用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株

摘要

本发明涉及选择或鉴定能够作用于结肠中水分吸收的益生菌菌株的方法，及其作为用于治疗和/或预防腹泻的医药产品的用途。本发明尤其涉及用于治疗和/或预防腹泻的枯草芽孢杆菌菌株CU1。

权利要求

1.一种选择用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株的方法，所述方法包含以下步骤：-测量至少一种测试菌株对CFTR蛋白的影响，和-选择至少一种引起CFTR蛋白的表达减少的菌株。

2.如权利要求1所述的选择方法，所述方法进一步包含以下步骤：-测量至少一种测试菌株对NHE3蛋白的表达的影响，和-选择至少一种引起NHE3蛋白表达增加的菌株。

3.如权利要求1或2所述的选择方法，其特征在于，所述测试菌株是酵母菌株或细菌菌株。

4.如权利要求3所述的选择方法，其特征在于，所述细菌菌株是芽孢杆菌菌株。

5.如权利要求4所述的选择方法，其特征在于，所述芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌菌株。

6.如权利要求1或2所述的选择方法，其特征在于，所述CFTR蛋白和/或NHE3蛋白的表达通过电泳、免疫分析法、质谱法、RT-PCR或RNA印迹法测量。

7.如权利要求6所述的选择方法，其特征在于，所述免疫分析法通过蛋白质印迹法、免疫组织化学法或免疫细胞化学法进行。

8.如权利要求6所述的选择方法，其特征在于，所述测试菌株是酵母菌株或细菌菌株。

9.如权利要求8所述的选择方法，其特征在于，所述细菌菌株是芽孢杆菌菌株。

10.如权利要求9所述的选择方法，其特征在于，所述芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌菌株。

11.一种益生菌菌株在制备用于治疗和/或预防腹泻的药物中的用途，其中所述益生菌菌株引起CFTR蛋白表达减少和NHE3蛋白表达增加。

12.如权利要求11所述的用途，其中所述益生菌菌株为枯草芽孢杆菌菌株。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述益生菌菌株是以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1。

14.如权利要求11-13任一项所述的用途，其特征在于，所述腹泻是急性腹泻或慢性腹泻。

15.如权利要求11-13任一项所述的用途，其特征在于，所述腹泻是传染源性腹泻或非传染源性腹泻。

16.一种包含益生菌菌株和至少一种生理学上可接受的载体或赋形剂的组合物在制备用于治疗和/或预防腹泻的药物中的用途，其中所述益生菌菌株引起CFTR蛋白表达减少和NHE3蛋白表达增加。

17.如权利要求16所述的用途，其中所述益生菌菌株为枯草芽孢杆菌菌株。

18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述益生菌菌株是以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1。

19.如权利要求16-18任一项所述的用途，其特征在于，所述腹泻是急性腹泻或慢性腹泻。

20.如权利要求16-18任一项所述的用途，其特征在于，所述腹泻是传染源性腹泻或非传染源性腹泻。

说明书

用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株

[0001] 母案申请

[0002] 本专利申请案要求于2012年12月12日提交的法国专利申请第FR 12 61916号的优先权。该法国专利申请案的全部内容以引用方式并入本文。

技术领域

[0003] 本发明涉及用于治疗及/或预防腹泻的益生菌菌株，尤其是芽孢杆菌(Bacillus)的益生菌菌株的领域。本发明还涉及选择具有作用于结肠中水分吸收的特定性质的益生菌菌株的方法。

背景技术

[0004] 当正常运作时，人体结肠吸收约99％的进入其内腔的水分，这代表每天约2升水。结肠具有吸收额外的多达4水的能力。然而，每天超过6升水时，其吸收能力达到饱和而发生腹泻。

[0005] 腹泻是常见的问题(全球每年约20亿个病例)，其特征为较平常大量且频繁(每天排便多于3次)的水状或软性大便。在极端情况下，每天可损失超过20升的液体。

[0006] 腹泻不是疾病，而是一种症状。其最常见的原因是摄入受污染的水或食物；在这种情况下，其持续一或两天，而无需治疗。然而，腹泻本身可引起可能致命的脱水，尤其是在婴儿中，当体重减少超过10％时需送院急诊。根据世界卫生组织，腹泻是第三世界国家中婴儿致死原因中第二常见的，且5岁以下儿童的死亡病例中有18％是由其造成。(Bryce等,Lancet,2005,365:1147-1152)。

