射流装置

摘要

在此提供了一种用于测定一种或多种组分的扩散的方法，该方法包括以下步骤：(i)提供包含一种或多种组分的一个组分流体流；(ii)提供一个空白流体流；(iii)在一个大横截面通道中使该流(i)与该流(ii)接触，从而生成两个层流；(iv)允许在(iii)中生成的这些层流从该大横截面通道中流入一个小横截面通道中；(v)在该小横截面通道中测量该一种或多种组分从该组分流到该空白流体流中的径向扩散。在此还提供了一种扩散方法，该方法包括在多个扩散时间测量该一种或多种组分从该组分流到该空白流体流中的径向扩散的步骤。在此还提供了一种确定包含多种组分的一个流体的组成的方法，该方法(i)提供包含该多种组分的该流体的一个或多个测量的扩散曲线；(ii)提供具有已知流体动力学半径的组分的一系列预测的分布；并且(iii)使用关于具有已知流体动力学半径的组分的该系列分布的一种最高熵正规化方法，使该一种或多种组分的该测量的径向扩散曲线去卷积。

权利要求

1.一种用于测定一种或多种组分的扩散系数的方法，该方法包括以下步骤：(i)提供包含一种或多种组分的一个组分流体流；

(ii)提供一个空白流体流；

(iii)在一个通道中使该组分流体流与该空白流体流接触，从而生成两个层流；

(iv)在多个扩散时间测量该一种或多种组分从该组分流体流到该空白流体流中的径向扩散。

2.根据权利要求1所述的方法，其中该组分流体流包含两种或更多种组分，并且步骤(iv)包括在多个扩散时间测量两种或更多种组分从该组分流体流到该空白流体流的径向扩散。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该径向扩散是在三个或更多个扩散时间测量的。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该方法进一步包括步骤(v)，其中一种组分的扩散系数值是由步骤(iv)的径向扩散测量值确定的。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，流体动力学半径是由扩散系数值确定的。

6.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(v)包括比较来自步骤(iv)的所测量的该一种或多种组分的径向扩散曲线与具有已知流体动力学半径的组分的一系列分布，从而确定该一种或多种组分中每一种的流体动力学半径。

7.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(v)包括使用最高熵正规化方法，参考具有已知流体动力学半径的组分的一系列分布，使来自步骤(iv)的所测量的该一种或多种组分的径向扩散曲线去卷积，从而确定该一种或多种组分中每一种的流体动力学半径。

8.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中步骤(ii)提供两个空白流体流，并且这些空白流体流与该组分流体流接触并且被提供在该组分流体流的两侧，从而生成三个流体流。

9.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该组分或这些组分是聚合物。

10.根据权利要求9所述的方法，其中该聚合物是生物聚合物或者包含生物聚合物，所述生物聚合物选自由多肽、多核苷酸和多糖组成的组。

11.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，该方法用于测定一种或多种组分的扩散系数，每种组分具有在范围0.5至500nm内的流体动力学半径。

12.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在步骤(iv)中的该一种或多种组分的扩散是通过荧光测量来测定的。

说明书

射流装置

[0001] 相关申请

[0002] 本案要求2012年10月23日(23/10/2012)提交的GB 1219014.6的优先权和权益，该申请的内容通过引用以其全部内容结合在此。

技术领域

[0003] 本发明涉及用于分析组分混合物如多肽混合物的流动扩散方法和流动仪器。

背景技术

[0004] 基本上重要或技术上重要的很多系统作为多种异质组分的多分散混合物存在。在此类混合物中个别组分的固有特性的说明在从分析化学到生物物理学范围的领域内是一个决定性问题。

[0005] 异质颗粒混合物中的颗粒大小测量在由药物延伸的领域中是一个常见的问题，其中大小测量判断治疗剂到颜料、油墨和涂料的溶解性和纯度，所有这些的纳米和微尺度组分的大小必须受到严密地控制和监控以确保所希望的功能。

[0006] 其中微尺度组分的大小是特别重要的并且具有大的定义重要性的领域是蛋白质缔合和自组装的领域；绝大部分蛋白质不是作为单体物质而是作为较大功能性复合物的一部分来实践其生物功能；如果没有出现以希望的方式将蛋白质组装成此类复合物而是形成异常物质，则此异常组装频繁地导致机能障碍和疾病。通常用于测量多肽大小的现有生物物理学技术表现最好以用于均质制备纯化的组分，而具有很多生物系统特征的均质混合物的定量研究仍具有挑战性。

[0007] 基于现有微流体扩散的定量技术[1]主要涉及发现均质溶液[5]中的一种单一物质的大小或者典型地使用荧光标记的物质[8、7、3、11、12、19]测量两种分离的物质之间的相互作用。还报道了不需要荧光标记样品的技术[4]。

[0008] 例如，耶格尔(Yager)等人[11]描述了一种用于光学测量微通道中的横向分子扩散的T-传感器。该T-传感器具有两个输入端口，通过这些端口提供一个含分析物流体和一个缓冲液流体。两个流体物流在T型接头处接触并且被允许沿着一个检测通道并排地流动。在这些流沿着该通道行进时，分析物从分析物流体扩散到缓冲液流体中。作者使用若干种荧光标记蛋白质作为测试分析物，并且这些蛋白质的扩散是通过在该接头下游的一个测量位置处进行荧光显微镜检查来检测的。所述的方法集中于单分散分析物溶液的分析。

[0009] 耶格尔等人注意到由所记录的实验扩散数据计算的扩散系数值包括误差，该误差涉及在计算中这些流体在整个检测通道中具有一个充分展开的速度曲线的假设。这个假设是不正确的，如作者所解释的。实际上，观察到流体的速率沿着该通道从这些流体首先接触的停滞点(在该接头处的零级流动区域)开始加快到也在下游一个点处充分展开的速率。为了补偿较缓慢的流体流动的此区域，作者描述了解释并定量流动发展的计算方法。作者自己承认，这些溶液的数值计算是粗糙的，缓慢计算(约1天的计算时间)，并且仅可以给出关于在所谓流动发展区域中扩散效应大小的意见。由此，由记录的数据计算的扩散系数不能适当地补偿在T型接头处的流体停滞。

[0010] US 2006/263903描述了加号(+)形状的微通道网络测定一种样品溶质的分子量和扩散率的用途。在此，一个单一分析物流体流在一个交叉点与一个单一空白流体流接触。这些流随后分离，其中每个流在一个单独的出口通道中离开该接触区域。对于一个范围的不同分析物和空白流体流速，测定已分散到接触区域中的空白流体流中的分析物的量。分析物的扩散率和分子量是通过比较所记录的扩散曲线与由标准分子的扩散生成的一个扩散率曲线数据组来测定的。所述的方法集中于单分散分析物溶液的分析。

[0011] 本领域还已知用于基于一个流体通道中的一种物质的泰勒(Taylor)分散确定扩散特征的替代性射流方法。例如，US 2011/264380描述了用于测定多分散物质的流体动力学半径的方法。将有待分析的物质与一个单分散标准混合。将所得的混合物添加到沿着一个毛细管流动的一个载体流体中并且在该混合物排出该毛细管时记录它的泰勒曲线。

[0012] 如US 2011/284380所注意到的，泰勒分散方法不适用于多分散混合物，因为所获得的结果简单地是一个平均信号，该平均信号反映了该混合物的全局特征而不是该混合物中每种组分的单个贡献。US 2011/264380通过使用一种多分散样品内的一个内部标准来部分解决这一点，该标准提供了对该平均信号的一个已知贡献。例如，在分析一种多分散聚合物产品的情况下，可以存在一种单体前体的一种内部标准。然后可以推导出多分散物质对于总体信号的贡献，并且可以测定多分散物质的平均流体动力学半径。然而，此方法仅可以提供一种多分散混合物的平均流体动力学半径。此外，基于泰勒分散的方法需要一个扩散的时间分辨的测量，这与通过耶格尔等人[11]描述的稳态方法相比典型地具有一个更低的敏感度。

[0013] 本发明人已开发了考虑到在流动通道中分析组分扩散的这些问题的分析方法。

发明内容

[0014] 本发明大体上提供了一种用于测定一种组分、包括一种多分散组分混合物的扩散系数的方法。具体地说，该方法可用于测定在一种混合物中的一种组分、优选地两种或更多种组分的流体动力学半径。本发明方法特别适用于分析聚合物混合物如蛋白质混合物。还提供了一种用于分析方法中的射流装置。

[0015] 本发明的方法和装置可用于以比现存方法提高的准确度测定一种组分的扩散系数和流体动力学半径。在一些方面，本发明的方法和装置解决了在一个微型通道中的流体停滞的问题并且使得从停滞点延伸的流体发展区域最小化，从而允许在一个减小的时间内形成一个稳定流。

[0016] 本发明的方法允许有待随着时间测量的一种或多种组分的扩散。以这种方式，该方法可以用于研究这些流体的组成变化，并且更具体地说用于研究一种组分以另一种相同组分或一种不同的组分的相互作用。例如，本发明可以用于监控这些流体中的组分的聚集，如多肽的聚集。一种混合物随着时间的扩散曲线变化可以用于进行组分聚集物的生成和分离。

[0017] 使用扩散方法的另一个一般优点是研究天然状态下的生物分子如蛋白质的机会。

[0018] 在本发明的一个第一方面，提供了一种用于测定一种或多种组分的扩散系数的方法，该方法包括以下步骤：

[0019] (i)提供包含一种或多种组分的一个组分流体流；

[0020] (ii)提供一个空白流体流；

[0021] (iii)在一个大横截面通道中使该流(i)与该流(ii)接触，从而生成两个层流；

[0022] (iv)允许在(iii)中生成的这些层流从该大横截面通道中流入一个小横截面通道中；

[0023] (v)在该小横截面通道中测量该一种或多种组分从该组分流到该空白流体流中的径向扩散。

[0024] 在一个实施例中，在该方法中的步骤(i)提供一种包含一种或多种组分的组分流体流。

[0025] 在一个实施例中，该组分流体流和该空白流体流是水流。

[0026] 在一个实施例中，在步骤(ii)中提供两个空白流，并且这些空白流被提供在大横截面通道的组分流的一侧，从而在步骤(iii)中在大横截面通道中生成三个层流。

[0027] 在本发明的一个第二方面，提供了一种用于本发明的第一方面的方法中的射流装置，该装置包括与两个上游供应通道流体连通的一个大横截面通道和与大横截面通道流体连通的一个下游小横截面通道。

[0028] 在本发明的第一方面的方法中，这些供应通道可以被提供用于一个组分流体流和一个空白流体流。射流装置被适配为用于检测流体流中的一种或多种组分的一种分析装置。该分析装置用于测量一种或多种组分在一个小横截面通道中的扩散。

[0029] 在一个流体中存在多于一种组分的情况下，在此所述的方法允许测定每个组分的扩散系数，而不是组分混合物的一个平均扩散系数。记录的扩散曲线的去卷积可以通过在不同扩散时间记录多个扩散曲线，这具有减小记录的数据的噪音水平的益处。

[0030] 在本发明的一个第三方面，提供了一种用于测定一种或多种组分的扩散系数的方法，该方法包括以下步骤：

[0031] (i)提供包含一种或多种组分的一个组分流体流；

[0032] (ii)提供一个空白流体流；

[0033] (iii)在一个通道中使该流(i)与该流(ii)接触，从而生成两个层流；

[0034] (iv)在多个扩散时间，例如在三个或更多个扩散时间测量该一种或多种组分从该组分流到该空白流体流中的径向扩散。

[0035] 提到多个扩散时间是提到在沿着流动通道的不同位置记录的径向扩散测量。因此，一个第二测量点可以位于一个第一测量点的通道下游。另外的测量点可以位于也沿着该通道下游的位置。

[0036] 在一个实施例中，在该方法中的步骤(i)提供一种包含一种或多种组分的组分流体流。因此，步骤(iv)包括在多个扩散时间测量两种或更多种组分从该组分流到该空白流体流中的径向扩散。

[0037] 在一个实施例中，该组分流体流和该空白流体流是水流。

[0038] 在一个实施例中，在步骤(ii)中提供两个空白流，并且这些空白流被提供在大横截面通道的组分流的一侧，从而在步骤(iii)中在大横截面通道中生成三个层流。

[0039] 在一个实施例中，该方法进一步包括步骤(v)，其中一种组分的一个扩散系数值是由步骤(iv)的径向扩散测量值确定的，并且任选地流体动力学半径是由扩散系数值确定的。

