快速检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素的试剂盒及其应用

摘要

本发明提供快速检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素的试剂盒及其应用，试剂盒包括包被捕获抗体的酶标板、TDH标准稀释液、兔抗副溶血弧菌阴性血清、兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清、山羊抗兔IgG?HRP的磷酸盐缓冲液、含吐温?20的磷酸盐缓冲液、底物溶液、终止液：2mol/L H2SO4。本发明提供以检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素为研究对象，通过已制备的TDH毒素蛋白免疫BALB/C小鼠制备抗TDH多克隆抗体，同时以致病性副溶血弧菌菌体作为免疫原免疫新西兰大白兔制备兔抗副溶血弧菌多克隆抗体，以抗TDH多克隆抗体作为捕获抗体，抗菌体多克隆抗体为检测抗体，建立双抗体夹心ELISA检测法，并运用此法检测食品中副溶血弧菌TDH毒素，研制出食品中副溶血弧菌TDH毒素ELISA快速检测试剂盒。

权利要求

1.ELISA 试剂盒在快速检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素中的应用，其特征在于：包括以下步骤：（1）样本前处理：以无菌操作称取食品样品，加入0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，于均质杯中均质，制成样品均液；将样品均液用绢纱过滤，于8000-10000r/min离心8-10min，取上清夜即为待检样品提取液；食品样品与磷酸盐缓冲液的用量比为25g：225mL；

（2）在包被捕获抗体的酶标板的孔中，分别加入：100μL待检样品提取液、100μL TDH标准稀释液、100μL兔抗副溶血弧菌阴性血清作为阴性对照、100μL的PBST作为空白对照，封板膜封板，37℃恒温恒湿孵育60-80min；TDH标准稀释液用以绘制标准曲线，每孔加入的TDH标准稀释液浓度分别为2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL；

（3）洗板：手工洗板或洗板机洗板；手工洗板方法为：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，轻摇3min，拍干，重复3次后扣干；洗板机洗板方法为：选择洗涤3次和洗涤时间2min后，自动洗板，扣干；

（4）每孔中加入100μL兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清，37℃恒温恒湿孵育60-

70min；

（5）洗板：手工洗板或洗板机洗板；手工洗板方法为：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，轻摇3min，拍干，重复3次后扣干；洗板机洗板方法为：使用洗涤液选择洗涤3次和洗涤时间

2min后，自动洗板，扣干；

（6）每孔中加入100μL酶标二抗山羊抗兔IgG-HRP，37℃恒温恒湿孵育45-55min；

（7）洗板：手工洗板或洗板机洗板；手工洗板方法为：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，轻摇3min，拍干，重复3次后扣干；洗板机洗板方法为：选择洗涤3次和洗涤时间2min后，自动洗板，扣干；

（8）每孔中加入100μL底物溶液，30℃恒温恒湿闭光孵育15-25min；

（9）每孔中加入50μL 终止液，摇匀，5min内用酶标仪读数，参比波长设置为630nm，测量波长设置为492nm，以空白孔调零，然后读出各孔OD492值；

（10）结果判断：

A、定性分析：样品OD492值/阴性对照平均OD492值≥2.1，判断为阳性，否则为阴性；阴性对照OD值低于0.05时，以0.05计算；高于0.05时，以实际OD值计算；

B、定量分析：以OD492值为纵坐标，以TDH标准稀释液浓度为横坐标，单位μg/mL，绘制标准曲线；根据样品的OD值可在标准曲线上查出待测样品TDH浓度，以此浓度乘以10即的得样品中TDH毒素含量，单位μg/g；

所述快速检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素的ELISA 试剂盒，包括

（1）酶标板：包被捕获抗体的酶标板；所述捕获抗体为鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清；

（2）TDH标准稀释液：副溶血性弧菌TDH毒素；

（3）阴性对照：兔抗副溶血弧菌阴性血清；

（4）检测抗体：兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清；

（5）酶标二抗：山羊抗兔IgG-HRP；

（6）空白对照液：0.01mol∕L、pH7.4的磷酸盐缓冲液；

（7）洗涤液：含0.05%吐温-20的0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液；

（8）底物溶液：包括A瓶和B瓶，A瓶为含4mg/100mL的邻苯二胺、pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液；B瓶为质量百分比浓度30%的H2O2；

（9）终止液：2mol/L H2SO4；

其中，所述鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清的制备方法，包括以下步骤：将副溶血性弧菌TDH毒素分别与等量的弗氏不完全佐剂、等量的弗氏完全佐剂充分结合后，分多次、剂量递增的方法腹腔分别注射两组小鼠；基础免疫采用结合弗氏完全佐剂的4µg TDH，随后每隔2周进行1次加强免疫，制备鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清；

其中，所述兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清的制备方法，包括以下步骤：在0.05%甲醛、35℃下将产TDH毒素的致病性副溶血性弧菌灭活2 h制得菌体抗原，分多次、剂量递增进耳静脉注射；免疫，免疫浓度为108CFU/ mL；在最后一次免疫结束后一周，耳动脉大量采血，即得兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清；

其中，所述兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清的稀释度为1:4000~1:8000；所述山羊抗兔IgG-HRP的稀释度为1:1000；

其中，所述副溶血性弧菌TDH毒素的制备方法，包括以下步骤：

（1）TDH毒素粗品的制备：将产TDH毒素的副溶血弧菌接种于氯化钠碱性蛋白胨水溶液中在摇床中扩大培养后，离心去除菌体，上清液中加入(NH4)2SO4，静置盐析以充分沉淀TDH毒素；高速离心，沉淀溶解在PBS溶液中，透析，即得TDH毒素粗品；所述氯化钠碱性蛋白胨的水溶液的质量百分比浓度为3%；扩大培养条件为： 37℃、150r/min、24h；离心转速为6000r/min；(NH4)2SO4加入量为35.1g/100mL上清液；盐析条件为4℃，10h；高速离心条件为10000r/min、4℃；PBS溶液的浓度为0.010mol/L，pH为7.0；

（2）TDH毒素粗品的纯化：

（2.1）DEAE-纤维素离子交换柱层析：将步骤（1）制得的得TDH毒素粗品缓慢滴加到DEAE-纤维素离子交换柱中，用1L含0.2 mol/L 的NaCl的PBST溶液洗脱，再1L用含0.2-1.0 mol /L NaCl的PBS溶液线性梯度洗脱，收集洗脱液；加入固体(NH4)2SO4盐析，沉淀用PBS溶解后，透析过夜；固体(NH4)2SO4盐析的加入量为40g/100mL；透析温度为4℃；

（2.2）HAP柱层析：将步骤（2.1）的透析液滴加到HAP柱上，用0.5 L的含0.1mol/L NaCl的PBS液pH7.0洗脱，再用0.8L的0.1-0.3mol/L的PBS液pH7.0洗脱，收集洗脱液；加入固体(NH4)2SO4盐析，沉淀用PBS溶解后，透析过夜；