[0007] 由腹泻引起的脱水是在损失的液体未被补偿时发生。在正常情况下，水分是在结肠中从粪便里去除。包含在摄入物中的水分被再吸收的现象是在结肠细胞水平通过水分和电解质的主动和被动运输的组合发生。在结肠上皮的内陷隐窝的水平上，水分从血液分泌到外部环境中。在健康良好的人体中，这两种现象彼此互补，因而能保持大便适度含水，从而促进肠道转运并改善分子循环的条件。

[0008] 腹泻有许多可能的原因，包括由病毒、细菌或寄生性病原体引起的传染源性的腹泻及非传染性腹泻，例如由食物不耐性、脂肪饮食、酒精、心理因素、施用医药产品、施用治疗程序引起的腹泻、与疾病或临床病况相关的腹泻、或与停药相关的腹泻。

[0009] 根据症状的持续时间可区分急性腹泻和慢性腹泻，其症状分别持续不到两周及至少两周。

[0010] 用于治疗腹泻的典型药物为，例如洛哌丁胺(loperamide)，其通过刺激水分和电解质吸收，及减缓运输时间来起作用。然而，减缓运输时间在沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)或艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)型的严重传染中可能会产生问题，因为该病原菌长时间保留在肠道内。

[0011] 益生菌提供治疗和/或预防腹泻的引人关注的替换选择。最常用于此适应症的益生菌是乳酸菌。因此，益生菌通常被描述为对免疫系统和肠道菌群平衡具有有益作用。

[0012] 其他研究试图鉴定用于治疗或预防腹泻的新靶标。因此，文件WO 2004/028480描述了通过CFTR蛋白(囊性纤维化跨膜转导调节因子)降低氯离子转运效率的噻唑烷酮型化合物及其于治疗分泌型腹泻的用途。Bradford等(Am.J.Physiol.Gastrointes.Liver Physiol.，2009，296：G886-G898)检验了用于治疗罹患囊肿性纤维化(mucoviscidosis)的患者(其中CFTR的表达被改变)的肠阻塞及脱水的方法。

[0013] 此外，据描述，在患有囊肿性纤维化的小鼠中部分或完全丧失NHE3蛋白(钠氢交换体3)降低了肠阻塞的发病率，特别是通过增加肠道流动性，因而总结出NHE3是调节罹患囊肿性纤维化且其CFTR表达被改变的患者的肠道流动性的潜在靶标。

[0014] 因此，仍需要用于治疗和/或预防腹泻的新策略。

[0015] 发明简述

[0016] 总体上，本发明是基于某些益生菌菌株能够以完全新颖的方式通过诱导吸收结肠中存在的过量水分而直接作用于腹泻这一发现。令人惊讶且出乎意料的是，本发明人表明，某些益生菌菌株能够抑制涉及结肠中水分分泌的转运体(transporter)的表达和/或刺激涉及结肠中水分吸收的转运体的表达，因而可用于治疗和/或预防腹泻。

[0017] 因此，这些益生菌菌株以相当新颖的方式不作为转运体的抑制剂(即，不通过结合转运体来起作用)来阻碍其功能，而是作用于转运体的表达，从而作用于转运体的存在数量。

[0018] 再者，由于这些益生菌菌株是直接作用于结肠中存在的过量水分的吸收，其具有可以用于预防和/或治疗任何类型腹泻的优势，尤其是无论该腹泻是否为传染源性或非传染源性，以及有无菌丛失衡(dysbiosis)存在。

[0019] 因此，本发明涉及选择用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株的方法，该方法包含以下步骤：

[0020] -测量至少一种测试菌株对至少一种涉及结肠中水分吸收或分泌的转运体的表达的影响，和

[0021] -选择至少一种引起至少一种涉及结肠中水分分泌的转运体表达减少和/或至少一种涉及结肠中水分吸收的转运体的表达增加的菌株。

[0022] 更具体地，在第一个方面，本发明涉及选择用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株的方法，该方法包含以下步骤：