[0040] 在一个实施方案中，步骤(v)包括比较来自步骤(iv)的一种或多种组分的测量的径向扩散曲线与具有已知流体动力学半径的组分的一系列分布，从而确定该一种或多种组分中每一种的流体动力学半径。

[0041] 在一个实施方案中，步骤(v)包括使用关于具有已知流体动力学半径的组分的一系列分布的一种最高熵正规化方法，使来自步骤(iv)的一种或多种组分的测量的径向扩散曲线去卷积，从而确定该一种或多种组分中每一种的流体动力学半径。在此实施例中，可以使用一种最小平方分析。具有已知流体动力学半径的组分的该系列分布可以是一系列预测的分布。

[0042] 在本发明的另一个方面，提供了一种确定包含多种组分的一个流体的组成的方法，该方法包括以下步骤：

[0043] (i)提供包含该多种组分的该流体的一个或多个测量的扩散曲线；

[0044] (ii)提供具有已知流体动力学半径的组分的一系列预测的分布；以及[0045] (iii)使用关于具有已知流体动力学半径的组分的该系列分布的一种最高熵正规化方法，使该一种或多种组分的测量的径向扩散曲线去卷积，从而确定该一种或多种组分中每一种的流体动力学半径。

[0046] 在一个实施例中，确定一个流体的组成的方法提供基于该流体中每种组分的流体动力学半径的一个组成曲线。

[0047] 在步骤(i)中的测量的扩散曲线可以是通过根据本发明的第一方面或第三方面的一种方法获得或可获得的。

[0048] 在本发明的另一个方面，提供了一种用于分析包含一种或多种组分的一个流体中的组成改变的方法，该方法包括以下步骤：在一个第一时间从该流体中获取一种第一样品并且根据本发明的第一方面或第三方面进行一个分析，从而确定该流体在该第一时间的组成；以及在该第一时间之后的一个第二时间从该流体获取一个第二样品并且根据本发明的第一方面或第三方面进行一个分析，从而确定该流体在该第二时间的组成。

[0049] 该方法可以包括在随后的时间获取另外的、如第三样品和第四样品并且根据第一方面或第三方面进行一个分析。

[0050] 该方法允许生成有待检测的组分的聚集物并且允许分离有待检测的组分。反应速度可以是由这些结果确定。

[0051] 本发明的其他方面和本发明的不同实施例为如在此所述的。

附图说明

[0052] 图1a是根据应用的本发明的一个实施例的一个射流装置的一部分的示意图，其中图像显示在喷嘴处的一个组分流体流的分布(在此情况下，是牛血清白蛋白和β乳球蛋白在水中的混合物)和在沿着测量通道(小横截面通道)的1mm、3mm和9mm处的三个测量区域。空白流(黑色)被提供在组分流(白色)的一侧。

[0053] 图1b是图1b的示意图的平面图。

[0054] 图2包括涉及使用具有25nm和100nm半径的荧光标记组分(胶质)的一种50:50混合物(按体积计是0.1％)校准图1的射流装置的图表。A：径谱通过使用最大熵正规化记录的分布数据的一种最小平方分析(底部光谱)生成，并且与这些胶质中每一种的均质溶液的径谱(顶部光谱和从顶部光谱起的第二个光谱)相比较。在此还示出了由在三个测量点(底部光谱)与一个单一测量点(从底部光谱起的第二个光谱)下记录的数据生成的径谱之间的比较。使用多个测量点提供了具有较大准确度和较大分辨率的分辨谱。B：组分混合物在沿着该通道的1mm、3mm和9mm处的三个不同测量点的分布以及对于通过最小平方算法生成的这些分布的拟合。

[0055] 图3示出了在120分钟内由单体生长的的Aβ(1-42)聚集物的大小分布。A：随着时间的ThT荧光强度-在0分钟时(在任何聚集之前)、在30和50分钟时(在生长期之前和期间)、以及在单体已耗尽之后的120分钟内获取等份样品。B：大小分布发现使用以最大熵正规化拟合的最小平方。溶液最初是单体，在形成低聚物、原纤维以及最终的宏观原纤维“丛”之前。

[0056] 图4示出了接头，该接头是其中一个组分流体流(白色)在三个不同的喷嘴或大横截面通道中遇到两个空白流体流(黑色)的点，这些喷嘴或通道从左开始具有300μm、1,000μm和3,000μm的宽度，其中该宽度是指该喷嘴中的最大横截面，该宽度比在接头处的组流体流的宽度(即，具有30μm、100μm和300μm的宽度)宽十倍。大横截面通道允许建立一个清洁且限定的组分流，它在接头处具有一个减小的滞留时间(减小的停滞)。流速是4μLh-1并且组分是一种25nm胶质。

[0057] 图5示出了微流体扩散光谱法的分辨率的数值评估，其中(A)是当用不同水平的随机噪声分辨的一种单一物质时在一个单峰的位置上的分数误差，并且(B)是在不同水平的随机噪声下分辨两种物质之前这两种物质之间的最小分数差分。

[0058] 图6示出了在个别均质溶液中的A(胰高血糖素)、B(β乳球蛋白)、以及C(BSA)和作为所有三种物质的1:1:1混合物的D的大小分布，表示为流体动力学半径。在365nm下使用一个倒置显微镜上的LED光源照射样品并且使用一个高量子产率CCD照相机检测这些样品。一个样品的稳态分布的测量的持续时间是10s。在出口处的总流速是40μLh-1。

[0059] 图7示出了BSA在pH 7缓冲液的溶液和在80％DMSO的溶液中的流体动力学半径，如通过本发明的一种方法测定的。

[0060] 图8示出了(a)纯化的αB-晶状体蛋白的SDS-PAGE分析。与在变性条件下出现的大约20kDa相对应的条带与纯的单体αB-晶状体蛋白的预期分子质量20,159Da一致；并且示出(b)未处理的和OPA-标记的αB-晶状体蛋白的MALDI-MS分析。在OPA-标记时出现的m/z-位移与大约2,200Da相对应。考虑到每个标签修饰增加176Da质量，这些结果表明完全标记每个αB-晶状体蛋白分子的11个胺(10个伯胺和N-末端胺)。

[0061] 图9示出了(a)30uMαB-晶状体蛋白在本发明的射流仪器中的扩散曲线。对于在1、3和9cm处的三个测量点的扩散曲线描绘荧光强度对比通道位置的实验数据(实线)和相关拟合(虚线)，其中在90μm通道位置从顶部到底部的曲线与1、3和9cm曲线测量值相对应。并且示出了(b)30uMαB-晶状体蛋白的大小分布。两个群体代表单体和低聚体αB-晶状体蛋白。

[0062] 图10示出了用DLS(暗线)和本发明的微流体装置(浅线)测量的30μMαB-晶状体蛋白的大小分布。扩散光谱法允许检测低大小的物质(约2nm)和低聚体物质(约6nm)。DLS专门揭示了反映αB-晶状体蛋白的低聚体形式的一个广泛大小分布峰(中心在约8nm处)。

[0063] 图11示出了(a)使用αB-晶状体蛋白的一个蛋白质转位实验的电流跟踪。在一个负电压-500mV下使用50kHz贝塞尔滤波器进行这些实验；并且示出了(b)显示转位实验中的平均事件电流与事件持续时间之间的关系的一个二维散点图。事件的频率是通过侧面标度所示的阴影表示的。

[0064] 图12示出了在(a)15μM、(b)30μM、(c)50μM、以及(d)125μM单体蛋白质浓度下的αB-晶状体蛋白的大小分布，如通过根据本发明的扩散光谱法测量的。

[0065] 图13示出了脂质体的大小分布，如通过根据本发明的扩散光谱法测量的，其中这些脂质体具有(a)15nm和(c)50nm挤出半径和(e)二者的一个1:1混合物。各个曲线表示在沿着扩散通道(在1、3和9cm处，其中在90μm通道位置上从顶部到底部的曲线与1、3和9cm曲线测量相对应)的不同测量点的扩散。对于所有三个测量点，穿过微型通道的荧光强度曲线(虚线)与对应最小平方拟合(实线)一起描绘。具有(b)15nm和(d)50nm挤出半径的脂质体和(f)二者的一个1:1混合物的大小分布，如使用DLS(暗线)和微流体扩散(淡线)测量的。在大约4nm处的峰与游离的标记的脂质相对应。仅扩散光谱测量值确定此物质。

具体实施方式

[0066] 本发明提供一种用于分析一种组分从一个流体流中扩散到另一个流体流中的方法。本发明人已发现对于一个标准T型接头流装置的改变允许以较大准确度测量该组分的扩散。具体地说，本发明人已发现当流体在接头处接触时使它们的停滞最小化或消除该停滞的一种方式。

[0067] 如在此所述的，本发明人已发现在其中组分和空白流接触的接头处使用一个大横截面通道使流体停滞对扩散分析的有害影响最小化。如以下所述的，大横截面通道可以是在例如比下游通道宽度更宽十倍的区域中，其中进行扩散测量。本发明人已确定一个大横截面通道在接头处提供一个清洁且限定的组分流。因此，本发明人已将一个大横截面通道引入用于测量组分扩散的一个射流装置中。在大横截面通道下游是一个小横截面通道，该小横截面通道是检测通道。

[0068] 使用一个大横截面通道被认为提高多种益处。首先，其中建立流的区域由于对于一个给定的流速(flow rate)相对更低的流动速度(flow velocity)而缩短。第二，由于接头到小流动通道的相对大小减小，较小比例的组分进入零级流动区域。第三，扩散相对于通道宽度w的净效应减小，因为速率尺度是1/√w并且因此扩散距离是√w。

[0069] 这些效应的结果将在组分流和空白流进入小横截面通道时，提供用于组分流中的组分的良好限定的初始构型。因此，使用一个大流动通道是在例如小宽度通道下游的通道中建立一个恒定速率曲线之前使颗粒扩散最小化的一种有效方式，在该小宽度通道中进行扩散测量。

[0070] 本发明的方法包括测量组分从一个组分流到一个相邻空白流中的径向扩散的步骤。从这些测量中，最终可以测量样品中的一种组分的扩散系数。虽然可以由一个单一测量值测定一种组分或一种

[0071] 组分混合物的一个扩散系数，本发明人已发现沿着小横截面通道的多个扩散测量提供准确的扩散系数值。

[0072] 在组分流包含两种或更多种组分的情况下，鉴于逆变换相对于扩散系数组合的近退化，一个单一扩散曲线的去卷积是特别具有挑战的。为了实现个别组分的分辨，在多个位置、例如在三个或更多个位置处测量这些组分到空白流中的扩散性传播。

[0073] 每个测量值因此对应于一个不同的扩散时间。使用多个扩散曲线减小了基底函数之间的退化。本发明人已确定使用多个测量点提供了分辨的径谱，该径谱具有较大准确度(即，预测的组分大小更紧密地配合流体中的组分的实际大小)并且具有更大的分辨率(例如，可以区分具有更接近的半径的组分)。

[0074] 本发明的流动方法允许在不同扩散时间同时测量的组分的空间分布。以这种方式，可以完全分辨在复杂混合物中个别组分的扩散系数的分布谱。这使得本发明优于先前所述的方法，该先前所述的方法仅提供多分散组分混合物的平均扩散系数值。

[0075] 由于使用小流体通道、特别是微流体通道，所以可以分析非常小的样品体积。因此，在小于一微升体积的流体中提供的组分可以是通过在此所述的方法进行分析的。另外，流体流动技术还可以用于通过适当增加测量次数来分析非常稀的样品。

[0076] 此外，扩散光谱法对于在这些流中使用的溶剂条件的性质特别不敏感。因此，可以研究在其天然条件下的生物分子如蛋白质。以这种方式，扩散测量可以提供生物组分的绝对大小值，并且对于分析不需要包括将外源条件下获得的一个大小测量值转换成在天然条件下的一个预期大小的一个校准步骤。

[0077] 具有带有不同大小的通道的微型装置是已知的，然而此类装置不被适配用于测量一种或多种组分穿过一个通道的扩散。本发明人已发现在一个大横截面通道中发展一个层流，然后使该层流进入一个小横截面通道，提供了一种用于研究组分穿过该层流的移动的改进的方法。EP 1,481,723描述了一种用于使流体混合并反应的微型装置。该微型装置包括以一个同轴的多个圆柱形结构安排的一系列流体供应通路。流体在该装置的同轴通道内流动，并且这些流被允许在一个反应流动路径中结合在一起，以形成一个薄层形状的层流。在下游，减小反应流动路径的宽度以便使该流动收缩。