（2.3）Sephadex G-25柱层析：将步骤（2.2）的透析液过Sephadex G-25柱，用0.01mol/L pH7.0 的Tris-HCl缓冲液洗脱，洗脱液用PEG-20000浓缩，即得副溶血性弧菌TDH毒素；

其中，所述包被捕获抗体的酶标板的制备方法，包括以下步骤：在新酶标板的每孔加入稀释的鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清100μL，40℃烘干后加封闭液封闭酶标板，37℃恒温恒湿孵育80min，弃去多余封闭液，使用洗涤液注满各孔，轻摇2-4min，拍干，重复3次后扣干，即得；所述稀释的鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清为采用0.05mol/L、pH为9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释的血清，稀释度1:2000~1:4000；所述封闭液为质量百分比浓度3-5%的牛血清白蛋白或3-5%脱脂奶粉。

说明书

快速检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素的试剂盒及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种ELISA试剂盒，特别涉及一种快速检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素的双抗体夹心ELISA检测试剂盒，还涉及该试剂盒在快速检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素中的应用，属于食品安全检测技术领域。

背景技术

[0002] 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，简称V.p)是食品中常见的食源性致病微生物，主要存在于水产品特别是海产品中，它是每年引起我国沿海地区食物中毒和夏季腹泻的重要病原。V.p产生的溶血毒素是该菌致病的主要原因，包括耐热直接溶血素(Thermostable Direct Hemolysin，简称TDH)、耐热直接溶血素相关溶血素(TDH-related hemolysin，TRH)和不耐热溶血素(Thermolabile Hemolysin，简称TLH)，流行病学调查研究表明TDH是V.p最主要致病因子。

[0003] 目前国内检测食品中副溶血弧菌主要是按GB 4789.7方法进行，该方法仍然是按照分离培养、生化鉴定等过程进行，不仅耗时，且操作复杂，灵敏度有限。应用PCR技术检测副溶血性弧菌及其TDH、TRH毒素已有研究，但此法具有耗资大的不足；相反，简便、快速、经济、敏感、特异的ELISA检测法是现代食品安全快速检测的发展趋势之一。

[0004] 据研究表明，环境中副溶血弧菌不全含有致病因子，也就是说不是所有的副溶血性弧菌都具有致病性。ELISA法对副溶血弧菌的检测研究比较少见，且不能区分所检测的副溶血弧菌是否具有致病性。应用ELISA技术检测副溶血弧菌TDH毒素的相关报道仍不多见，特别是利用免疫学技术制备副溶血弧菌耐热直接溶血毒素TDH单克隆抗体，并建立ELISA法来检测致病性副溶血性弧菌的研究更是极为少见，且检测副溶血弧菌TDH毒素的ELISA快速检测试剂盒尚未出现。

发明内容

[0005] 技术问题：发明所要解决的一个技术问题在于克服现有检测食品中副溶血性弧菌的检测时间长、检测费用高、且难以区分是否具有致病性等不足，提供了一种食品中副溶血性弧菌致病因子TDH毒素的DAS-ELISA法快速检测试剂盒，其检测准确性高，检测时间短，能够实现ELISA 检测方法标准化检测。

[0006] 技术方案：本发明提供的快速检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素的试剂盒，包括：

[0007] （1）酶标板：包被捕获抗体的酶标板；所述捕获抗体为鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清；

[0008] （2）TDH标准稀释液：副溶血性弧菌TDH毒素；

[0009] （3）阴性对照：兔抗副溶血弧菌阴性血清；

[0010] （4）检测抗体：兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清；

[0011] （5）酶标二抗：山羊抗兔IgG-HRP；

[0012] （6）空白对照液：0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline简称PBS）；

[0013] （7）洗涤液：0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline Tween-20，简称PBST）；

[0014] （8）底物溶液：包括A瓶和B瓶，A瓶为含4mg/100mL的邻苯二胺、pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液；B瓶为质量百分比浓度30%的H2O2；

[0015] （9）终止液：2mol/L H2SO4。

[0016] 作为优选，所述鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清的制备方法，包括以下步骤：将副溶血性弧菌TDH毒素分别与等量的弗氏不完全佐剂、等量的弗氏完全佐剂充分结合后，分多次、剂量递增的方法腹腔分别注射两组小鼠；基础免疫采用结合弗氏完全佐剂的4µg TDH，随后每隔2周进行1次加强免疫，制备鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清。

[0017] 作为另一种优选，所述兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清的制备方法，包括以下步骤：在0.05%甲醛、35℃下将产TDH毒素的致病性副溶血性弧菌灭活2 h制得菌体抗原，分多次、剂量递增进耳静脉注射；免疫新西兰大白兔，免疫浓度为108CFU/ mL；在最后一次免疫结束后一周，耳动脉大量采血，即得兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清。

[0018] 作为另一种优选，兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清的稀释度为1:4000~1:8000；所述山羊抗兔IgG-HRP的稀释度为1:1000~2000。

[0019] 作为另一种优选，所述副溶血性弧菌TDH毒素的制备方法，包括以下步骤：

[0020] （1）TDH毒素粗品的制备：将产TDH毒素的副溶血弧菌接种于氯化钠碱性蛋白胨水溶液中在摇床中扩大培养后，离心去除菌体，上清液中加入(NH4)2SO4，静置盐析以充分沉淀TDH毒素；高速离心，沉淀溶解在PBS溶液中，透析，即得TDH毒素粗品；

[0021] （2）TDH毒素粗品的纯化：

[0022] （2.1）DEAE-纤维素离子交换柱层析：将步骤（1）制得的得TDH毒素粗品缓慢滴加到DEAE-纤维素离子交换柱中，用1L含0.2 mol/L 的NaCl的PBST溶液洗脱，再1L用含0.2~1.0mol/L NaCl的PBS溶液线性梯度洗脱，收集洗脱液；加入固体(NH4)2SO4盐析，沉淀用PBS溶解后，透析过夜；

[0023] （2.2）HAP柱层析：将步骤（2.1）的透析液滴加到HAP柱上，用0.5L的含0.1mol/L NaCl的PBS液（pH7.0）洗脱，再用0.8L的0.1~0.3mol/L的PBS液（pH7.0）洗脱，收集洗脱液；加入固体(NH4)2SO4盐析，沉淀用PBS溶解后，透析过夜；

[0024] （2.3）Sephadex G-25柱层析：将步骤（2.2）的透析液过Sephadex G-25柱，用0.01mol/L pH 7.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，洗脱液用PEG-20000浓缩，即得副溶血性弧菌TDH毒素。

[0025] 其中，步骤（1）中，所述氯化钠碱性蛋白胨的水溶液的质量百分比浓度为3%；扩大培养条件为：37℃、150r/min、24h；离心转速为6000r/min；(NH4)2SO4加入量为优选35.1g/100mL上清液；盐析条件为优选4℃，10h；高速离心条件为10000r/min、4℃；PBS溶液的浓度为0.010mol/L，pH为7.0。