[0023] -测量至少一种测试菌株对CFTR蛋白(囊性纤维化跨膜转导调节因子)的表达和/或NHE3蛋白(钠氢交换体3)的表达的影响，和

[0024] -选择至少一种引起CFTR蛋白的表达减少及/或NHE3蛋白的表达增加的菌株。

[0025] 在某些实施方案中，该测试菌株为酵母菌株或细菌菌株。具体地，待测试的细菌菌株可为芽孢杆菌菌株，优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株。

[0026] 在某些实施方案中，CFTR蛋白和/或NHE3蛋白的表达通过电泳、蛋白质印迹、免疫分析、免疫组织化学、免疫细胞化学、质谱、RT-PCR或RNA印迹测量。

[0027] 在另一个方面，本发明涉及使用根据本发明方法选择的用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株。

[0028] 在某些实施方案中，益生菌菌株为枯草芽孢杆菌菌株，优选以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes/国家微生物菌种保藏中心，25rue du Docteur Roux，75724Paris Cedex 15)的枯草芽孢杆菌菌株CU1。

[0029] 在一个次要的方面，本发明涉及通过培养根据本发明方法选择的益生菌菌株所得的用于治疗和/或预防腹泻的细胞。

[0030] 具体地，本发明涉及通过培养以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1所得的用于治疗和/或预防腹泻的枯草芽孢杆菌细胞。

[0031] 本发明还涉及在患者中治疗和/或预防腹泻的方法，其包含向所述患者施用有效量的通过培养根据本发明方法选择的益生菌菌株所得的细胞。

[0032] 在某些实施方案中，治疗和/或预防腹泻的方法包含施用通过培养枯草芽孢杆菌的益生菌菌株所得的枯草芽孢杆菌细胞，优选以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1。

[0033] 在另一个方面，本发明涉及用于治疗和/或预防腹泻的组合物，所述组成物包含至少一种根据本发明的益生菌菌株，或通过培养所述菌株所得的细胞。具体地，所述组合物包含通过培养以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1所得的枯草芽孢杆菌细胞。

[0034] 可根据本发明预防性和/或治疗性治疗的腹泻形式包括急性腹泻和慢性腹泻。

[0035] 在某些实施方案中，根据本发明治疗的腹泻是由病毒、细菌或寄生性病原体引起的传染源性的腹泻。

[0036] 在其他实施方案中，根据本发明治疗的腹泻是非传染源性的腹泻。

[0037] 非传染源性的腹泻是，例如由食品不耐受引起的腹泻、由脂肪饮食引起的腹泻、由酒精引起的腹泻、由心理因素引起的腹泻、由施用医药产品引起是腹泻、由施用治疗程序引起的腹泻、与疾病或临床病况相关的腹泻、或与停药相关的腹泻。

[0038] 以下给出本发明的某些优选实施方案的更详细描述。

[0039] 发明详述

[0040] 如上文所述，本发明涉及鉴定能通过直接作用于涉及调控肠液的转运体水平而作用于结肠中水分吸收的益生菌菌株，及其作为治疗和/或预防腹泻的医药产品的用途。

[0041] I.选择益生菌菌株的方法

[0042] 根据本发明的选择方法的目标是鉴定可用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株。

[0043] 因此，本发明涉及选择用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株的方法，该方法包括以下步骤：

[0044] -测量至少一种测试菌株对至少一种涉及结肠中水分吸收或水分分泌的转运体的表达的影响，和

[0045] -选择至少一种引起至少一种涉及结肠中水分分泌的转运体的表达减少及/或至少一种涉及结肠中水分吸收的转运体的表达增加的菌株。

[0046] 涉及结肠中水分分泌的转运体的一个实例是CFTR蛋白(囊性纤维化跨膜转导调节因子)。

[0047] 涉及结肠中水分吸收的转运体的一个实例是NHE3蛋白(钠氢交换体3)。

[0048] 根据本发明的一种优选方法的特征在于，它包含以下步骤：

[0049] -测量至少一种测试菌株对CFTR蛋白的表达和/或NHE3蛋白的表达的影响，和[0050] -选择至少一种引起CFTR蛋白的表达减少和/或NHE3蛋白的表达增加的菌株。

[0051] 因此，根据本发明的方法选出的菌株是可用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株。