[0078] EP 1,481,723并未描述用于测量组分在层流之间的移动的方法，并且它并未描述用于测定那些组分的扩散系数的方法。在EP 1,481,723装置中的通道安排将允许所有组成从一个流快速扩散到另一个流，其目的是为了在一个短时间内实现所有组成的均匀分布。这据说对于避免非均相反应通路是重要的。在用于测量扩散系数的一个装置内，所有物质的快速扩散是不希望的，因为它不会允许区别不同大小的多种组分(即，不同的扩散系数)。
此外，快速扩散可能不允许在一种组分已扩散到通道边缘之前进行一个扩散测量。EP 1,
481,723的教义因此与改进的扩散测量系统的发展不相关。

[0079] 扩散

[0080] 由进行布朗运动的一个颗粒表现出的平均均方位移与其扩散系数D直接成比例并且与其流体动力学半径rh成反比，这是允许简单评估由平均均方位移获得的分子大小的爱因斯坦关系(Einstein relation)。当各自具有一个不同的扩散系数的物质的一种混合物存在于溶液中时，情况更复杂。

[0081] 所得扩散曲线的形状可以被认为是含有关于存在于溶液中作为一个线性叠加的所有物质的流体动力学半径的全光谱的信息。然而，这个曲线到对应于分散物质的高斯维尔斯特拉斯核的总量的逆变换对于实验噪音是非常敏感的。因此，此方法作为在异质混合物中进行测量的基础通常并不实际。

[0082] 为了克服此困难，本发明人已开发了一种方法，该方法允许由最初位于空间(在组分流体流中)中的分析物组分的布朗运动所形成的扩散曲线在它们传播穿过小横截面通道到达空白流体流中时同时持续多次扩散时间进行测量。

[0083] 本发明的一个方面涉及使用一个大横截面通道，该大横截面通道解决了在接头处的零级流动的问题，在该接头处该组分流与该空白流第一次接触。大横截面通道的一个优点是它迫使这些组分进入良好限定的初始构型中。以这种方式准确定位这些组分确保了所记录的扩散数据更能代表一个预测的扩散曲线。

[0084] 可以与该第一方面有利地结合的本发明的另一个方面是沿着一个扩散通道使用多个分析测量点。在不同扩散时间的测量减小了基底函数之间的退化，并且允许扩散系数以更大的准确度和更大的确定性进行测定。

[0085] 在本发明的方法的一个一般方面中,一种组分被允许从该组分流移动到小横截面通道中的缓冲液流中。这可以被称为该组分穿过一个通道的径向移动。

[0086] 在一个实施例中，一种组分被允许从该组分流(一个高组分浓度区域)中扩散到缓冲液流(并且是一个低组分浓度区域)。在此，该组分的移动是简单的扩散运输。

[0087] 在一个替代实施例中，一种组分从组分流到缓冲液流中的移动是对施加电场的响应。因此，扩散可以被称为该组分的电泳扩散。在该通道内的组分流是响应于施加电场而偏转。偏转程度与施加场和组分的净电荷有关。将了解的是，具有不同电荷的组分可以通过其响应于施加场的不同偏转分开穿过该通道。在此实施例中，使流动发展区域最小化也是有利地，因为这使流体停滞最小化。在知道施加场和偏转程度(从电泳扩散曲线)的情况下，技术人员能够测定组分在流体中的电泳迁移率和电荷。

[0088] 通过赫林(Herling)等人[37]描述了在一种微流体装置中的电泳扩散技术的一般用途。

[0089] 本发明的方法适用于与允许一种组分穿过通道径向移动的其他技术一起使用。这可以被广泛地称为扩散。在一个实施例中，扩散是指以上所述的扩散运输。

[0090] 一般方法

[0091] 本发明的第一方面的方法通常用于测定在一个溶液中的一种或多种组分如聚合物的扩散系数。在一个大横截面通道中使包含该一种或多种组分的一个流体流与一个空白流体流接触。允许层流从该大横截面通道中流入一个小横截面通道中。在沿着该小横截面通道中的一个或多个位置处测量该一种或多种组分到该空白流体流中的径向扩散。通过一个或多个扩散曲线，可以确定该一种或多种组分的扩散系数和大小和/或分子量。

[0092] 该大横截面通道和小横截面通道是一种射流装置的部分。该射流装置被适配为与用于这些组分的一种检测器一起使用。

[0093] 在分析步骤过程中以一个基本上恒定的水平维持每个流的流速。仅可以当在该小截面通道中建立一个稳定流时进行分析。

[0094] 本发明的第三方面的方法通常用于测定在一个溶液中的一种或多种组分如聚合物的扩散系数。在一个通道中使包含该一种或多种组分的一个流体流与一个空白流接触。在沿着该通道的多个位置处测量该一种或多种组分的扩散。通过该多个扩散曲线，可以确定该一种或多种组分的扩散系数和大小和/或分子量。

[0095] 该通道是一种射流装置的一部分。该射流装置被适配为与用于在该通道中的多个位置处的这些组分的一种检测器一起使用。该通道是与用于空白流和组分流的供应通道流体连通的。

[0096] 在分析步骤过程中以一个基本上恒定的水平维持每个流的流速。仅可以当在该通道中建立一个稳定流时进行分析。

[0097] 在本发明的其他方面，一种射流装置可以用于测定在组分流中的多种组分的总浓度。在此，所记录的扩散信号的强度(如通过在此所述的方法获得的)可以用于直接获得这些组分的总浓度。在一些实施例中，可能需要提供额外试剂以允许获取准确浓度读数。例如，在组分流包含多肽的情况下，在分析测量之前使这些多肽变性可以是有利的。出于此目的，可以在缓冲流中提供一种变性剂如DMSO。

[0098] 另一方面用于通过获取含有一种组分的流体样品并且获得每种样品的扩散曲线来监控该组分随着时间的变化(或无变化)，如聚集和分离。扩散曲线随着时间的变化可以指示聚集或分离事件。

[0099] 射流装置

[0100] 本发明的第一方面的方法利用一种射流装置，该射流装置包括与一个小横截面通道流体连通的一个大横截面通道。每个大通道和小通道的横截面典型地是在微米范围内，并且用于本发明的第一方面的方法中的该射流装置可以因此被称为一种微流体装置。

[0101] 本发明还提供在此所述的微流体装置。

[0102] 微流体通道保持该组分和空白流的用途确保这些流以低雷诺数(Reynolds number)出现，并且因此对流和扩散是在该系统内质量输运的仅有相关机制。因此，这允许对给定大小的每种组分进行准确的数值计算。

[0103] 选择该装置中的这些通道的总体尺寸以提供合理的移动速度和分析时间。还可以选择该装置的尺寸以减小持续一个足够的分析运行所需要的流体的量。

[0104] 大横截面通道和小横截面通道是具有允许在两个(或三个)物流中生成并保持一个层流的适合尺寸的那些通道。两个物流的层流意指这些流是并排地并且是稳定的。因此，典型地不存在其中这些流体再循环的区域并且湍流是最少的。典型地，通过小通道如微型通道提供此类条件。

[0105] 用于分散测量的装置是本领域已熟知的，并且例如通过耶格尔等人[11]进行描述。本发明人已在此类装置的接头处引入一个大横截面通道。

[0106] 该大横截面通道是其中组分溶液的流体与空白溶液的流接触的区域。然后这些流通过大横截面通道导向小横截面通道中。在小横截面通道中监控该一种或多种组分到该空白流中的扩散。

[0107] 大横截面通道是与小横截面通道流体连通的。

[0108] 大横截面通道是与用于供应空白流体的一个或多个储罐流体连通的。

[0109] 大横截面通道是与用于供应组分流体的一个储罐流体连通的。

[0110] 可以通过一个供应通道从一个储罐向大横截面通道提供流体。因此，该装置可以包括一个组分流体流供应通道和一个空白流体流供应通道。

[0111] 在此提到一个通道是提到具有一个基本上矩形的横截面的一个通道。因此，该通道可以是由一个基本上平的基底(具有基本上垂直于该基底延伸的多个壁)和任选一个顶盖形成的。典型地，该基底和这些壁被形成为一个硅衬底。该盖可以是一个玻璃盖，例如一个标准玻璃载片或一个硼硅酸盐晶片。

[0112] 大截面通道可以被称为一个收敛喷嘴。

[0113] 大横截面通道可以具有带有一个基本上恒定的最大宽度的区域，然后在下游是一个收敛区域，在该收敛区域中通道的宽度变窄直到该宽度匹配小横截面通道的宽度为止。

[0114] 或者，大横截面通道可以仅包括一个收敛区域，在该收敛区域中该通道的宽度从一个最大宽度变窄直到该宽度匹配小横截面通道的宽度为止。

[0115] 收敛区域变窄的速度可以是恒定的。

[0116] 收敛区域变窄(喷嘴的角度)的精确速度并没有特别限制，因为该变窄通常远离组分流。然而，本发明人已大体上发现喷嘴具有范围40°至70°、如50°至70°、如55°至85°内的角度。在此，该角度是相对于组分流在宽横截面通道中的流动方向。

[0117] 提到宽度是提到该通道中的扩散尺度(在一些现有技术参考文献中被称为d)。

[0118] 大横截面通道的最大宽度w是大于小截面通道的宽度的。

[0119] 在一个实施例中，没有截面是具有比小横截面通道的宽度更小的宽度的大横截面通道。在一个实施例中，大横截面通道的最小宽度是与小横截面通道的宽度相同的。

[0120] 大横截面通道的最大宽度w可以是至多500μm、至多700μm、至多1,000μm、至多2,000μm、至多5,000μm或至多10,000μm。

[0121] 通常大于10,000μm的通道宽度是不实际的，因为制成该装置的材料(典型地是PDMS)可能会松弛。

[0122] 大截面通道的最大宽度w可以是至少50μm、至少100μm、至少200μm或至少500μm。

[0123] 在一个实施例中，大横截面通道的最大宽度可以是在选自上文所给出的上限值和下限值的范围内。例如，该宽度可以是在范围200至5,000μm、如200至1,000μm或如1,000至5,000μm内。

[0124] 大截面通道的长度是至多500μm、至多700μm或至多1,000μm。

[0125] 大截面通道的长度可以是至少10μm、至少50μm、至少100μm或至少200μm。

[0126] 在一个实施例中，大横截面通道的长度可以是在选自上文所给出的上限值和下限值的范围内。例如，该长度可以是在范围50至500μm、如100至500μm内。

[0127] 在大横截面通道包括具有带有基本上恒定的最大宽度的一个区域和其中宽度收敛至小横截面通道的宽度的一个下游区域，具有带有基本上恒定的最大宽度的该区域可以是该大横截面通道总长度的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

[0128] 小截面通道在其整个长度上具有一个基本上恒定的宽度。

[0129] 小截面通道的宽度可以是至多500μm、至多700μm、至多1,000μm或至多2,000μm。

[0130] 小截面通道的宽度可以是至少5μm、至少10μm、至少50μm、至少100μm或至少200μm。

[0131] 在一个实施例中，小横截面的宽度可以是在选自上文所给出的上限值和下限值的范围内。例如，该宽度可以是在范围10至500μm。

[0132] 在一个实施例中，大截面通道的最大宽度是小截面通道的宽度的至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少5倍或至少10倍。

[0133] 在一个实施例中，大截面通道的最大宽度是小截面通道的宽度的至多20倍、至多50倍或至多100倍。在一个实施例中，大横截面通道相对于小截面通道的最大宽度可以是在选自上文所给出的上限值和下限值的范围内。例如，大横截面通道的最大宽度可以是在小截面通道宽度的5至20倍范围内。

[0134] 小截面通道的长度可以是适用于允许组分流中的最大组分扩散到形成空白流边界的通道边缘的长度。因此，在流体流到达小截面通道末端时，存在于组分流中的所有组分已到达最大熵构型中。

[0135] 在其他实施例中，小截面通道具有允许检测空白流中的最大组分的一个足够的长度。在此，不需要最大组分到达其最大熵构型中。

[0136] 大截面通道的长度是从空白流体流和组分流体流接触的点到大截面通道的通道宽度匹配小截面通道宽度的点的距离。

[0137] 小截面通道从大横截面通道接收空白流体流和组分流体流。可以收集从小横截面通道排出的流体以用于进一步分析。因此，小横截面通道是与一个样品收集储罐流体连通的。