[0026] 其中，步骤（2.1）中，固体(NH4)2SO4盐析的加入量为40g/100mL；透析温度优选4℃。

[0027] 作为另一种优选，所述包被捕获抗体的酶标板的制备方法，包括以下步骤：在新酶标板的每孔加入稀释的鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清100μL，烘干后加封闭液封闭酶标板，37℃恒温恒湿孵育80min，弃去多余封闭液，使用洗涤液注满各孔，轻摇2~4min，拍干，重复3次后扣干，即得；所述稀释的鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清为采用0.05mol/L、pH为9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释的血清，稀释度1:2000~1:4000；所述封闭液为质量百分比浓度3~5%的牛血清白蛋白或3~5%脱脂奶粉。

[0028] 本发明还提供了上述ELISA试剂盒在快速检测食品中副溶血性弧菌TDH毒素中的应用。

[0029] 所述应用，包括以下步骤：

[0030] （1）样本前处理：以无菌操作称取食品样品，加入0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液，于均质杯中均质，制成样品均液；将样品均液用绢纱过滤，于8000~10000r/min离心8~10min，取上清夜即为待检样品提取液；食品样品与磷酸盐缓冲液的用量比为25g:225mL；

[0031] （2）在包被捕获抗体的酶标板的孔中，分别加入：100μL待检样品提取液或100μL TDH标准稀释液（绘制标准曲线时用于替换样品提取液）、100μL兔抗副溶血弧菌阴性血清作为阴性对照、100μL的PBS作为空白对照，封板膜封板，37℃恒温恒湿孵育60~80min；每孔加入用于绘制标准曲线的TDH标准稀释液，浓度分别为2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL；

[0032] （3）洗板：手工洗板或洗板机洗板；手工洗板方法为：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，轻摇3min，拍干，重复3次后扣干；洗板机洗板方法为：选择洗涤3次和洗涤时间2min后，自动洗板，扣干；

[0033] （4）每孔中加入100μL兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清，37℃恒温恒湿孵育60-70min；

[0034] （5）洗板：手工洗板或洗板机洗板；手工洗板方法为：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，轻摇3min，拍干，重复3次后扣干；洗板机洗板方法为：使用洗涤液选择洗涤3次和洗涤时间2min后，自动洗板，扣干；

[0035] （6）每孔中加入100μL酶标二抗山羊抗兔IgG-HRP，37℃恒温恒湿孵育45~55min；

[0036] （7）洗板：手工洗板或洗板机洗板；手工洗板方法为：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，轻摇3min，拍干，重复3次后扣干；洗板机洗板方法为：选择洗涤3次和洗涤时间2min后，自动洗板，扣干；

[0037] （8）每孔中加入100μL底物溶液，30℃恒温恒湿闭光孵育15~25min；

[0038] （9）每孔中加入50μL 终止液，摇匀，5min内用酶标仪读数，参比波长设置为630nm，测量波长设置为492nm，以空白孔调零，然后读出各孔OD492值；

[0039] （10）结果判断：

[0040] A、定性分析：样品OD492值/阴性对照平均OD492值≥2.1，判断为阳性，否则为阴性；阴性对照OD492值低于0.05时，以0.05计算；高于0.05时，以实际OD492值计算；

[0041] B、定量分析：以OD492值为纵坐标，以TDH标准稀释液浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线；根据样品的OD492值可在标准曲线上查出待测样品TDH浓度，以此浓度乘以10即的得样品中TDH毒素含量，单位μg/g。

[0042] 有益效果：本发明提供以检测TDH毒素为研究对象，通过已制备的TDH毒素蛋白免疫BALB/C小鼠制备抗TDH多克隆抗体（TDH Polyclonal Antibody，简称TDH-PAb），同时以致病性副溶血弧菌菌体作为免疫原免疫新西兰大白兔制备兔抗副溶血弧菌多克隆抗体（Vibrio parahaemolyticus Polyclonal Antibody，简称V.p-PAb），以抗TDH多克隆抗体作为捕获抗体，抗菌体多克隆抗体为检测抗体，建立双抗体夹心ELISA检测法（Double Antibody Sandwich ELISA，简称DAS-ELISA），并运用此法检测食品中副溶血弧菌TDH毒素，研制出食品中副溶血弧菌TDH毒素ELISA快速检测试剂盒。

附图说明

[0043] 图1为100℃热处理对TDH毒素溶血活性的影响结果图。

[0044] 图2为副溶血弧菌TDH毒素多克隆抗体产生进程曲线图。

[0045] 图3为副溶血弧菌TDH毒素多抗交叉反应试验结果图。

[0046] 图4为副溶血弧菌TDH毒素敏感性试验结果图。

[0047] 图5为捕获抗体TDH-PAb与TDH抗原最适反应时间试验结果图。

[0048] 图6为酶标板封闭试验结果图。

[0049] 图7为检测抗体V.p-PAb与TDH抗原最适反应时间的选择试验结果图。

[0050] 图8为山羊抗兔IgG-HRP与检测抗体V.p-PAb最适反应时间选择试验结果图。

[0051] 图9为DAS-ELISA法特异性试验结果图。

具体实施方式

[0052] 下面结合实施例对本发明技术解决方案作进一步描述，但本发明不限于这些实施例。

[0053] 实施例1

[0054] 副溶血性弧菌的TDH毒素提取与纯化，包括以下步骤：

[0055] （1）将产TDH毒素副溶血弧菌接种于3%氯化钠碱性蛋白胨水中37℃下进行150r/min摇床扩大培养24h后，经6000r/min离心去除菌体，按35.1g/100mL的量向上清液中加入(NH4)2SO4，充分溶解后于4℃下静置盐析过夜，以充分沉淀TDH毒素，于10000r/min，4℃下离心10min，弃上清，沉淀溶解在少量0.01mol/L pH=7.0的PBS溶液中，并以此PBS溶液透析过夜，即得TDH毒素粗品；

[0056] （2）DEAE-纤维素离子交换柱层析：将粗毒素液，采用于DEAE-纤维素DE-25进行柱层析，方法如下：将于上述PBS液4℃平衡过夜的TDH毒素粗品缓慢滴加到层析柱中，同时用约1L含0.2mol/L NaCl上述PBST洗脱柱子，再用1L含0.2~1.0/L NaCl的上述PBS进行线性梯度洗脱，收集洗脱液，按40g/100mL的量加入固体(NH4)2SO4进行盐析，沉淀再用上述PBS溶解后4℃透析过夜；

[0057] （3）HAP柱层析：将步骤（2）的透析液用HAP（2.2×35cm）进行柱层析，用约500mL的0.1mol/L的PBS液（pH7.0）洗脱，再用800mL的0.1~0.3mol/L的PBS液（pH7.0）洗脱，收集洗脱液，透析过夜方法同上。

[0058] （4）Sephadex G-25柱层析：将经HAP柱层析的产物过Sephadex G-25柱（用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液pH7.0平衡），用同样的缓冲溶液洗脱柱子，洗脱液用PEG-20000浓缩一个小体积，即为本研究纯化的TDH毒素，将其冷冻干燥后，得到副溶血性弧菌的TDH毒素。