[0052] 本文中“益生菌菌株”意欲是指能对宿主健康发挥有益效果的活微生物菌株。

[0053] 宿主通常是人，但可以想见的是，宿主可以是另一种哺乳动物，例如狗、猫、反刍动物，尤其是绵羊、山羊、犊牛、乳牛、鹿科动物、骆驼科动物、马科动物、旧大陆猪(Old-World swine)，尤其是猪和小猪、兔科动物、鼠科动物、及豚鼠科的啮齿动物。

[0054] 测试菌株

[0055] 欲使用本发明方法测试的菌株可为任何微生物菌株。

[0056] 在某些实施方案中，所述测试菌株是酵母菌株。在可测试的酵母中，可以提及例如酵母(Saccharomyces)属的酵母，尤其是布拉酵母菌(Saccharomyces boulardii)种、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)种，克鲁维酵母菌(Kluyveromyces)属的酵母，尤其是马克斯克鲁维(Kluyveromyces marxianus)种。

[0057] 在其他实施方案中，待测菌株为细菌菌株。

[0058] 优选地，所述测试菌株选自被认为对人和/或动物无害的细菌。

[0059] 在可测试的细菌中，可以提及例如双歧杆菌(Bifidobacterium)属的细菌，尤其是动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、和短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)种；乳杆菌(Lactobacillus)属的细菌，尤其是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酷乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)和唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)种；魏斯氏菌属(Weisella)的细菌，尤其是食窦魏斯氏菌(Weisella cibaria)、泡菜魏斯氏菌(Weisella kimchii)、泰国魏斯氏菌(Weisella thailandensis)种；芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌，尤其是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)种；乳球菌(Lactococcus)属的细菌，尤其是乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)种；肠球菌(Enterococcus)属的细菌，尤其是屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcus fecalis)种；链球菌(Streptococcus)属的细菌，尤其是嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)种；埃希氏杆菌(Escherichia)属的细菌，尤其是大肠杆菌(Escherichia coli)种。

[0060] CFTR和/或NHE3的表达

[0061] 根据本发明的方法包含测量测试菌株对至少一种涉及结肠中水分吸收或分泌的转运体的表达，尤其是对CFTR蛋白和/或NHE3蛋白的表达的影响。

[0062] 如在此所用，“CFTR蛋白”是指在人物种中由基因CFTR(即“囊性纤维化跨膜转导调节因子”)编码的蛋白质，该基因位于7号染色体长臂的q31.2区中的位点7931.2。CFTR基因在物种中高度保守。在人中，该CFTR蛋白具有例如长度为1480个氨基酸的多肽序列，其GenBank登录号为NP_00483。

[0063] CFTR蛋白形成上皮细胞的氯离子及硫氰酸根离子可渗透通过的通道。

[0064] CFTR蛋白在胰腺和胆管、肠隐窝、气管-支气管树、肾小管、生殖系统、和汗腺中的上皮细胞的顶极表达。

[0065] 现已表明，CFTR的抑制剂，例如噻唑烷酮被发现可用于治疗和/或预防腹泻(Verkman等,Curr.Pharm.Des.,2006,12:2235-2247)。

[0066] 因此，在根据本发明的选择方法中，引起CFTR蛋白表达减少的测试菌株可用于治疗和/或预防腹泻。

[0067] 如在此所用，“NHE3蛋白”是指在人物种中由NHE3基因(即“钠-氢交换体3”，也称为SLC9A3(指“溶质载体家族9成员3”))编码的蛋白质，该NHE3基因位于13号染色体。在人中，该NHE3蛋白具有例如长度为834个氨基酸的多肽序列，其GenBank登录号为NP_004165。

[0068] NHE3蛋白在肾脏的肾单位和肠内皮细胞的顶膜中表达，其主要负责维持钠平衡。

[0069] 经基因改造以使NHE3基因失活的小鼠已被证明出现腹泻(Schultheis等,1998,Nat.Genet 19:282-285)。

[0070] 因此，在根据本发明的选择方法中，引起NHE3蛋白表达增加的测试菌株可用于治疗和/或预防腹泻。

[0071] 在本发明的全文中，测量测试菌株对涉及结肠中水分吸收或分泌的转运体的表达的影响，尤其是对CFTR蛋白和/或NHE3蛋白表达的影响，可使用本领域技术人员已知的任何方法进行(参见，例如Harlow和Lane“Antibodies:A Laboratory Manual”,1988年,钮约冷泉港,冷泉港实验室)，因为所使用的方法其性质并非关键或限制要素。