[0138] 小截面通道的长度是足以允许最大的分子从该流中扩散到该空白流中的。对于具有在此所述的分子量的聚合物，具有1mm长度或更大长度的小截面通道长度通常是足够的。在一个实施例中，小截面通道是至少0.5mm、至少1mm、至少2mm或至少5mm长。

[0139] 在一个实施例中，小截面通道是至多10mm、至多20mm或至多50mm长。

[0140] 在一个实施例中，小横截面长度可以是在选自上文所给出的上限值和下限值的范围内。例如，该小截面通道长度可以是在范围0.5至50mm、如1至20mm内。

[0141] 这些流体的流动是沿着小横截面通道的纵轴。在组分流中的组分到空白流中的扩散是横向于流动的纵轴，穿过通道宽度。

[0142] 小横截面通道可以是基本上直线的并且与大横截面通道一致。在一些实施方案中，该小截面通道的至少一部分是旋绕的。因此，该小截面通道可以例如包括一个圈或一系列圈。使用旋绕的几何结构允许使该装置的大小最小化。使用旋绕的路径也可以在一个单一检测区域内提供多个流动通道。在一个单一检测区域内，多个通道(与不同流动距离相对应并因此具有不同扩散时间)可以穿过一个检测器以允许进行多个且同时的测量。

[0143] 小横截面通道可以是与一个次要射流装置的一个流体通道流体连通的。该次要射流装置可以是用于分析该流中的这些组分的一种物理性质或化学性质的一种装置。

[0144] 因此，本发明可以用其他射流装置串联地使用以获得流体流中的组分的特征数据。

[0145] 微流体装置可以被提供有供应通道，以在该储罐与大横截面通道之间提供流体连通。在两个空白流被提供到大横截面通道中的情况下，每个空白流可以被独立地从不同储罐中递送出来。然而，每个流体空白流可以是从一个单一储罐中提供，该储罐通过两个供应通道连接到大横截面通道。

[0146] 每个储罐可以是连接到微流体装置的一个供应管线的一个注射器。该注射剂可以是在适当编程的计算机控制下，该计算机能够大致地(indecently)控制流体从该储罐到该大截面通道的流速。此类装置的控制是本领域已熟知的。

[0147] 或者，每个储罐可以作为微流体装置的部分来提供。

[0148] 在其他实施例中，来自一个或多个储罐的流体流可以是一个重力供料。

[0149] 根据本发明的并且用于在此所述的方法中的一种射流装置可以是使用本领域已知的标准技术制备的。因此，可以使用光刻法以一种适当衬底如一种硅树脂衬底形成流体通道和任选地流体储罐耶格尔等人[11]所述的技术可以与对光刻掩膜的适当改变一起用于在适当时适应一个大横截面通道和额外空白流通道的引入。

[0150] 通过光刻技术制备的流体通道可以是通过提供流体接近端口和排出端口，例如通过钻入该衬底中以提供对相关通道的接近来完成。在外部储罐如注射器用于将流体直接供应到大横截面通道或者供应到一个供应通道中的情况下，可以使用一种适当的歧管。

[0151] 射流装置可以与适当编程且可编程的计算机结合用于控制进入大横截面通道中的流动并且用于管理检测装置。该计算机也可以分析所记录的数据并且提供实时扩散值。

[0152] 该装置适用于与一种检测器整合，以用于测量在小横截面通道中的该一种或多种组分的径向扩散。

[0153] 可以选择通道深度以减小分析扩散穿过通道宽度的时间尺度(从而减小接近稳态溶液所使用的时间)。可以选择通道的深度以便使与最深通道相关的人工制品最小化或消除该人工制品(参见耶格尔等人，生物物理学(Biophysical))。可以选择通道的深度以便使与非常浅的通道相关的负载问题和高流体阻力最小化或消除这些问题和阻力(出处同上)。

[0154] 在一些现有技术参考文献中，通道的高度或深度被称为宽度w。

[0155] 纵横比是通道宽度与通道高度的比率，它可以是100或更小、50或更小、25或更小或者10或更小。

[0156] 纵横比可以是1或更大、2或更大、4或更大或者5或更大。

[0157] 在一个实施例中，纵横比可以是在选自上文所给出的上限值和下限值的范围内。例如，该纵横比可以是在范围5至100内。

[0158] 通常较大纵横比如4或更大是有利的，因为充分展开的速度曲线穿过通道高度将是抛物线的并且穿过通道宽度将是近似钝形的(参见耶格尔等人，生物物理学)。

[0159] 大截面通道和/或小截面通道的通道高度(或通道深度)并没有特别限制，除以上所讨论的考虑因素之外。大横截面通道和小横截面通道的通道高度可以是相同的。通道高度贯穿该大横截面通道和小横截面通道是基本上恒定的。在一个实施例中，通道高度是至少5μm、至少10μm或至少15μm。

[0160] 在一个实施例中，通道高度是至多30μm、至多50μm、至多100μm或至多500μm。

[0161] 在一个实施例中，通道高度可以是在选自上文所给出的上限值和下限值的范围内。例如，该通道高度可以是在范围10至50μm内。

[0162] 由现有技术已知的通道典型地具有范围10至100μm内的深度(参见耶格尔等人，[8、11和12])。

[0163] 如以上所注的，可以相对于通道的宽度选择通道的深度以提供一个适合的纵横比。

[0164] 不需要彼此分离这些层流以便进行分析性分析。分析测量可以穿过组分流和空白流二者来记录。

[0165] 本发明的第三方面的方法利用一种射流装置，该射流装置包括与用于空白流和组分流的供应通道流体连通的一个通道。在本发明的此方面通道的尺寸可以与在本发明的第一方面和第二方面的方法和装置中的小横截面通道的尺寸相对应。

[0166] 本发明的装置可以包括与大横截面通道流体连通的供应通道。每个供应通道的尺寸并没有特别限制并且可以与小横截面通道相似或相同。在一个实施例中，每个供应通道具有大于小横截面通道的宽度的一个宽度。在一个实施例中，每个供应通道具有小于小横截面通道的宽度的一个宽度。

[0167] 在一个实施例中，本发明的方法利用电泳扩散来允许一种组分移动穿过该流体流，例如从组分流移动到缓冲液流。例如，射流装置可以被提供有与扩散通道(小横截面通道)相邻地安排的电极并且这些电极可以被适配用于与一个电源和控制器电连通，以控制电压和电流。通过席琳等人[37]描述用于指导一个流体通道中的组分移动的适合仪器.[0168] 检测

[0169] 本发明的某些方法包括测定一种或多种组分穿过一个流体通道的分布的步骤。对于测量一种聚合物到空白流中的扩散的方式并没有特别的限制，并且所采用的检测方法可以是基于有待检测的组分的性质。

[0170] 该检测器是适用于与流体流通道并且特别是微流体通道一起使用的一种检测器。扩散检测方法是本领域已熟知的，并且例如通过耶格尔等人[11]进行描述。实例包括紫外可见光法、荧光或发光光谱法、以及其他方法。

[0171] 可以在小横截面通道的一个位置处确定这种或这些组分的分布。然而，特别是在存在两种或更多种组分的情况下，可以在沿着较小横截面通道内的两个或更多个如三个、四个或五个位置处确定组分分布。如以上所注的，该方法可以包括确定多种组分在小宽度通道的多个位置处的扩散曲线的步骤。

[0172] 在组分流中的一种组分已扩散到装置边界的通道边缘到空白流体流之前应记录至少一个扩散测量值。将最快扩散到通道边缘的组分是组分流中的最小组分。

[0173] 对于未知组成的一种样品，可以建立一个试验流，以确定第一组分到达边界边缘的哪一点。第一扩散测量值可以因此在此点的上游获取。

[0174] 或者，可以在小横截面通道的一个非常早的点处进行一个第一扩散测量。

[0175] 在沿着小横截面通道进行多次扩散测量的情况下，每个第二测量并随后沿着该通道的测量位置并没有特别限制。典型地，在沿着小截面通道的足够远的距离处获取随后的测量值以获得与先前测量值的有用差值的扩散曲线。

[0176] 在本发明的方法中，建立组分流和空白流的一个层流并且将其提供在小横截面通道中。当建立该流时，沿着该小横截面通道提供一个扩散梯度。因此不同扩散时间的数据可以是通过分析沿着小横截面通道的两个或更多位置处的扩散曲线来同时获得的。

[0177] 本发明的方法不需要分离空白流与组分流。因此，在该组分流与该空白流接触时可以测量该一种或多种组分的扩散曲线。

[0178] 耶格尔等人[11]描述了在具有一个组分流(具有一种单一组分)和一个空白流的一个通道中的一个单一测量位置处的扩散曲线的测量。

[0179] 在US 2006/263903的流体系统中，在一个横向通道区域中接触一段时间之后，空白流从组分流中转移。在接触点处，组分流中的一种组分可以扩散到空白流中。分析单独的空白流并且定量组分的量。为了获得该组分的一个扩散系数值，需要以多个不同的流速随着时间获取空白流、组分流或二者的若干个测量值。

[0180] 在分析之前，可以标记感兴趣的组分以允许以本发明的方法进行检测。该标签可以利用一个化学基团的形式，该化学基团是可通过例如标准紫外可见光法、荧光或发光光谱法检测的。

[0181] 组分和组分流

[0182] 本发明可以用于测定一种组分的扩散系数并因此测定流体动力学半径。在本发明的一个优选的实施例中，该组分是或者包括一种聚合物。

[0183] 本发明可以用于测定例如在溶液中的一个单一组分的扩散系数。然而，本发明可以有利地用于测定在一个流体中的两种或更多种组分的扩散系数。

[0184] 每个组分可以溶解于该流体中。然而，本发明还可以用于研究分散于一个流体中的组分。因此，在该方法中使用的流体可以是胶质，并且可是一种溶胶或一种乳状液，其中该组分是分散相。

[0185] 含水流体典型地用于本发明的方法中。出于进行本发明的方法的目的，这种或这些组分可以被纳入溶液中。这些组分已处于溶液中并且此溶液可以直接用作流体。或者，这种溶液可以在适当时浓缩或稀释，以用于最佳分析。出于使溶液中的这些组分稳定的目的，例如出于维持该组分的结构完整性或保持溶液中的这些组分的目的，该溶液还可以包含额外试剂。例如，这些组分可以被提供在一种缓冲溶液中。

[0186] 含水流体流可以是在适用于维持该流内的这些组分的完整性的一个pH下。该pH可以是在从pH 4至10、如5至9、如6至8的一个范围内。

[0187] 该pH可以是生理pH。

[0188] 或者，可以选择含水混合物的pH，以便引起混合物的组成改变，如聚集事件和分离事件，这些可以使用本发明的方法进行监控。

[0189] 一个含水流体流可以额外包含一种易混合有机溶剂。这可以被提供来保留溶液或悬浮液中的组分。例如，DMSO可以与水一起使用。有机溶剂可以高至25％、高至20％、高至10％、高至5％或高至1％v/v存在。

[0190] 根据本发明的方法进行分析所需要的组分的量并不大，并且非常少量的材料可以穿过该微流体装置。还可以收集从小截面通道中排出的流体，并且这可以例如在适当浓缩所收集的流体流之后重新分析。

[0191] 提到一种组分混合物是提到具有不同分子量和/或不同扩散率的两种或更多种组分的一种溶液。该组合混合物可以具有三种、四种、五种或更多种组分，每种组分具有不同的分子量和/或不同扩散率。

[0192] 提到一种组分可以是指一种聚合物。一种聚合物可以是或者包括一种多肽。

[0193] 提到多肽包括提到蛋白质、抗体。一种聚合物可以是或者包括一种多糖。

[0194] 一种聚合物可以是或者包括一种多核苷酸。

[0195] 在一个实施例中，一种组分可以包含结合另一种化合物的一种聚合物。另一种组分可以是在此所述的一种组分。在一个实施例中，一种组分可以包含保持在聚集物中的两种或更多种聚合物。例如，该组分可以包含两种或更多种多肽。如在此所述的，本发明方法可以用于检测聚集物如多肽聚集物的形成。

[0196] 在一种组分包含两种或更多种聚合物的情况下，这些聚合物可以通过共价键或非共价键或其组合保持在一起。聚合物之间的共价键的实例可以包括酯、酰胺和二硫键。非共价键的实例包括氢键、离子键、以及相互作用，以及其他非共价键。