[0059] 致病性副溶血性弧菌及其TDH毒素的多克隆抗体制备，包括以下步骤：

[0060] （1）鼠抗副溶血性弧菌TDH毒素多克隆抗体制备：

[0061] 选购6-8周龄健康雌性BALB/c小鼠4只（编号BALB/c-1~4），饲养观察1周无异样后，从眼球采血，与TDH毒素做试管凝集试验，无凝集反应者用于制备阴性血清，-20℃保存。

[0062] 取一定量纯化后TDH毒素分别于等量的弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂充分结合后，分多次、剂量递增的方法腹腔分别注射小鼠，基础免疫采用结合弗氏完全佐剂的4µg的TDH，随后每隔2周进行1次加强免疫（免疫剂量见表1），每隔2周进行1次鼠眼球采血0.5ml，测定免疫血清效价，在最后一次免疫结束后一周，眼球大量采血，血液移至4℃冰箱过夜，取上清液，于3000r/min离心10min，制得鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清，置-20℃冰箱保存。

[0063] 表1 TDH毒素免疫BALB/c小鼠进程

[0064]

[0065] （2）兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清制备：

[0066]  选购体重在2~2.5 kg的健康雄性新西兰大白兔，饲养观察1周无异样后，耳静脉采血，与副溶血性弧菌做试管凝集试验，无凝集反应者用于制备阴性血清，-20℃保存。将产TDH毒素的致病性副溶血性弧菌，经0.05%甲醛、35℃将副溶血弧菌灭活2 h制备菌体抗原，免疫浓度为108CFU/ mL（注射剂量见附表2），分多次、剂量递增进耳静脉注射，在最后一次免疫结束后一周，耳动脉大量采血，室温下置斜面2h，移至4℃冰箱过夜，上清液为兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清，如有血红细胞以4000 r / min 转速离心5min去除，分装于无色聚丙烯冷冻管中，-20℃冰箱保存。

[0067] 表2 副溶血性弧菌免疫新西兰大白兔进程 免疫次数 第1次 第2次 第3次 第4次 第5次 第6次
免疫剂量（mL） 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
间隔时间(d) 0 7 7 7 7 7

[0068] 实施例2

[0069] DAS-ELISA快速检测试剂盒的应用，方法如下：

[0070] （1）样本前处理，以无菌操作称取25g大（小）黄鱼样品，加入225mL 0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液，于均质杯中均质，制成样品均液（1:10）。将样品均液用绢纱过滤，于8000r/min离心10min，取上清夜进行DAS-ELISA检测。

[0071] （2）取出已包被好捕获抗体的酶标板，每孔加入100μL待检样品提取液和TDH标准稀释液（绘制标准曲线用，浓度分别为2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL），同时加入100μL兔抗副溶血弧菌阴性血清作为阴性对照，加入100μL的PBST作为空白对照，封板膜封板，37℃恒温恒湿孵育60min。

[0072] （3）手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，轻摇3min，拍干，重复3次后扣干。洗板机洗板：选择洗涤3次和洗涤时间2min后，自动洗板，扣干。

[0073] （4）每孔加入100μL兔抗副溶血性弧菌免疫血清，37℃恒温恒湿孵育70min。

[0074] （5）按照步骤（3）洗板，扣干。

[0075] （6）每孔加入酶结合物山羊抗兔IgG-HRP 100μL，37℃恒温恒湿孵育45min。

[0076] （7）按照步骤（3）洗板，扣干。

[0077] （8）每孔加入100μL底物溶液，30℃恒温恒湿闭光孵育15min。

[0078] （9）每孔加入50μL终止液，摇匀2min，5min内用酶标仪读数，参比波长设置为630nm，测量波长设置为492nm，以空白孔调零，然后读出各孔OD492值。

[0079] （10）结果判断：

[0080] A、定性分析：样品OD492值/阴性对照平均OD492值≥2.1，判断为阳性，否则为阴性。阴性对照OD492值低于0.05时，以0.05计算；高于0.05时，以实际OD492值计算。

[0081] B、定量分析：以OD492值为纵坐标，以TDH标准品浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的OD值可在标准曲线上查出待测样品TDH浓度，以此浓度乘以10即的得样品中TDH毒素含量，单位μg/g。

[0082] 实施例3

[0083] DAS-ELISA快速检测试剂盒的应用，方法如下：

[0084] （1）样本前处理，以无菌操作称取25g对虾、河蟹等甲壳类水产品样品，加入225mL 0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液，于均质杯中均质，制成样品均液（1:10）。将样品均液用绢纱过滤，于10000r/min离心8min，取上清夜进行DAS-ELISA检测。

[0085] （2）取出已包被好捕获抗体的酶标板，每孔加入100μL待检样品提取液和TDH标准稀释液（绘制标准曲线用，浓度分别为2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL），同时加入100μL兔抗副溶血弧菌阴性血清作为阴性对照，加入100μL的PBST作为空白对照，封板膜封板，37℃恒温恒湿孵育80min。

[0086] （3）手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，轻摇3min，拍干，重复3次后扣干。洗板机洗板：选择洗涤3次和洗涤时间2min后，自动洗板，扣干。

[0087] （4）每孔加入100μL兔抗副溶血性弧菌免疫血清，37℃恒温恒湿孵育65min。

[0088] （5）按照步骤（3）洗板，扣干。

[0089] （6）每孔加入酶结合物山羊抗兔IgG-HRP 100μL，37℃恒温恒湿孵育50min。

[0090] （7）按照步骤（3）洗板，扣干。

[0091] （8）每孔加入100μL底物溶液，30℃恒温恒湿闭光孵育20min。

[0092]  （9）每孔加入50μL终止液，摇匀2min，5min内用酶标仪读数，参比波长设置为630nm，测量波长设置为492nm，以空白孔调零，然后读出各孔OD492值。

[0093] （10）结果判断：

[0094] A、定性分析：样品OD492值/阴性对照平均OD492值≥2.1，判断为阳性，否则为阴性。阴性对照OD492值低于0.05时，以0.05计算；高于0.05时，以实际OD492值计算。

[0095] B、定量分析：以OD492值为纵坐标，以TDH标准品浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的OD492值可在标准曲线上查出待测样品TDH浓度，以此浓度乘以10即的得样品中TDH毒素含量，单位μg/g。

[0096] 实施例4

[0097] DAS-ELISA快速检测试剂盒的应用，方法如下：

[0098] （1）样本前处理，以无菌操作称取25g海水鲈鱼、带鱼等海产品样品，加入225mL 0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液，于均质杯中均质，制成样品均液（1:10）。将样品均液用绢纱过滤，于9000r/min离心9min，取上清夜进行DAS-ELISA检测。

[0099] （2）取出已包被好捕获抗体的酶标板，每孔加入100μL待检样品提取液和TDH标准稀释液（绘制标准曲线用，浓度分别为2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL），同时加入100μL兔抗副溶血弧菌阴性血清作为阴性对照，加入100μL的PBST作为空白对照，封板膜封板，37℃恒温恒湿孵育70min。

