米粒子的液体1mL至混合溶液中并混匀；将超声探头置于液相与气相(N2)界面表层，超声60sec后取出超声探头，得到具有包裹右旋糖酐包覆的γ-Fe2O3纳米粒子和氮气且表面含有西佛碱的牛血清白蛋白微球的体系。

[0081] (3)称取叶酸0.25g，溶于10mL的无水二甲亚砜(DMSO)中，滴加三乙胺40μL避光搅拌，完全溶解后滴加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.1g和二环己基碳二亚胺(DCC)0.15g到混合溶液中并继续避光反应过夜，次日抽虑后所得叶酸活性酯；滴加0.004g叶酸活性酯到步骤(2)所得体系2mL中，室温避光反应60min，经透析，柱分离后，所得即为包裹右旋糖酐包裹的γ-Fe2O3纳米粒子和氮气、表面含有西佛碱和叶酸靶向配基的牛血清白蛋白微球材料，记为样品3#。

[0082] 实施例4

[0083] 原料配比、制备步骤、条件与实施例1一样，仅将步骤氮气换成氩气，所得样品记为样品4#。

[0084] 实施例5

[0085] 原料配比、制备步骤、条件与实施例2一样，仅将步骤氮气换成二氧化碳其他，所得样品记为样品5#。

[0086] 实施例6

[0087] 原料配比、制备步骤、条件、与实施例1一样，仅将0.5964g的FeCl2·6H2O和1.0812g的FeCl3·6H2O换成2g的CoCl2·6H2O，将氮气换成氦气，所得样品记为样品6#。

[0088] 实施例7

[0089] 原料配比、制备步骤、条件、与实施例1一样，仅将0.5964g的FeCl2·6H2O和1.0812g的FeCl3·6H2O换成2g的NiCl2·6H2O，将氮气换成氦气，所得样品记为样品7#。

[0090] 实施例8

[0091] 原料配比、制备步骤、条件、与实施例1一样，仅将右旋糖酐换成同等质量的壳聚糖，将氮气换成空气，所得样品记为样品8#。

[0092] 实施例9

[0093] 原料配比、制备步骤、条件、与实施例1一样，仅将右旋糖酐换成同等质量的纤维素，将戊二醛换成同等摩尔数的乙二醛，所得样品记为样品9#。

[0094] 实施例10

[0095] 原料配比、制备步骤、条件、与实施例1一样，仅将戊二醛换成同等摩尔数的1，8-辛二醛，所得样品记为样品10#。

[0096] 对比例1

[0097] 取质量百分含量为5％的牛血清白蛋白(BSA)0.05g溶于1mL由十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠配置pH为7.2的PBS缓冲液中混匀，同时加入100μL戊二醛溶液并混匀，静置60sec；将超声探头(直径6mm，功率490W)置于液相与气相(N2)界面表层，超声60sec后取出超声探头，得到具有包裹氮气且表面含有西佛碱的牛血清白蛋白微球的体系。收集体系表面的微泡并4℃保存，记为样品11#。

[0098] 对比例2

[0099] 叶酸偶联BSA-GA复合材料：称取叶酸0.25g，溶于10mL的无水二甲亚砜(DMSO)中，滴加三乙胺40μL避光搅拌，完全溶解后滴加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.1g和二环己基碳二亚胺(DCC)0.15g到混合溶液中并继续避光反应过夜，次日抽虑后所得叶酸活性酯；滴加0.005g叶酸活性酯到对比例1所得具有包裹氮气且表面含有西佛碱的牛血清白蛋白微球的体系2mL中，室温避光反应60min，经透析，柱分离后得到包裹氮气且表面含有西佛碱和叶酸的牛血清白蛋白微球材料，记为样品12#。

[0100] 实施例11粒径分布

[0101] 检测了样品1#～样品10#的粒径分布，所得样品的粒径在0.5μm～3μm之间，均适合作为超声造影剂。以样品1#为典型代表，其粒径分布图如图2所示，在0.8μm～1.3μm范围内，粒径分布集中在1.1μm左右。

[0102] 实施例12

[0103] 分别对对比例1中，PBS缓冲液中的牛血清白蛋白、戊二醛和样品11#进行了荧光光谱分析，结果如图3所示。图3中(a)为激发波长为468nm牛血清白蛋白、戊二醛、具有包裹氮气且表面含有西佛碱的牛血清白蛋白微球的荧光光谱图；(b)为激发波长为536nm牛血清白蛋白、戊二醛、具有包裹氮气且表面含有西佛碱的牛血清白蛋白微球的荧光光谱图；(c)为激发波长为630nm牛血清白蛋白、戊二醛、具有包裹氮气且表面含有西佛碱的牛血清白蛋白微球的荧光光谱图。可以看出，单独的牛血清白蛋白及戊二醛没有荧光效果，只有两者结合产生西佛碱后，才产生荧光。

[0104] 实施例13

[0105] 分别对样品1#～样品12#进行了细胞毒性检测，均展示了低细胞毒性。以样品1#为典型代表，其细胞毒性分析图如图4所示。随着浓度的升高，细胞存活率没有出现明显的下降趋势，证明1#～12#样品的毒性均为低细胞毒性。

[0106] 实施例14

[0107] 分别以样品1#～样品10#作为造影剂，进行了超声造影检测，均展示了较显著的超声造影功能。以样品1#为典型代表，其超声造影图如图5所示。其中(a)为空白对比成像图(b)为1#样品即包裹右旋糖酐包覆的Fe3O4纳米粒子和氮气且表面含有西佛碱的牛血清白蛋白微球，可以看出图(b)空管中显示为白色(超声造影功能增强)，说明样品1#～样品10#均具有明显的超声成像功能。

[0108] 实施例15

[0109] 分别以样品1#～样品10#作为造影剂，进行了荧光造影检测，均展示了较显著的荧光造影功能。以样品1#为典型代表，其荧光造影图如图6所示。其中(a)为荧光显微镜普通视野下的成像图；(b)为荧光显微镜在激发波长为536nm下的绿色荧光成像图；(c)为荧光显微镜在激发波长为630nm下的红色荧光成像图；(d)为b图和c图的合并图。可以看出在不同激发光激发下，样品能够发出红光及绿光等荧光(荧光造影功能增强)，说明样品1#～样品10#均具有明显的荧光成像功能。

[0110] 实施例16

[0111] 分别以样品1#～样品10#作为造影剂，进行了磁共振造影检测，均展示了较显著的磁共振造影功能。以样品1#-3#为典型代表，其磁共振造影图如图7所示。可以看出在周围水相环境呈浅灰色时，样品1#-3#均呈现黑色(MRI T2造影功能增强)，说明样品1#～样品10#均具有明显的磁共振成像功能。

[0112] 实施例17

[0113] 对样品1#～样品10#的弛豫率进行了测定，均具备较典型的MRI T2弛豫特性。以样品1#为典型代表，其弛豫率测定结果如表1所示。

[0114] 表1

[0115]

[0116] 本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请精神和范围内，都可以做出可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。