[0197] 在一个实施例中，该组分是具有范围1至500nm、如5至100nm的一个最大尺寸的一种纳米颗粒，如一个颗粒。该颗粒可以是一种金属纳米颗粒。该金属可以是或者包括金或银。

[0198] 本发明适用于测定具有300Da或更大、500Da或更大、1,000Da(1kDa)或更大或者2kDa或更大的分子量的聚合物分子的扩散率。

[0199] 本发明适用于测定具有5kDa或更小、10kDa或更小、50kDa或更小或者100kDa或更小的分子量的聚合物分子的扩散率。

[0200] 本发明适用于测定具有至少0.05nm、至少0.1nm、至少0.5nm、至少1nm或者至少5nm的半径的聚合物分子的扩散系数。

[0201] 本发明适用于测定具有至多10nm、至多15nm、至多25nm、至多50nm、至多100nm、或至多200nm、或至多500nm的半径的聚合物分子的扩散系数。

[0202] 具体地说，本发明特别适用于测定具有范围0.5至500nm、如0.5至200nm、如0.5至15nm的半径的生物聚合物如多肽的扩散系数。

[0203] 本发明的方法包括测量组分到空白流中的扩散的步骤。这些组分可以是使用标准分析技术如荧光光谱法、发光光谱法、紫外可见光光谱法以及其他方法可检测的。例如，在该组分是一种多肽的情况下，该多肽可以是通过荧光光谱法进行检测的。

[0204] 在一些实施例中，可能需要标记一种组分以允许在小截面通道中检测到它。该标签是一种可分析检测到的原子或基团。

[0205] 在一个实施例中，该标签可以是共价连接到该组分的一个紫外可见光标签、荧光标签或发光标签。此类标签通常用于生物分子，如多肽、多核苷酸和多糖。用于本发明中的一个标签的实例是荧光素。用于本发明中的这些标签与它所连接的组分相比典型地是相对小的。因此，该标签基本上不会改变该组分的扩散特性。

[0206] 在适当时，一种组分可以具有多个标签，以辅助检测。

[0207] 提到一种组分可以被认为提到具有一个分析标签的一种组分。

[0208] 本发明的一个优点是在一个组分流中的每种组分可以是相同地标记的。本发明的方法能够基于该组分的扩散曲线区分并鉴别组分。不需要使用单独的且不同的标签来标记感兴趣的组分。

[0209] 可以独立于空白流的流速改变组分流的流速。

[0210] 该组分流可以是由含有一种或多种组分的一种分析样品生成的。在适当时可以稀释或浓缩该分析样品以提供一种组分流体，该组分流体适合于流过在此所述的一种装置并且适合用于检测。

[0211] 可以选择该流体中的这些组分的浓度，以便确保这些组分本身对流体的粘度不具有作用。可以选择该流体中的这些组分的浓度，以便确保这些组分在该流体流内可容易检测。

[0212] 原则上，用于这些方法中的最大浓度可以是该流体用这些组分饱和的浓度。

[0213] 本发明人已发现，具有浓度低至0.1μM、例如低至0.5μM、包括低至1μM的组分的流体可以用于本发明的方法中。在这些浓度下，可以获得有意义的分布曲线。在较低浓度下，这些组分可能难以在小横截面通道中检测到，并且信噪比可能较差。

[0214] 当然，分析样品的精确组成可能并不知道，并且该流体的生成可以是基于一系列初始测试运行，以建立使用条件。该流体的制备还可以是基于样品的初步分析，以提供至少一个大体的浓度指示。

[0215] 空白流体和空白流体流

[0216] 本发明的方法包括监控一种或多种组分从一个组分流到一个空白流中的扩散的步骤。

[0217] 在一个实施例中，该空白流体可以是与没有组分的组分流相同的。

[0218] 在一个实施例中，该空白流体是一种缓冲液。

[0219] 典型地，该空白流体流和该组分流是水流。

[0220] 在一个实施例中，该空白流体可以包含额外试剂，其中此类试剂是用于与组分流中的一种或多种组分相互作用。在本发明的一些实施例中，提供了一种用于测定一种分析物浓度的结合测定。在此，例如，在该空白流中的一个已知浓度的一种试剂与来自组分流的一个配对物的相互作用允许通过结合试剂的部分组分确定该组分的浓度。此类方法特别适用于其中该试剂是一种抗体并且该组分是一种抗原的情况。

[0221] 可以独立于组分流的流速改变空白流的流速。

[0222] 在一些实施例中，在该组分流的两侧提供两个空白流。本发明的方法可以因此着眼于该组分流中的多种组分到一个或两个空白流中的扩散。使用两个空白流是有利地，因为这些可以用于在该组分流上提供一个稳定的平衡压力。

[0223] 典型地，两个空白流的组成是相同的。典型地，两个空白流的流速是相同的。

[0224] 扩散系数的分析和测定

[0225] 本发明提供了用于测定一个流体中的一种或多种组分的扩散系数的方法。

[0226] 在该组分流体包含一个单分散组分的情况下，可以使用标准技术测定该组分的疏水半径。这例如通过耶格尔等人[8、11和12]进行描述。在本发明的第一方面的方法中记录的扩散曲线可以被认为是组分的扩散鉴于以下事实而更具有代表性：大横截面通道限制了该装置的接头处的停滞作用。因此，计算的扩散系数值和疏水半径可以被认为是具有较大准确度的。

[0227] 在该组分流体包含一种多分散组分混合物的情况下，本发明提供一种用于测定该混合物中的两种或更多种或每一种组分的扩散系数的方法。这与本领域已知的方法相反，该方法典型地仅提供整体混合物的一个平均扩散值。在本发明的第三方面的方法中，在不同扩散时间内记录多个扩散测量值。

[0228] 如在此所注的，本发明的方法提供了两个层状流体流。以低雷诺数进行这些方法，其中对流和扩散是质量运输的仅有的相关机制。这简化了组分移动在一个通道内的模拟。

[0229] 通常，所记录的扩散谱相对于对一个范围的组分测定的一系列理论扩散曲线去卷积，这些组分具有这些组分在研究中的可能半径范围内的疏水半径(和因此的扩散系数)。去卷积步骤使记录的数据拟合由最可能的个别理论扩散曲线集合构成的总体曲线。对于与实验误差一致的最简单溶液进行该拟合。在上下文中，提到最简单溶液是提到一个最高熵正规化。

[0230] 参考一个生成的基底函数，进行所记录的扩散曲线的去卷积。该基底函数是一个理论扩散曲线的集合，其中每个理论曲线是对于具有一个特定流体动力学半径的一个组分。该集合是由一个流体动力学半径范围的曲线构成。对于含有多肽的样品，例如，这些曲线跨越可能的多肽组分半径范围，如0.5至200nm、如0.5至15nm。

[0231] 在最大熵正规化的情况下，使用最小二乘法拟合进行所记录的数据的回归分析。与模拟的基底函数结合，所记录的空间分布可以被去卷积成个别扩散曲线的一个图谱。

[0232] 上文所述的去卷积方法是有利地，因为它们提供在含有最少信息的最佳拟合的误差内的溶液。这进而防止该数据的所谓过度拟合。

[0233] 在另外的详情中，本发明方法允许进行准确数值计算，以确定给定大小的物质的核心。在流实验中获取的扩散曲线然后被总体拟合到预测核心的一个线性叠加，其中每个核心的振幅是通过一个受限的最小平方拟合来确定的，其中这些系数被限制成间隔0至1，以确保其被物理解释为分级浓度。在拟合中的残差提供了测量值误差的一个评估。然后进行一个第二系列的最小平方拟合，此时距最大熵正规化。熵术语是幅度逐渐增加，直到正规化拟合的x2值不同于随机误差水平的非正规拟合的值为止。然后此最终拟合的系数是与实验误差一致的最简单(最高熵)溶液。

[0234] 在最小平方拟合提供了实验数据中的噪声水平的一个评估时,具有该技术的总体精密度的一个评估是有用的。在此，通过以不同水平的添加的随机噪声生成人工数据的一个大数据集来获得此评估。图5描述了两个最相关的测量值精密度(测定一个单一物质的扩散系数的精密度)和两个分散物质之间的扩散系数的最小可分辨差值(用于使随机噪声水平不同)。此方法忽略了引入的任何系统误差，例如在装置制造过程中或者通过样品的不均匀照射。

[0235] 一个组分的流体动力学半径可以是通过扩散系数确定的，如本领域已知的。

[0236] 这些扩散曲线还可以用于确定组分流中的多种组分的浓度，如本领域已知的。

[0237] 本发明的方法

[0238] 在一个方面，本发明提供了一种用于测定一个组分混合物中的一种组分或每一种组分的扩散系数的方法。该方法包括以下步骤：

[0239] (i)提供包含一种或多种组分的一个组分流体流；

[0240] (ii)提供一个空白流体流；

[0241] (iii)在一个大横截面通道中使流(i)与流(ii)接触，从而生成两个层流；

[0242] (iv)允许在(iii)中生成的这些层流从大横截面通道中流入一个小横截面通道中；

[0243] (v)在该小横截面通道中测量该一种或多种组分从该组分流到该空白流体流中的径向扩散。

[0244] 本发明的方法典型地在具有一个低雷诺数的流中进行。例如，一个流的雷诺数可以是1或更小、0.5或更小、0.1或更小或者0.05或更小。

[0245] 在一个实施例中，流体流速是至少1、至少5、至少10、至少50或者至少100μLh-1。

[0246] 在一个实施例中，流体流速是至多200、至多400、至多500、至多1,000、至多2,000或者至多5,000μLh-1。

[0247] 在一个实施例中，该流速是选自一个范围的一个值，该范围具有选自以上值的上-1限值和下限值。例如，该流速可以是在范围5至400μLh 内。

[0248] 流体流速是在稳态下的流速。

[0249] 使用具有在以上所指示的范围内的流速的微流体装置意指在一次分析运行中可以使用相对少量的组分流体。例如，出于获得至少一个扩散曲线读数的目的，在该范围内的体积是足以在小横截面通道内建立一个稳态流的。

[0250] 在一个实施例中，用于该组分流体流中的流体的总体积是至多50、至多100、至多200、至多500或者至多1,000μL。

[0251] 在一个实施例中，用于该组分流体流中的流体的总体积是至少0.1、是至少0,5、是至少1、是至少5或者是至少10μL。

[0252] 在一个实施例中，用于组分流体流中的流体的总体积是选自一个范围的一个值，该范围具有选自以上值的上限值和下限值。例如，该总体积可以是在范围1至50μL内。

[0253] 本发明的方法可以是在室温下或大约在室温下，例如15℃、20℃或25℃下进行的。或者，本发明的方法可以是在较低温度如5℃或10℃下或者在较高温度如35℃、40℃或50℃下进行的。

[0254] 在一个实施例中，在多个扩散时间测量一种或多种组分从该组分流到该空白流体流中的径向扩散。在测量点之间的分离没有特别限制，但是可以具有足够的距离，使得所记录的扩散曲线在测量点之间显著改变。

[0255] 在一个实施例中，该方法包括在一段时间之后重复步骤(i)至(v)，从而随着时间分析一种组分流体的组成。在此实施例中，该方法可以用于监控该组分流体的改变，如这些组分的聚集或者可以是一种聚集物的一种组分到更小部分的分离。在此描述了一种用于分析淀粉样蛋白的聚集物的方法。

[0256] 在一个实施例中，该方法进一步包括步骤(vi)，其中一种组分的一个扩散系数值是由步骤(v)的径向扩散测量值确定的，并且任选地一个流体动力学半径是由一个扩散系数值确定的。

[0257] 在一个实施方案中，步骤(vi)包括比较来自步骤(v)的一种或多种组分的测量的径向扩散曲线与具有已知流体动力学半径的组分的一系列分布，从而确定该一种或多种组分中每一种的流体动力学半径。

[0258] 在一个实施方案中，步骤(vi)包括使用关于具有已知流体动力学半径的组分的一系列分布的一种最高熵正规化方法，使来自步骤(v)的一种或多种组分的测量的径向扩散曲线去卷积，从而确定该一种或多种组分中每一种的流体动力学半径。在此实施例中，可以使用一种最小平方分析。具有已知流体动力学半径的组分的该系列分布可以是一系列预测的分布。