[0100] （3）手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，轻摇3min，拍干，重复3次后扣干。洗板机洗板：选择洗涤3次和洗涤时间2min后，自动洗板，扣干。

[0101] （4）每孔加入100μL兔抗副溶血性弧菌免疫血清，37℃恒温恒湿孵育60min。

[0102] （5）按照步骤（3）洗板，扣干。

[0103] （6）每孔加入酶结合物山羊抗兔IgG-HRP 100μL，37℃恒温恒湿孵育55min。

[0104] （7）按照步骤（3）洗板，扣干。

[0105] （8）每孔加入100μL底物溶液，30℃恒温恒湿闭光孵育25min。

[0106] （9）每孔加入50μL终止液，摇匀2min，5min内用酶标仪读数，参比波长设置为630nm，测量波长设置为492nm，以空白孔调零，然后读出各孔OD492值。

[0107] （10）结果判断：

[0108] A、定性分析：样品OD492值/阴性对照平均OD492值≥2.1，判断为阳性，否则为阴性。阴性对照OD492值低于0.05时，以0.05计算；高于0.05时，以实际OD492值计算。

[0109] B、定量分析：以OD492值值为纵坐标，以TDH标准品浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的OD492值可在标准曲线上查出待测样品TDH浓度，以此浓度乘以10即的得样品中TDH毒素含量，单位μg/g。

[0110] 实施例5

[0111] 1 材料与方法

[0112] 1.1 材料

[0113] 1.1.1 主要器材

[0114] 弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、羟基磷灰石（HAP）（Sigma公司）；羊抗鼠IgG-HRP、牛血清蛋白、Sephadex G-25（生兴生物技术(南京)有限公司）；硫酸铵、邻苯二胺OPD、PBST（淮安国药化学试剂有限公司，AR）；DEAE纤维素DE-52、透析袋（南京森贝伽生物科技有限公司）；全自动酶标仪StatFax3200（Awareness公司）；微量移液枪 Nichpet EX（日本NICHIRYO公司）；紫外可见光分光光度计UV2300(上海天美科学仪器有限公司)；可拆卸酶标板(上海天呈医流科技有限公司产品)。

[0115] 1.1.2 供试动物与菌株

[0116] 6-8周龄健康雌性BALB/c小鼠（复旦大学医学院实验动物中心）；产TDH毒素副溶血弧菌ATCC33846、副溶血弧菌1.2164（上海海洋大学食品安全实验室提供）；金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、李斯特杆菌、非致病性副溶血弧菌（编号V.p1~4，江苏财经职业技术学院微生物实验室保藏）

[0117] 1.2方法

[0118] 1.2.1 TDH毒素免疫原制备

[0119] 将产TDH毒素副溶血弧菌ATCC33846接种于3%氯化钠碱性蛋白胨水中37℃下进行150r/min摇床扩大培养24h后，经6000r/min离心去除菌体，按35.1g/100mL的量向上清液中加入(NH4)2SO4，充分溶解后于4℃下静置盐析过夜，以充分沉淀TDH毒素，于10000r/min，4℃下离心10min，弃上清，沉淀溶解在少量0.01mol/L pH=7.0的PBS溶液中，并以此PBS溶液透析过夜，即得TDH毒素粗品。DEAE-纤维素离子交换柱层析：将此粗毒素液，采用于DEAE-纤维素DE-25进行柱层析，方法如下：将于上述PBS液4℃平衡过夜的TDH毒素粗品缓慢滴加到层析柱中，同时用约1L含0.2mol/L NaCl上述PBST洗脱柱子，再用1L含0.2~1.0/L NaCl的上述PBS进行线性梯度洗脱，收集洗脱液，按40g/100mL的量加入固体(NH4)2SO4进行盐析，沉淀再用上述PBS溶解后4℃透析过夜。HAP柱层析：将毒素滤液用HAP（2.2×35cm）进行柱层析，用约500mL的0.1mol/L的PBS液（pH7.0）洗脱，再用800mL的0.1~0.3mol/L的PBS液（pH7.0）洗脱，收集洗脱液，透析过夜方法同上。Sephadex G-25柱层析：将经HAP柱层析的产物过Sephadex G-25柱（用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液pH7.0平衡），用同样的缓冲溶液洗脱柱子，洗脱液用PEG-20000浓缩一个小体积，即为本研究纯化的TDH毒素，将其冷冻干燥后，得到纯化后的TDH毒素。将此TDH毒素与等量的弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂充分结合后，制得TDH免疫原。

[0120] 1.2.2 TDH毒素溶血性测定

[0121] 参照文献（杨靖亚等．副溶血弧菌TDH单克隆抗体的研制与性质鉴定）方法进行。

[0122] 1.2.3 TDH毒素耐热性与毒性分析

[0123] 由于TDH具有较大的毒性，免疫小鼠时，用量需要严格控制以免造成小鼠被毒死，无法制备TDH多抗。本研究选取了6-8周龄的健康雌性BALB/c小鼠36只，体重上下相差不超过3g，平均分成12组，分别按照14、12、10、6、2µg/只的剂量（见表1）腹腔注射本研究制备的TDH毒素，记录各组小鼠的存活时间，确定其对小鼠的毒性剂量，试验过程中提供良好的饲养环境。

[0124] 另取本试验制备的TDH毒素，以0.01mol/L pH=7.0的PBS溶液溶解后，均匀等分成6等份，分别置于50、60、70、80、90、100℃的恒温水浴锅中进行加热，每隔3min，分别取样测定其溶血活性，研究TDH的耐热性能。

[0125] 1.2.4 TDH毒素多克隆抗体制备

[0126] 选购6-8周龄健康雌性BALB/c小鼠4只（编号BALB/c-1~4），饲养观察1周无异样后，从眼球采血，与TDH毒素做试管凝集试验，无凝集反应者用于制备阴性血清，-20℃保存。取一定量纯化后TDH毒素分别于等量的弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂充分结合后，分多次、剂量递增的方法腹腔分别注射两组小鼠，基础免疫采用结合弗氏完全佐剂的4µg（或12µg）TDH，随后每隔2周进行1次加强免疫（免疫剂量见表3），每隔2周进行1次鼠眼球采血0.5ml，测定免疫血清效价，在最后一次免疫结束后一周，眼球大量采血，血液移至4℃冰箱过夜，取上清液，于3000r/min离心10min，制备鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清，置-20℃冰箱保存。

[0127] 表3 TDH毒素免疫BALB/c小鼠进程 组别 免疫次数 第1次 第2次 第3次 第4次 第5次
1 BALB/c-1~2小鼠免疫剂量（µg/只） 4 6 8 10 12
2 BALB/c-3~4小鼠免疫剂量（µg/只） 12 10 8 6 4
  间隔时间(d) 0 14 14 14 14

[0128] 1.2.5 间接ELISA法测定TDH毒素多克隆抗体效价

[0129] 将免疫血清吸光值2.1倍于阴性血清吸光值时，免疫血清的最大稀释倍数的倒数定义为鼠抗TDH毒素多克隆抗体效价。采用预实验棋盘法确定TDH最适包被浓度为12µg/mL包被酶标板，37℃恒温恒湿孵育2h，弃去多余包被液，以PBST洗板4次，拍干，5%的小牛血清封闭抗原，封板37℃恒温恒湿孵育2 h。弃去多余小牛血清，以PBST洗板4次，拍干。将TDH免疫血清进行倍比稀释，每孔加入100µl的免疫血清和鼠阴性血清，同时以PBS代替血清设置空白对照，封板37℃恒温恒湿孵育2h，弃去多余血清，用PBST洗板4次拍干，每孔加入100µl的1：1000（说明书推荐用量）的羊抗鼠IgG-HRP，37℃孵育1h，PBST洗板4次，拍干，每孔加入100µl的OPD，30℃恒温避光反应20min，每孔加入50µl 2mol/L的硫酸终止酶反应，酶标仪中测定OD492值，并计算TDH毒素多克隆抗体效价。

[0130] 1.2.6 特异性试验

[0131] 将致病性的金黄色葡萄球菌，沙门氏菌、大肠杆菌、李斯特杆菌和非致病性副溶血弧菌V.p1~4菌株作为供试菌株，于细菌增菌液中37℃摇床培养24h后，培养液于10000r/min离心10min，分别取各供试菌上清液和12µg/mL的TDH溶液100µl包被酶标板，每孔加入1:64000的TDH免疫血清，同时以PBST代替血清设置空白对照，后续操作方法同1.2.5间接ELISA法，测定各孔OD492。阳性判定标准为P/N≥2.1，其中  。

[0132] 1.2.7 敏感性试验

[0133] 将TDH毒素以0.01mol/L pH=7.0的PBST溶液稀释成10µg/mL、9µg/mL、8µg/mL、7µg/mL、6µg/mL、4µg/mL、2µg/mL、1µg/mL，分别取100µl包被酶标板，进行间接ELISA试验，后续操作步骤同1.2.5，根据1.2.6中P/N的判定标准，作为阳性判定依据，确定TDH多克隆抗体的敏感性。

[0134] 2结果与分析

[0135] 2.1 TDH毒素耐热性与毒性

[0136] 表4可以看出，腹腔直接注射不含弗氏佐剂的TDH毒素，随着注射剂量增大，存活平均时间明显降低，每只小鼠注射剂量为2µg以下无死亡现象，在2µg以上开始死亡，但每只注射剂量由4µg升高到16µg时，小鼠平均存活时间由350.3min减少到100.8min；而结合弗氏左剂得TDH毒素，对小白鼠得致死量明显提高，注射结合弗氏完全佐剂的TDH毒素对小鼠的致死量在8µg以上，而结合弗氏不完全佐剂对小鼠的致死量在12µg以上，由此可见弗氏左剂对TDH的毒性产生一定程度的影响，究其原因可能由于TDH毒素与弗氏左剂结合成"油包水"乳状液减缓了毒素进入血液的量和时间，从而降低其毒性，有关弗氏左剂降低TDH毒性的机理需要进一步试验研究。根据由表2试验结果，为避免免疫进程中小白鼠的死亡现象，更好的制备TDH多克隆抗体，可以初步确定免疫小鼠的结合弗氏不完全佐剂TDH剂量控制在12µg/只，结合弗氏完全佐剂的TDH剂量控制在8µg/只以内。

[0137] 表4 TDH毒素对BALB/c小鼠的毒性结果

[0138]

[0139] 表5结果表明，60℃处理组，在12min时出现部分溶血现象，溶血活性开始降低，达到15min时，溶血活性完全丧失。而除60℃处理组外，其他处理组在18min以内，都无法消除TDH溶血活性。说明TDH作为一种蛋白毒素，耐热性能很强，这种毒素蛋白可能在60℃下发生某些基团的变化，造成溶血活性丧失，其机理有待于进一步研究。将此毒素在100℃下煮沸一定时间，图1中1~6管号依次代表煮沸时间6~21min，每隔3min测定一次溶血活性，图1显示1~4号管出现溶血现象，6号管开始无溶血现象，说明在第18min时TDH丧失溶血活性，也就是说TDH在100℃下溶血活性可以维持15~18min。

[0140] 表5 不同温度、热处理时间对TDH溶血活性的影响

[0141]

[0142] 注：“++”表示完全溶血，“+”表示部分溶血，“一”表示无溶血现象。

[0143] 2.2 TDH毒素多抗产生进程

[0144] 图2可以看出，1、2号小鼠产生抗体的效价，从第42天明显高于3、4号小鼠抗体效价，说明采用第1组小鼠免疫方法可以获得高效价抗体，也即按照剂量递增的方法免疫小鼠，更能刺激淋巴细胞分泌多克隆抗体。图2结果显示，在免疫的第56天产生了高价的TDH多克隆抗体，抗体效价高达6.4×106。

[0145] 2.3 TDH多抗特异性

[0146] 图3结果显示，两株致病性副溶血性弧菌P/N值显著大于2.1，呈现强阳性，而非致病性的副溶血弧菌V.p1-4，致病性的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特杆菌的P/N值明显低于2.1，呈现阴性，说明该多克隆抗体具有很强的特异性，与上述菌株无任何交叉反应。

[0147] 2.4 TDH多抗敏感性

[0148] 从图4可以看出，随着TDH包被浓度的不断降低，P/N值迅速降低，当包被浓度下降至6µg/mL时，P/N为1.75<2.1，即该TDH多抗最低可以检测到TDH的浓度为6µg/mL。

[0149] 3 结论

[0150] 本研究以致病性副溶血弧菌ATCC 33846作为TDH毒素提取供试菌，先对其进行增菌培养一定时间后，使其充分分泌TDH毒素后，采用硫酸铵盐析法提取粗毒素，再将此粗毒素依次采用DEAE-纤维素柱层析、HAP柱层析和Sephadex G-25柱层析，进一步纯化TDH毒素，经冷冻干燥后获得纯化后的TDH毒素，分析该蛋白的毒性、耐热性和溶血性。将此毒素蛋白分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂结合后制备TDH免疫原，分多次、不同剂量免疫BALB/c小鼠，采血制备鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清，采用间接ELISA法测定该抗体的效价、敏感性与特异性。结果表明：利用该TDH毒素免疫小鼠时，结合弗氏不完全佐剂TDH剂量控制在12µg/只，结合弗氏完全佐剂的TDH剂量控制在8µg/只以内。该TDH毒素溶血活性能在100℃下维持15~18min，采用剂量递增法免疫小鼠可获得高效价TDH多克隆抗体，在免疫第56天起，抗体效价显著提高，最高达6.4×106，该抗体具有很强的特异性和敏感性，对TDH毒素的检测灵敏度为6µg/ml。