[0259] 在本发明的一种替代方法中，提供了一种用于测定一种或多种组分的扩散系数的方法，该方法包括以下步骤：

[0260] (i)提供包含一种或多种组分的一个组分流体流；

[0261] (ii)提供一个空白流体流；

[0262] (iii)在一个通道中使该流(i)与该流(ii)接触，从而生成两个层流；

[0263] (iv)在多个扩散时间测量该一种或多种组分从该组分流到该空白流体流中的径向扩散。

[0264] 在测量点之间的分离没有特别限制，但是可以具有足够的距离，使得所记录的扩散曲线在测量点之间显著改变。

[0265] 以上所讨论的流速、体积和温度也可适用于此方法。

[0266] 在一个实施例中，本发明的第一方面和第二方面的特征可以被有利地组合，以提供一种用于以提高的准确度分析一种组分流体的方法。该方法因此可以包括以下步骤：

[0267] (i)提供包含一种或多种组分的一个组分流体流；

[0268] (ii)提供一个空白流体流；

[0269] (iii)在一个大横截面通道中使流(i)与流(ii)接触，从而生成两个层流；

[0270] (iv)允许在(iii)中生成的这些层流从大横截面通道中流入一个小横截面通道中；

[0271] (v)在多个扩散时间测量一种或多种组分从该组分流到该空白流体流中的径向扩散。

[0272] 使用大横截面通道的优点和记录多个扩散曲线的优点因此可以集合在一起。

[0273] 其他参数选择

[0274] 在此明确披露了以上所述的实施例的各个和每个相容性组合，就像单独地且明确地叙述各个和每个组合一样。

[0275] 鉴于本披露，本领域技术人员将清楚本发明的多个不同的其他方面和实施例。

[0276] 在此使用的“和/或”应当理解为明确地公开了两个具体特征或组件中的每一个(具有或不具有另外一个)。例如，“A和/或B”应当理解为明确地披露了(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一种情况，就像在此单独地列出每一种情况一样。

[0277] 除非上下文中另外指出，否则上述列出的特征的描述和定义并不限于本发明的任何特定方面或实施方式，并且等同地应用于所描述的所有方面和实施例。

[0278] 现在将仅借助于实例并参照以上所述的附图来说明本发明的某些方面和实施例。

[0279] 实验

[0280] 使用标准软刻蚀技术[20,14]将微流体通道制造成在硅掩膜上具有SU-8光刻胶的聚二甲基硅氧烷(PDMS；道康宁公司(Dow Corning))。将这些通道等离子体结合至玻璃载片，以形成密封装置。该通道高度是25μm。通道宽度在该装置的不同区域是不同的-在小横截面通道中该宽度是300μm，在喷嘴处从3,000μm收缩(大横截面通道)。将缓冲液(空白)流体和分析物流体引入该喷嘴中的通道的宽度是100μm。用于在此所述的实验中的装置示出在图1a和图1b中。在以下还描述了另外的制备详情。

[0281] 注射器泵(哈佛仪器(Harvard Apparatus))用于控制流体流。

[0282] 用于本发明的25nm和100nm胶质是来自西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)的聚苯乙烯胶质，它是在用荧光素预先标记的情况下供应的。这些胶质被提供在去离子水中。所使用的流速典型地是4μL/h。

[0283] 用于本发明的蛋白质是胰高血糖素、β-乳球蛋白和牛血清白蛋白，它们全部都可从西格玛奥德里奇公司获得。这些蛋白质是荧光标记的。这些蛋白质被提供在具有20％DMSO的pH 8 50mM磷酸盐缓冲液中。用于蛋白质实验的流速典型地是40μL/h。

[0284] 这些组分在该通道中的扩散是通过使用标准技术穿过通道进行荧光检测来测量的(也参见耶格尔等人[11]等)。暴露时间典型地是10s。

[0285] 将Aβ(1-42)克隆到“PetSacKan”质粒中，在大肠杆菌BL21细胞中重组表达，并且使用阴离子交换色谱法以分批模式进行纯化。此程序允许产生大量的高纯度肽[18]。将所得的肽分成1mL等分试样，将其冻干并保存在-20℃，直到进一步使用为止。

[0286] 扩散光谱法研究复合蛋白质缔合过程如在此所述的那些过程的应用依赖于使用最近详细报道的一种非微扰性共价标记技术。考虑到扩散光谱法的主要优点是其获得一种异质混合物中的颗粒大小的光谱的能力，从而选定允许扩散流动在观察下可视化的一种标记技术，荧光共价标记是最佳方法。荧光标记有助于使用一个常规光学显微镜检查设置来方便采集高信噪比图像。共价标记确保该异质混合物内的所有物质被标记并且因此能够被检测。在历史上，蛋白质复合物的共价荧光标记是具有挑战性的。如果用一种荧光染料标记所形成的蛋白质复合物，未结合染料必须在分析之前从反应混合物中去除，并且所需的纯化步骤破坏了瞬时形成的缔合物质的结构。

[0287] 或者，个别蛋白质可以在其缔合之前被标记并从未结合染料中纯化，但是甚至一种荧光报道基因的位点特异性安装较大或较小程度上破坏了复合物缔合。在此，用一种潜在荧光团标记所形成蛋白质复合物。因为仅标记的蛋白质和蛋白质复合物是荧光的，所以不需要纯化步骤，并且荧光标记物质的异质混合物用扩散光谱法直接分析。

[0288] 在碱性pH下并且在一种硫醇(在此，β-巯基乙醇，BME)存在下，在蛋白质和蛋白质复合物的表面上暴露的胺与邻-苯二醛(OPA)反应以在原位形成一种双环、异吲哚型荧光团[15、16]。

[0289] 尽管最初观察到此过程的快速动力学[2]，它对于分析蛋白质混合物的应用通常限于针对后置柱或前置柱肽衍化[13、17]或者针对生物组织内少量氨基酸的定量检测[21、6]的努力。

[0290] 本发明的示例性装置

[0291] 图1a和图1b是根据本发明的一个实施例的一种微流体装置的示意图。图1a是所使用的一种装置的3D表示图，该装置具有一个组分流体流和多个空白流体流，在该表示图中具有分析物在喷嘴处的分布的插图以及在从如下所述的小横截面通道开始的1mm、3mm和9mm处的三个测量点的插图。图1b是该装置的平面图。

[0292] 图1a示出了在小横截面通道中的牛血清白蛋白和β乳球蛋白的一种混合物的扩散。

[0293] 用于本发明的一种装置1可以包括在一个喷嘴的一个接头处接触一个空白流体流供应通道3a的一个组分流体流供应通道2，该喷嘴是一个大横截面通道4。在多个优选的实施例中，提供两个空白流体流供应通道3a和3b，如图1b所示的。该组分流体流供应通道2可以是与一个上游组分流体储罐5流体连通的，该组分流体储罐可以包括一个可控注射器或者可以是该可控注射器的一部分(未示出)。每个空白流体流供应通道3a和3b可以是与一个上游空白流体储罐6流体连通的，该空白流体储罐可以包括一个可控注射器或者可以是该可控注射器的一部分(未示出)。一个储罐6可以供应两个空白流体流通道3a和3b。

[0294] 在大横截面通道下游并且与其流体连通的是一个小横截面通道7。该小横截面通道7可以具有一个弯曲(旋绕)路径，如图1b所示的。该小横截面通道7被适配为与一个分析检测器(未示出)一起使用，该分析检测器可以被安排来在沿着小横截面通道7的一个或多个位置处分析存在于该通道中的一个流体中的多种组分。该分析检测器可以被安排为穿过小横截面通道的两个或更多个截面同时检测一个流体中的多种组分，如通过检测区域8说明性地示出的。该小横截面通道可以是与一个下游收集储罐9流体连通的。

[0295] 大横截面通道4典型地具有一个横截面，该横截面是该小横截面通道7的横截面的十倍。因此，在图1a中，插图显示该小横截面通道7的宽度是300μm(这在9mm图像中是清楚的，其中该组分已扩散到空白流体流的边缘，其中该流体接触该通道壁)。大横截面通道4具有3,000μm的最大宽度。

[0296] 大横截面通道4具有从该接头延伸的恒定宽度的一个区域。然后该通道逐渐减小(以与该流体流动方向成约60°的角度)，直到该通道是小横截面通道7的宽度为止。大横截面通道7从该接头(其中该组分流体供应通道和空白流体供应通道相遇)到小横截面通道7开始的长度可以是约100μm。

[0297] 小横截面通道7的宽度在其整个路径上保持基本上恒定。小横截面通道7从其中大横截面通道4结束的点开始到储罐9的长度可以是在10mm的范围内。

[0298] 本发明的装置用于分析在一个流体中的一种组分如一种多肽的半径，并且优选地分析多种组分的个别半径。提供作为一个射流装置的一个流的组分流体并且测量在流体流中的每种组分到一个相邻空白流体流中的扩散。该空白流体是缺乏该组分的一个流体。

[0299] 射流装置1可以是使用标准软刻蚀技术、使用例如聚二甲硅氧烷作为基底材料来制备的。适合的光刻胶可以是根据所需的流体流通道和储罐的形状和尺寸来制备的。

[0300] 在使用时，一个组分流体被提供到该储罐5中并且被允许流过该组分流体供应通道2，流到该大横截面通道4中，在该大横截面通道中它接触空白流体流。这些空白流体被提供到储罐6并且被允许流过这些组分流体供应通道3a和3b，流到该大横截面通道4。流速可以是通过注射器泵控制的，该注射器泵供应这些供应通道2、3a和3b。或者，该流动是来自储罐5和6的流体的一个重力供料。

[0301] 该组分流体流和这些空白流体流在大横截面通道4中接触并且在这些空白流体流之间形成该组分流体流的一个层流。这些流被允许从大横截面通道4向下游流入小横截面通道7。在组分流体流内的多种组分被允许从组分流体流中扩散到这些空白流体流中。这些组分的扩散可以是在沿着小横截面通道7的一个或多个位置处，例如在检测区域8中测量。典型地，在一个组分(如最小的组分)已到达该空白流体流的边缘之前获取第一个测量值，其中该流体接触该通道壁。一旦进行适当数目的扩散测量，就可以在一个储罐9中收集这些流体流或者就可以允许这些流体流流入到一个第二分析装置中，该第二分析装置是与流体装置1流体连通的。在图1a中示出了在小横截面通道7的长度上的扩散曲线，其中可见白色的组分扩散到较黑的空白流体流中。

[0302] 本发明人已确定在用于检测组分扩散的射流装置中使用一个大横截面通道提供了允许更准确地测定一个流体中的多种组分的半径的一些益处。使用该装置引起用于组分流中的这些组分的良好限定的初始构型，该初始构型从其中组分流和空白流进入小宽度通道7的一点开始。在例如小横截面通道7下游的通道中建立一个恒定速度曲线之前，使用一个大流动通道4使组分的扩散最小化，在该小横截面通道中进行扩散测量。

[0303] 图4示出使用比小横截面通道宽十倍的一个大横截面通道引起一个清洁且限定的组分流。在图4中，示出了从一个组分流体供应通道进入一个大横截面通道中的一个组分流体流(白色)的三个图像。在大横截面通道中的组分流体流似乎是相对清洁的并且从组分流体第一次接触该空白流体流(灰色)的一点来限定。

[0304] 描述图1a和图1b的微流体装置的制备的一个有用的实例列出在以下α-B晶状体蛋白实验中。

[0305] 多组分混合物的分析

[0306] 使用以上所述的微流体装置分析包含等量(按体积计0.02％)的25nm和100nm胶质的一种含水混合物。还制备每种胶质的个别溶液。使溶液以40μLh-1流过该装置并且在480nm使用一个LED光源照射.使用高量子产率CCD照相机获取三次10s暴露,在三个测量点中每一个点处获取一次暴露.