[0151] 实施例6

[0152] 1 材料与方法

[0153] 1.1 材料

[0154] 1.1.1 主要器材

[0155] 弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、羟基磷灰石（HAP）（Sigma公司）；羊抗鼠IgG-HRP、牛血清蛋白、Sephadex G-25（生兴生物技术(南京)有限公司）；硫酸铵、邻苯二胺OPD、PBST（淮安国药化学试剂有限公司，AR）；DEAE纤维素DE-52、透析袋（南京森贝伽生物科技有限公司）；全自动酶标仪StatFax3200（Awareness公司）；微量移液枪 Nichpet EX（日本NICHIRYO公司）；紫外可见光分光光度计UV2300(上海天美科学仪器有限公司)；可拆卸酶标板(上海天呈医流科技有限公司产品)。

[0156] 1.1.2 供试动物与菌株

[0157] 6-8周龄健康雌性BALB/c小鼠、健康雄性新西兰大白兔（复旦大学医学院实验动物中心）；产TDH毒素副溶血弧菌ATCC33846、副溶血弧菌1.2164（上海海洋大学食品安全实验室提供）；金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、李斯特杆菌、非致病性副溶血弧菌（编号V.p1~4，江苏财经职业技术学院微生物实验室保藏）；大黄鱼、带鱼、对虾、鲈鱼等海产品（购于淮安市永辉超市）。

[0158] 1.2方法

[0159] 1.2.1 TDH-PAb与V.p-PAb的制备

[0160] 选购6-8周龄健康雌性BALB/c小鼠，饲养观察1周无异样后，从眼球采血，与TDH毒素做试管凝集试验，无凝集反应者用于制备阴性血清，-20℃保存。取一定量纯化后TDH毒素分别于等量的弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂充分结合后，分多次、剂量递增的方法腹腔分别注射两组小鼠，基础免疫采用结合弗氏完全佐剂的4µg TDH，随后每隔2周进行1次加强免疫（免疫剂量见表6），每隔2周进行1次鼠眼球采血0.5ml，测定免疫血清效价，在最后一次免疫结束后一周，眼球大量采血，血液移至4℃冰箱过夜，取上清液，于3000r/min离心10min，制备鼠抗TDH毒素多克隆抗体血清，置-20℃冰箱保存。V.p-PAb的制备可采用现有常规方法。

[0161] 表6 TDH毒素免疫BALB/c小鼠进程 免疫次数 第1次 第2次 第3次 第4次 第5次
免疫剂量（µg/只） 4 6 8 10 12
间隔时间(d) 0 14 14 14 14

[0162] 1.2.2 DAS-ELISA法检测流程

[0163] 包被TDH-PAb→洗涤、拍干→封闭→洗涤、拍干→加待测样品（或TDH毒素抗原）→洗涤、拍干→加V.p-PAb→洗涤、拍干→加酶标二抗→洗涤、拍干→加底物→洗涤→加终止液→测定OD492值。

[0164] 1.2.3 DAS-ELISA法最适工作条件的确定

[0165] 1.2.3.1 棋盘滴定法选择TDH-PAb最适包被浓度和TDH抗原最适工作浓度

[0166] 将制备好的待包被的TDH-PAb免疫血清，由1:1000倍比稀释至1:32000，包被至酶标板上，50℃烘干后，5%的小牛血清封闭抗原，37℃恒温恒湿孵育3h，按3µg/ml、6µg/ml、9µg/ml、12µg/ml、15µg/ml、18µg/ml浓度加入100µl的用PBS稀释的TDH毒素抗原，同时以PBST和阴性血清分别设置空白对照和阴性对照，封板37℃，恒温恒湿孵育2 h后，洗涤、拍干，每孔加入1:2000的V.p-PAb免疫血清，37℃恒温恒湿孵育2h，洗涤、拍干，每孔加入100µl的1：1000（说明书推荐用量）的山羊抗兔IgG-HRP，37℃孵育1h，洗涤、拍干，每孔加入100µl的OPD底物，30℃恒温避光反应20min，每孔加入50µl 2mol/L的硫酸终止酶反应，酶标仪中测定OD492值，按公式 计算P/N值，以OD492接近于1.0，P/N值较大的
抗原、抗体浓度作为最佳的TDH-PAb最适包被浓度和TDH毒素工作浓度。

[0167] 1.2.3.2 捕获抗体TDH-PAb与TDH抗原最适反应时间选择

[0168] 将捕获抗体TDH-PAb与TDH抗原稀释至1.2.3.1确定的最适工作浓度，反应时间设置为10min，20min，30min，40min，50min，60min，70min，80min，其他反应条件和操作同1.2.3.1，选择OD492值不变化的最短时间作为捕获抗体TDH-PAb与TDH抗原最适反应时间。

[0169] 1.2.3.3 酶标板封闭时间选择

[0170] 采用1.2.3.1、1.2.3.2确定的最适TDH-PAb包被浓度、TDH抗原浓度及抗原抗体最适反应时间，设置封闭时间分别为20min，40min，60min，80min，100min，120min，150min，180min，其他反应条件和操作同1.2.3.1，DAS-ELISA试验后测定OD492值，选择OD492值不变化的最短时间为最佳封闭时间。

[0171] 1.2.3.4 检测抗体V.p-PAb最适工作浓度的选择

[0172] 采用1.2.3.1~1.2.3.3确定的最适TDH-PAb包被浓度、TDH抗原浓度和封闭时间，将V.p-PAb由1:1000倍比稀释至1：32000，每孔加入100µl上述稀释液，其他反应条件和操作同1.2.3.1，DAS-ELISA试验后测定OD492值，以OD492接近于1.0，P/N值较大的V.p-PAb稀释度作为其最佳工作浓度。

[0173] 1.2.3.5 检测抗体V.p-PAb与TDH抗原最适反应时间的选择

[0174] 采用1.2.3.1~1.2.3.4确定的最佳工作条件，反应时间设置为20min，30min，40min，50min，60min，70min，80min，90min其他反应条件和操作同1.2.3.1，选择OD492值不变化的最短时间作为检测抗体V.p-PAb与TDH抗原的最适反应时间。

[0175] 1.2.3.6 山羊抗兔IgG-HRP与检测抗体V.p-PAb最适反应时间选择

[0176] 采用1.2.3.1~1.2.3.5确定的最佳工作条件，分别设置山羊抗兔IgG-HRP与V.p-PAb反应时间为30min，40min，45min，50min，60min，65min，70min，山羊抗兔IgG-HRP的稀释度采用商品推荐最佳浓度1:1000，其他反应条件和操作同1.2.3.1，DAS-ELISA试验后测定OD492值，选择OD值不变化的最短时间为山羊抗兔IgG-HRP与V.p-PAb反应时间选择最佳反应时间。

[0177] 1.2.4 DAS-ELISA法灵敏度试验

[0178] 将TDH抗原浓度设置3µg/ml、4µg/ml、5µg/ml、6µg/ml、7µg/ml，8µg/ml、10µg/ml、12µg/ml，采用1.2.4所确定的最适工作条件进行DAS-ELISA试验，以P/N≥2.1作为阳性判定标准，确定本法对TDH毒素的最低检测限。

[0179] 1.2.5 DAS-ELISA法特异性试验

[0180] 将致病性的金黄色葡萄球菌，沙门氏菌、大肠杆菌、李斯特杆菌和非致病性副溶血弧菌V.p1~5菌株作为供试菌株，于细菌增菌液中37℃摇床培养24h后，培养液于10000r/min离心10min，分别取各供试菌上清液和10µg/mL的TDH溶液作为检测样品，采用1.2.4所确定的最适工作条件进行DAS-ELISA试验，阳性判定标准为P/N≥2.1，判定DAS-ELISA法的检测准确度。

[0181] 1.2.6 DAS-ELISA法检测食品中副溶血弧菌TDH

[0182] 以无菌操作称取25 g食品样品，加入225 mL的0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液，置于灭菌均质杯中均质，制成样品均液（1:10）。样品均液于10000r/min离心10min，取上清夜进行DAS-ELISA检测。同时按照食品安全强制性国标方法GB 4789.7-2013进行检验，比较DAS-ELISA检测的准确性。

[0183] 2结果与分析

[0184] 2.1 捕获抗体TDH-PAb最适包被浓度和TDH抗原最适工作浓度和反应时间的确定[0185] 由表7可以看出，能满足OD492接近于1.0，P/N值具有一定规律行的有两组抗原-抗体，分别是TDH浓度为12µg/ml和15µg/ml的两组。当TDH浓度为12µg/ml时，TDH-PAb稀释度在1:4000和1:8000下的OD492均在1左右，但1:8000的P/N值为19.72大于1:4000的P/N值15.36，当TDH浓度为12µg/ml时，与其反应最适合的TDH-PAb稀释度为1:8000；当TDH浓度为15µg/ml时，TDH-PAb稀释度在1:4000和1:8000下的OD492均在1左右，但1:4000的P/N值为17.12大于
1:8000的P/N值11.23，当TDH浓度为12µg/ml时，与其反应最适合的TDH-PAb稀释度为1:
8000；本研究选取两组中的P/N较大的一组作为TDH-PAb最适包被浓度和TDH抗原最适工作浓度的确定，也即捕获抗体TDH-PAb的最适包被浓度为1:8000，TDH抗原最适工作浓度为12µg/ml。

[0186] 表7 棋盘滴定法选择TDH-PAb最适包被浓度和TDH抗原最适工作浓度

[0187]

[0188] 注：表中第一行数据为OD492值，第二行数据为P/N值。

[0189] 图5显示，反应时间在10~60min，随着时间的延长OD492值呈明显上升趋势，说明此过程中捕获抗体TDH-PAb正与TDH抗原发生反应。而在60min以后，OD492均在1.2左右，且基本维持不变，说明此时捕获抗体TDH-PAb与TDH抗原已反应完全，因此我们确定捕获抗体TDH-PAb与TDH抗原最佳反应时间为60min。

[0190] 2.2 酶标板封闭时间的确定

[0191] 图6显示，封闭时间在20-80min，随着时间的延长OD492值下降显著，说明此阶段，小牛血清正在封闭酶标板多余的孔隙。而在80min以后，OD492均在1.0左右，且基本维持不变，说明此时酶标板孔隙已经被封闭完全，因此我们确定酶标板的最佳封闭时间80min。

[0192] 2.3 检测抗体V.p-PAb最适工作浓度的确定

[0193] 从表8可以看出，V.p-PAb的稀释度为1:4000和1:8000时，对应的OD492值均在1.0左右，而稀释度1:4000对应的P/N为18.11远高于1:8000的P/N值11.45，固选择了1:4000作为检测抗体V.p-PAb的最适工作浓度。

[0194] 表8 检测抗体V.p-PAb最适工作浓度的选择

[0195]

[0196] 2.4 检测抗体V.p-PAb与TDH抗原最适反应时间的选择

[0197] 图7显示，反应时间在20~40min，随着时间的延长OD492值呈上升趋势不明显，可能检测抗体处于识别TDH抗原阶段。而在20~40min之间，OD492显著升高，说明抗原抗体正在迅速反应。而在70min以后，OD492均在1.2左右，且基本维持不变，说明此时抗原抗体反应完全，因此我们确定检测抗体V.p-PAb与TDH抗原最佳反应时间为70min。

[0198] 2.5 山羊抗兔IgG-HRP与检测抗体V.p-PAb最适反应时间确定

[0199] 图8显示，反应时间在30-55min，随着时间的延长OD492值呈明显上升趋势，说明此过程中酶标二抗正与V.p-PAb发生反应。而在50min以后，OD492均在1.2左右，且基本维持不变，说明此时酶标二抗与检测抗体反应完全，因此我们确定山羊抗兔IgG-HRP与检测抗体V.p-PAb的最佳反应时间为55min。

[0200] 2.6 DAS-ELISA法检测灵敏度

[0201] 由表9可以看出，从TDH毒素浓度为6µg/ml开始升高后，检测结果均呈现阳性，说明本法的最低检测限度为6µg/ml，换算成试剂食品样品检测的最低限度应该为60µg/g。

[0202] 表9 DAS-ELISA法检测灵敏度

[0203]

[0204] 2.7 DAS-ELISA法特异性

[0205] 图9结果显示，两株致病性副溶血性弧菌P/N值显著大于2.1，呈现强阳性，而非致病性的副溶血弧菌V.p1-4，致病性的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特杆菌的P/N值明显低于2.1，呈现阴性，说明DAS-ELISA法具有很强的特异性，检测准确度高。

[0206] 2.8 DAS-ELISA法检测食品中致病性副溶血弧菌

[0207]  表10结果显示，运用DAS-ELISA法检测食品中致病性副溶血弧菌与GB 4789.7-2013检测结果符合率基本为100%，在大黄鱼样品检测中，国标方法法有一个样品未检出，原因可能是水产品中一些死亡的或者未可培养状态菌，国标法无法检测出，而DAS-ELISA法检测的对象是TDH毒素不是菌体，因此检测结果不受未可培养状态菌的影响。总体来看，DAS-ELISA检测法准确、可靠。

[0208] 表10 DAS-ELISA法检测食品结果

[0209]

[0210] 3 结论

[0211] 本研究以TDH+副溶血弧菌菌体及其TDH毒素制备免疫原，分别免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠，制备了兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体血清和鼠抗TDH毒素多克隆抗体，以鼠抗TDH毒素多克隆抗体为捕获抗体，兔抗副溶血弧菌多克隆抗体为检测抗体，建立DAS-ELISA检测法，该法的检测参数如下：捕获抗体鼠抗TDH多克隆抗体的包被浓度为1:8000，TDH毒素抗原的最佳工作浓度为12µg/mL，检测抗体兔抗副溶血弧菌多克隆抗体的最适工作浓度为1:4000，酶标二抗最佳工作浓度为1:1000，检测总时间为5h，该法具有很强的特异性，对食品中TDH毒素的检测低限为60µg/g。