[0307] 在三个不同的扩散时间在从小横截面通道开始的1mm、3mm和9mm处测量扩散曲线(参见图2，底部图)。使用在此所述的一种最高熵正规化方法使扩散曲线的组合去卷积，以显示具有不同流体动力学半径的两种组分的存在(图2，底部光谱)，该流体动力学半径非常紧密配合对于个别胶质所测定的实验来源的值(顶部光谱和从顶部光谱起的第二个光谱)。对于比较，进行一个单个扩散曲线的去卷积(从底部光谱起的第二个光谱)。如可以看出，此去卷积错误地表明在该混合物中的三种不同组分的存在，其中具有一个较小半径的组分被分辨为两个单独的信号。此外，具有一个较大半径的组分被分辨为具有一个较高半径的一个信号。使用多个测量点因此在扩散曲线的去卷积中提供更大准确度和更大分辨率。

[0308] 微流体扩散技术也可以用于分辨蛋白质的多组分混合物。对于蛋白质胰高血糖素、β-乳球蛋白和牛血清白蛋白(BSA)的混合物进行一个第二校准。将每种蛋白质制备为含有20％DMSO的磷酸盐缓冲液中的一种均质溶液以及为该三种蛋白质的一种1:1:1混合物(按质量计)，DMSO用于确保在实验过程中所有蛋白质保持在单体状态并且没有形成未知复合物。

[0309] 这三个蛋白质是荧光标记的。在此,用一个潜在荧光团标记所形成的蛋白质复合物,即仅在结合时是荧光的并且如果游离在溶液中则检测到。因为仅标记的蛋白质和蛋白质复合物是荧光的，所以不需要纯化步骤，并且荧光标记物质的异质混合物用扩散光谱法直接分析。在碱性pH下并且在一种硫醇(在此，β-巯基乙醇，BME)存在下，在蛋白质和蛋白质复合物的表面上暴露的胺与邻-苯二醛(OPA)反应以在原位形成一种双环、异吲哚型荧光团。

[0310] 以与以上相同的方式进行扩散实验。在实验中使用的照射波长是365nm。图6示出了对个别和组合的测试溶液的扩散测量的结果。在与均质溶液中大小类似的大小的混合物中分辨三种物质，尽管与β乳球蛋白和牛血清白蛋白对应的峰稍微更靠近地一起偏移。这可能是实验中的随机误差和系统误差的作用，并且这两个峰在此信噪比水平下接近于微流体扩散实验的分辨力。

[0311] BSA的分析

[0312] 当表征单分散溶液如单一蛋白质时，微流体扩散技术可能是极其精密的。如所证明的，微流体扩散用于研究溶解于pH 7和溶解于具有80％DMSO的相同缓冲液中的蛋白质牛血清白蛋白(BSA)的流体动力学半径的变化。

[0313] 将5mg/mL的BSA溶解于pH 7磷酸盐缓冲液(例如，5mM HEPES缓冲液)，之后在β-巯基乙醇(BME)存在下用OPA进行标记。标准标记混合物是12mM OPA、18mM BME、4％SDS以及200mM碳酸盐的溶液，pH在范围9.5-10.5内。提前制备该溶液并且以与蛋白质溶液的1:1体积比率混合。

[0314] 然后在相同缓冲液和DMSO中将此标记的BSA的储备溶液稀释至1mg/mL(其中最终DMSO浓度是按体积计80％)。使用与以上详述的多组分混合物相同的实验技术测量每种溶液(缓冲液和80％DMSO)中的BSA的流体动力学半径。

[0315] 图7示出了对于每种BSA溶液计算的扩散系数。在水性缓冲液中的BSA的扩散系数与流体动力学半径3.5nm相对应，这可与文献值相比。在80％DMSO中，该蛋白质是显著展开的，其中流体动力学半径是6+0.5nm。

[0316] 胰岛素聚集事件的分析

[0317] 本发明的方法可以用于研究单体、二聚体和六聚体形式的胰岛素共存。胰岛素(可从商业来源获得)可以是在生理pH下共价标记的。可以随着时间测量一种胰岛素样品的组成的变化。因此，可以从该样品中取出等分试样并且使用本发明的一种扩散方法进行测试。扩散曲线的变化可以与该样品、例如增加的聚集物的组成变化连接。还可以在胰岛素样品的pH变化的情况下监控聚集物的变化。例如，可以在pH 2和pH 4下测定聚集物。可以比较在这些样品中的不同物质的群体。

[0318] Aβ(1-42)聚集事件的分析

[0319] 扩散光谱法可以用于分析蛋白质复合物的高异质混合物。用于研究的一种特别具有挑战性的类型的生物分子缔合方法是富含异常β折叠的聚集物的形成方法：该聚集物通常被称为淀粉样原纤维。淀粉样-β，特别是低聚物形式，涉及阿尔茨海默病的主要致病因素之一。在蛋白质溶液经受聚集时获得它的一个大小分布对于理解疾病病理学和聚集的潜在机制是重要的。

[0320] 通常使用原子力显微镜获得淀粉样聚集物的大小分布。然而，AFM技术通常需要降低样品的浓度，这意味着在可以进行测量之前动态复合物可以解离。AFM还在发现真实大小分布方面具有问题,因为分析物在一个表面上的分布很少是均匀的。扩散光谱法是一种整体技术(bulk technique)，并且扩散时间是足够短的，使得样品溶液的组成在其沿着扩散通道行进的整个过程应保持不变。实际上，每个分子在该装置内仅花费约10秒或20秒。另外，用于分析的物质仅稀释至多系数十，这使得解离最小化。

[0321] 图3示出了在从单体蛋白质开始的一个聚集反应中的四个不同时间点的Aβ(1-42)聚集物的大小分布。扩散测量值的详情与以上详述的其他蛋白质溶液的详情相同，尽管在每个测量点使用100s暴露时间而不是10s。

[0322] 在反应开始时，该肽是单体的，如所预期的。感兴趣的是，较大物质的一个峰开始出现在时间进程中的仅30分钟，在ThT荧光强度已明显增加之前。这些较大物质具有一个大小范围跨越的低聚物至小原纤维，并且假定缺乏缔合的ThT信号，则可能的是大部分峰包括被认为与疾病有关的小的、ThT阴性低聚物。在50分钟之后，在反应生长期开始时，仍存在大部分的单体以及先前观察到的低聚物和原纤维的混合物。存在流体动力学半径的较大大小高至约20nm的大量原纤维群，并且在此时首先出现聚集的原纤维的外观(在大约400nm处的峰)。在已消耗所有单体的时候，在120分钟时，在这些大原纤维团中包含所有这些聚集物。

[0323] 实验

[0324] 将Aβ(1-42)克隆到“PetSacKan”质粒中，在大肠杆菌BL21细胞中重组表达，并且使用阴离子交换色谱法以分批模式进行纯化。此程序允许以相对高的纯度产生大量的肽。将所得的肽分成1mL等分试样，将其冻干并保存在-20℃，直到进一步使用为止。尽管获得Aβ(1-42)肽聚集物的可再生动力学数据在历史上是具有挑战性的[10]，但是最近已显示在聚集反应之前立即进行从低聚物中间体中分离纯蛋白质单体的一个排阻色谱步骤，从而显著提高所获得的动力学数据的质量[9]。因此，将一个单一等分试样溶解于6M盐酸胍中并且使其穿过一个休珀代克斯(Superdex)75 10/300凝胶过滤柱。收集在约13与15mL之间的仅在蛋白质单体峰被摒弃之前洗脱的低聚物“肩部(shoulder)”和洗脱的纯单体。洗脱在20mM磷酸钠缓冲液、pH 8.0、200μM EDTA以及0.02％叠氮化钠中的大约1.3μM蛋白质单体并且将其保持在冰中。

[0325] thioavin T(ThT)动力学测定用于监控过滤过程，使用以上缓冲液中的1.2μM Aβ(1-42)、20μM ThT重复4次。实时地并且在与聚集反应开始、滞后时间结束、生长期初期以及平衡相形成相对应的时间点监控原纤维形成，等分试样从4个额外孔中去除并且与在以上动力学缓冲液中的10μL OPA-BME标记的储备液组合。将含有大约1.0μM Aβ(1-42)、600μM OPA和900μM BME的等分试样保持在冰中并且然后在扩散装置中快速分析。

[0326] α-B晶状体蛋白的分析

[0327] 通过扩散光谱法研究αB-晶状体蛋白低聚反应。

[0328] 虽然仍在讨论中[22]，已出现一个广泛的共识，天然状态下的αB-晶状体蛋白组装为大小范围是从10个亚基到40个亚基的低聚物[23]，并且低聚反应平衡的动力学对于蛋白质功能可能是至关重要的。它是使蛋白质的研究更复杂的此异质性。存在关于来自一个截短变体的结晶域的一些结构信息，从而要求承认低聚物由二聚体、7-链β折叠结构嵌段组成[24]，并且对于描述αB-晶状体蛋白的多分散性的尝试是通过质谱分析法[23]、[25]、[26]来成功实现的。然而，迄今为止，不可能在多分散混合物中追踪大量的单体物质。

[0329] αB-晶状体蛋白如以下所述地表示并纯化。在最后的纯化步骤之后，通过SDS-PAGE证实αB-晶状体蛋白的特性(参见图8(a))。在20kDa的一个单一条带证实存在在变性条件下的单体、纯αB-晶状体蛋白。通过质谱分析法获得αB-晶状体蛋白纯度的另外的证明(图8(b)，上图)。发现实验质量20,160Da非常紧密地配合所希望的理论质量20,159Da。

[0330] 对于扩散光谱法实验，用邻苯二甲醛(OPA)标记αB-晶状体蛋白，如以上所述的。用质谱分析法证明完全标记(参见图8(b)，下图)。大约2,200Da的m/z偏移与OPA-标记的12.5个胺相对应，几乎匹配在αB-晶状体蛋白序列中的完全标记的10个伯胺和N-末端胺。使用未标记αB-晶状体蛋白进行DLS和玻璃纳米孔分析(以下进一步描述)。

[0331] 使用扩散光谱法测定αB-晶状体蛋白的大小，以便鉴别单体以及不同低聚物蛋白质群。在下文中进一步详细描述所使用的扩散装置。将不同测量点的扩散数据与沿着微型通道的荧光强度绘图，从而产生一个扩散曲线(图9(a))，并且将实验数据与在此所述的理论模型拟合，从而获得αB-晶状体蛋白的大小分布(图9(b))。实际上，通过扩散光谱法分辨两个群体：具有大约2nm的平均流体动力学半径的一种物质的小群体和具有约7nm的流体动力学半径的一种物质的较大群体。

[0332] 构成小于20％的混合物的小群体表示单体αB-晶状体蛋白，并且非常丰富的群体占包含低聚物形式的蛋白质的样品中的多于80％。没有关于低聚物分布的结论是可能的。然而，持续第一时间低大小的物质被鉴别为大量的分离物质，并且两种物质的相对群体的定量允许研究αB-晶状体蛋白低聚反应平衡。

[0333] 对于比较，使用DLS分析无标签30μMαB-晶状体蛋白。发现与通过扩散光谱法测量的大小分布重叠的一个广泛大小分布表示低聚物αB-晶状体蛋白(图10)。两种技术的良好一致性表明共价标签对低聚反应不存在直接影响。然而，使用DLS，在2nm处没有检测到低大小物质的信号。在较大颗粒显著更亮地散射时，通过DLS测量的强度偏向低聚物蛋白质，并且因此大低聚物可能具有掩蔽的小的、弱散射单体αB-晶状体蛋白。因此，DLS不是研究αB-晶状体蛋白的低聚反应平衡的一种适合的技术。

[0334] 使用单个分子检测通过一个玻璃纳米孔进行对定量无标签αB-晶状体蛋白的单体低聚物平衡的另一个尝试(与剑桥大学卡文迪什实验室(the Cavendish Laboratory,University of Cambridge)的尼古拉斯贝尔(Nicholas Bell)和乌尔里希凯泽阶博士(Ulrich Keyser)合作)在[27]和[28]中描述了该技术及其对单个蛋白质分子检测的应用。由于样品中的单体和低聚物αB-晶状体蛋白的共存，事件的双峰分布被预期为多分散样品通过玻璃纳米孔的转位特征。在测量之前，将样品的pH调节到10.5，以便防止粘附和附着到玻璃纳米孔的各侧并且确保蛋白质快速行进(ballistic travel)通过纳米孔。在施加
500mV电压穿过该孔时出现电渗流动，并且记录这些运输事件。

[0335] 离子电流追踪中的峰值(图11(a))示出了离子电流变化事件并且因此反映了单一分析物分子穿过纳米孔。平均事件电流对比事件持续时间的散射热图(图11(b))(其中这些颜色表示转位的次数)示出了在滤波器截止时间(对于50kHz滤波器是约10μs)的事件群集，事件持续时间限制由滤波器频率强加。大部分转位接近于可检测阈值，但是虽然如此主要群集可能与快速行进的蛋白质相对应，如对于单一、单分散蛋白质样品所报道的[28]。无疑地检测蛋白质的存在，但是在现有分辨率的情况下，转位事件到单体和低聚物群体的分配由于重叠的转位统计而保持难以实行的。

[0336] 通过扩散光谱法研究单体蛋白质浓度对αB-晶状体蛋白的低聚反应平衡的影响。在单体浓度范围是从15μm到125μM的情况下使用MFD评估单体和低聚物αB-晶状体蛋白的相对群体。独立于蛋白质单体浓度，在所有测定中鉴别两种物质。具有约2nm的平均流体动力学半径的较小物质构成该混合物的10％-20％，并且具有7nm半径的物质展现出80％-90％的相对丰度。

[0337] 单体与低聚物的相对群体并不被视为取决于初始单体浓度。考虑到该方法的误差，小的相对丰度变化表示按照所评估的单体浓度次序，单体浓度对低聚反应平衡不存在较大的影响。

[0338] αB-晶状体蛋白的大小测定(Sizing)揭示了具有不同流体动力学半径的两种不同物质，这表示样品的异质性。对于单体和低聚物蛋白分别是约2nm和7nm的平均流体动力学半径与先前公布的数据非常一致。非常合理的平均低聚物半径值7nm与来自质谱分析法[26]、电子显微镜法[22]、小角x射线散射和固态NMR[29]的数据非常一致。

[0339] 微流体扩散光谱法可以用于在一个单一测量中鉴别作为一种分离的物质的αB-晶状体蛋白，其中小流体动力学半径与蛋白质的低聚物形式共存。发现物质的此分辨率对于扩散光谱法是独特的，因为DLS或纳米孔实验二者都没有揭示单体物质的存在。在DLS中朝向较大、较高散射颗粒的偏向掩盖了较小大小的颗粒的存在，并且本发明纳米孔技术并不足够敏感以检测事件的双峰分布，如对于单体和低聚物群体的混合物所预期的。此外，先前对于使用质谱分析法描述伴侣蛋白大小分布的尝试引起个别低聚物群体的详细描述，而不会追踪该单体([25]和[26])。

[0340] 实验

[0341] 通过安德鲁鲍德温公司(Andrew Baldwin；英国牛津大学(University of Oxford,United Kingdom))友好地供应编码人αB-晶状体蛋白的基因的质粒。

[0342] 蛋白质表达和纯化将编码人αB-晶状体蛋白的基因的质粒转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞中(英杰公司(Invitrogen))。用12mL转化细胞的整夜培养物接种供应有1％(v/v)甘油和100μg/mL卡那霉素的整夜表达即时TB自身诱导培养基(500ml，Novagen)中。整夜诱导蛋白质过度表达，在30℃下剧烈振摇。通过离心作用收获细胞(6000g，15min，4℃)并且将其重悬于每500ml培养基含有1mg/ml溶菌酶(西格玛-奥尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)、完全无EDTA蛋白酶抑制剂混合片剂(罗氏公司(Roche))和一药勺尖的DNA酶I(罗氏公司)的20mM Tris～HCI,pH 8.3(20mL/500mL培养物)中。通过在超声波破碎仪XL超声仪(Misonix公司)上使用输出6超声处理20×15s来溶解细胞。将溶胞产物离心作用(18,000g，30min，4℃)以去除所有细胞碎片并且过滤通过一个0.45μm注射器。过滤器(密理博公司(Millipore))将过滤的溶胞产物装载到一个Q琼脂糖柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare))中，该琼脂糖柱用20mM Trls-HCl(pH 8.3)预先平衡并且以4个柱体积通过从
0至200mM NaCL的线性梯度洗脱进行洗脱。将含蛋白质级分施加到一个HiLoad 26/600休珀代克斯(Superdex)75pg凝胶过滤柱(通用电气医疗集团)中以在20mM NaPi(pH 8.5)中进行最后的纯化，并且以1ml/min流速进行洗脱。用SDS-PAGE和MALDI-MS检查含蛋白质级分的特性。

[0343] 微流体装置制造。将SU-8 3025光刻胶(微化学公司(Microchem))在硅片上以500rpm旋转涂布7s并且以3000rpm旋转涂布另外30s。将旋转涂布的硅片在95℃电炉中软烘焙12min，然后用掩膜做内衬，并且持续15s暴露于UV光。在暴露之后，将这些硅片烘焙另外
5min，之后使用PGME发展模具。通过将用碳纳米粉(西格玛奥德里奇公司)加黑的液体预聚物(10:1(v/v)硅酮弹性体:交联剂)倒入模具上并且在60℃下使其固化2h来产生PDMS印模。
将这些PDMS印模用一个解剖刀切断并且在用一个活检针穿刺入口孔和出口孔之后，这些印模暴露于一个空气等离子体中10s(O2分压4.0，功率4.0)并且结合于玻璃盖玻片(磨砂边缘
90°，赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))。该装置被形成为具有25μm高度和范围是从1,000(例如，在大横截面通道处)到10μm的宽度通道。

[0344] 微流体扩散色谱法。在OPA相对于伯胺超过10倍或20倍下使用邻苯二甲醛(OPA)染料溶液(200mM NaHCO3(pH 10.5)、60mM邻苯二甲醛、90mM(β-巯基乙醇)标记人αB-晶状体蛋白。使用凝胶装载的吸管尖将缓冲溶液和荧光标记的蛋白质添加在相应入口中，并且使连接到250μL玻璃注射器(哈密尔顿公司(Hamilton))的管配合流动出口。将neMESYS注射器泵(Cetoni公司)用于设定总抽取速率为80μL/h。用UV光激活OPA-标记的αB-晶状体蛋白并且在使用一个Evolve 512EMCCD照相机(光测量公司(Photometries))的一个Axio Observer.D1显微镜(蔡司公司(Zeiss))上以10倍放大率使用一个49000-ET-DAPI滤光立方体(彩度科技有限公司(Chroma Technology Corp))进行成像。图像数据拟合至线性叠加的一组基底函数,从而描述了直径范围是0nm至800nm的均质颗粒在与三个荧光测量点(在1、3和9cm处)相对应的距离处的溶液分布。

[0345] 动态光散射(DLS)。使用具有反向散射检测的一个Zetasizer Nano ZSP(马尔文仪器公司(Malvern Instruments))以173°散射角进行动态光散射实验。将水的速度和折射率用作缓冲溶液的参数，将分析物的材料特性设定为蛋白质。在分析之前，使所有样品过滤通过一个0.22μm Millex注射器过滤器(密理博公司)。使用“多个窄”模式的马尔文仪器软件分析数据，以使相关函数去卷积成一个大小分布。

[0346] 纳米孔检测测量.与剑桥大学卡文迪什实验室的尼古拉斯贝尔和乌尔里希凯泽阶合作进行这些实验，如先前在[28]中所述的。使用在pH 10.5下浓度为1ΜM的αB-晶状体蛋白进行测量。

[0347] MALDI质谱分析法。通过MALDI质谱分析法测量未标记和OPA标记的αB-晶状体蛋白的质量(剑桥大小生物化学系PNAC部门(the  PNAC Facility,Department of Biochemistry,University of Cambridge)的伦恩帕克曼博士(Dr Len Packman))。将理论分子质量20,159Da用于与未标记αB-晶状体蛋白的实验质量进行比较。

[0348] 蛋白质浓度。通过使用摩尔消光系数13,980M-1cm-1测量单体材料在280nm处的丰度来计算单体蛋白质浓度。

[0349] 脂质体的分析

[0350] 通过扩散光谱法研究不同大小的脂质体结构。

[0351] 脂质体大小已显示对于人工生物膜系统并且对于药物递送的适当药代动力学是重要的[30]。在最近几年，在文献中已讨论了测定囊泡大小的不同方法：电子显微镜法[31]、分析超速离心[32]、分析排阻色谱[33]、流场流分离[34]、酶脂质定量测定[35]以及动态光散射(DLS)[36]，其中DLS是对于容易使用的强度的选择的技术。然而，特别在复合的均质脂质体混合物中准确可靠且可再现性测定脂质囊泡大小由于需要复杂的仪器或技术限制而依然具有挑战性。将微流体扩散光谱法用于测定荧光标记的脂质体的大小并且在具有不同大小的脂质体混合物中分辨囊泡的大小。

[0352] 制备用于测定大小的挤出孔直径是30nm和100nm的荧光脂质体均质溶液以及二者的1:1混合物。将微流体扩散光谱法用于分析脂质体并且计算其大小。对于所有的样品，测量沿着微型通道在各自与一个不同扩散时间相对应的三个测量点处的荧光强度，以获得扩散曲线(图13(a)、图13(c)和图13(e))。使用如上所述的一种微流体射流装置。

[0353] 挤出通过具有15nm孔半径的小囊泡比挤出至50nm半径的较大囊泡更快地扩散(如由斯托克斯爱因斯坦关系所预期的)。在每个测量点处，较小囊泡更广泛地传播通过该通道，并且在较小脂质体的情况下，在通道中间的初始入口位置处的荧光强度更快速地减小。通过具有基底函数的线性叠加的扩散曲线的最小平方拟合来获得最佳拟合大小分布(图13(b)、图13(d)和图13(f))，从而描述了限定大小的颗粒的扩散行为。

[0354] 通过对于挤出至30nm、100nm和二者的混合物的囊泡分别是0.05、0.14和0.06的低卡方值来证实良好拟合。挤出通过具有15nm半径的孔的过滤器的脂质体的平均流体动力学半径被确定为22nm，并且发现具有50nm挤出半径的脂质体具有45nm的流体动力学半径。该混合物的分析揭示了两种物质的单独群体，其中二者明确分离。

[0355] 相同样品的DLS测量值以相同顺序揭示了脂质体的平均流体动力学半径的结果：对于挤出至15nm半径的囊泡是27nm并且对于挤出至50nm半径的囊泡是53nm。然而，通过DLS发现的大小分布广泛地分布，这使得难以可靠地检测一种混合物中的两个不同的峰。在微流体扩散在混合物中的两种脂质体物质之间明确区分而没有任何先验信息时，DLS仅在使分析偏向一个异质样品时鉴别两个部分重叠的峰。在没有关于样品多分散性的任何先验信息的情况下，发现具有一个平均大小的一个单一、明显的宽峰，该平均大小从较大囊泡的平均半径稍微向较小囊泡的平均半径偏移(数据未示出)，在该情况下，区分的准确度是非常差的并且达到检测限。与DLS不同，扩散光谱法没有偏向较大的、较高的散射颗粒。

[0356] 认为在进一步改变在此所述的扩散测量技术的情况下可以提高所记录的这些脂质体的流体动力学半径的准确度。

[0357] 正如与以上所述的关于α-B晶状体蛋白的实验一样，微流体扩散测量技术允许测定复合多分散混合物的颗粒大小。扩散测量值的特征在于它们具有一个相对低的样品消耗、增加的灵敏度和再现性，并且发生对异质混合物中颗粒大小的测定而没有显著偏向具有大流体动力学半径的物质。

[0358] 实验

[0359] 荧光脂质体的制备.将氯仿(阿盘提极性脂质公司(Avanti Polar Lipids))中的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-羧基荧光素(PE CF)荧光脂质用作测定大小实验中所使用的脂质体的荧光标签。使用干氮蒸发氯仿以获得一个脂质膜。然后将该膜重悬于重蒸馏水，在液氮中冷冻并且将其冻干过夜以干燥。将干燥的荧光脂质重悬于最终含量
10％的荧光脂质中，在20mM NaPi、0.01％NaN2中的1mM二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)脂质(阿盘提极性脂质公司)中，并且在室温下将悬浮液彻底搅拌1h。通过五个冻融循环破坏所得大的多层囊泡，并且通过使用阿盘提微型挤出器(阿盘提极性脂质公司)挤出穿过具有不同大小的孔的聚碳酸酯膜过滤器(阿盘提极性脂质公司)来制备不同大小的多层囊泡。使用具有30nm和100nm直径的孔直径的挤出过滤器制备500μM脂质体储备溶液。实际测量浓度是
250μM其中使用25μM荧光脂质的。

[0360] 微流体扩散光谱法.

[0361] 用缓冲溶液(20mM NaPi，0.01％NaN2)填充该扩散装置，并且将荧光标记的囊泡添加在相应入口中。如以前一样使用neMESYS注射器泵(Cetoni公司)以设定总抽取流速为80μL/h。在使用Evolve 512EMCCD照相机(光测量公司)的Axio Observer.D1显微镜(蔡司公司)上使用ET-GFP滤光立方体(型号49002，彩度科技有限公司)观察到结合在脂质体中的荧光团。图像数据被拟合到线性叠加的一组基底函数中，如上所述的。

[0362] 动态光散射(DLS)。如上所述地进行动态光散射实验。

[0363] 参考文献

[0364] 在本说明书中提及的所有文献均通过引用以其全部内容结合在此。

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