[0072] 总体上，蛋白质的表达水平可通过直接方法测定，例如通过电泳法、蛋白质印迹法、免疫分析法、免疫组织化学法、免疫细胞化学法、或质谱法。

[0073] 另外，也可以通过间接方法测定蛋白质的表达水平。

[0074] 间接方法可以由测量对应基因的转录水平组成，例如通过RT-PCR(逆转录，随后进行聚合酶链反应)测量，优选通过定量RT-PCR、或通过RNA印迹法测量。

[0075] 间接方法的另一实例为测量蛋白质活性的方法，该蛋白质的活性与功能性蛋白的存在量相关。

[0076] 在某些优选的实施方案中，转运体，尤其是CFTR蛋白和/或NHE3蛋白的表达水平通过电泳法测定。

[0077] 电泳可将蛋白质根据其分子量分开。通常使用在含有月桂基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶上的电泳(称为SDS-PAGE，指硫酸月桂酯钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)。也称为二维电泳，例如可根据其分子量及其等电点将蛋白质分开的等电聚焦法。

[0078] 在本发明的某些实施方案中，通过蛋白质印迹法测定转运体，尤其是CFTR蛋白和/或NHE3蛋白的表达水平。

[0079] 蛋白质印迹法，也称为西方技术，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后将该蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移至支撑膜，在该支撑膜上使用对所述蛋白质具特异性的标记抗体检测目标蛋白质。

[0080] 在某些优选的实施方案中，通过免疫分析法测定转运体，尤其是CFTR蛋白和/或NHE3蛋白的表达水平。如在此所用，“免疫分析法”是指使用抗原-抗体反应检测及定量抗原、抗体或类似物质的任何技术。抗体-抗原复合物可以数种方式被可视化。在大多数情况下，将抗体与可催化产色反应的酶(例如过氧化物酶)共轭结合(例如免疫过氧化物酶染色)。或者，可以用荧光团(例如FITC、罗丹明、德州红或Alexa Fluor)标记抗体，然后通过免疫荧光法检测所述抗体-抗原复合物。

[0081] 对人CFTR蛋白及人NHE3蛋白具有特异性的单克隆抗体在本领域是已知的且可从市场上购得。

[0082] 在本发明的某些实施方案中，通过免疫组织化学法测定转运体，尤其是CFTR蛋白和/或NHE3蛋白的表达水平。术语“免疫组织化学法”是指基于使用用于定位组织中蛋白质的抗体的方法。通常将组织固定、洗涤，再可渗透化。然后，将该组织与特异性识别目标蛋白(此处为，例如CFTR蛋白或NHE3蛋白)的初级抗体一起孵育。添加与检测系统偶联的二级抗体。该检测系统为，例如荧光染料或酶，当将其置于存有底物的环境中会导致产色反应。该二级抗体识别初级抗体的恒定部分Fc且必须源自与初级抗体物种不同的其他物种。封固在保护该样本荧光的基质中(若检测系统为一种荧光染料)后，或置于底物存在下(若检测系统为一种酶)后，使用荧光或共聚焦显微镜分析组织。然后，可通过密度测定法、通过测量荧光强度或通过分光亮度法来测定目标蛋白质的表达水平。

[0083] 在本发明的某些实施方案中，通过免疫细胞化学法测定转运体，尤其是CFTR蛋白和/或NHE3蛋白的表达水平。

[0084] 免疫细胞化学法是类似于免疫组织化学法的技术，不同之处在于其起始样本为细胞学制备物，而非组织。

[0085] 在本发明的某些实施方案中，通过质谱法测定转运体，尤其是CFTR蛋白和/或NHE3蛋白的表达水平。

[0086] 在本发明的某些实施方案中，通过RT-PCR测定转运体，尤其是CFTR蛋白和/或NHE3蛋白的表达水平。

[0087] RT-PCR法是将RNA逆转录成cDNA，随后进行聚合酶链反应(PCR)。优选地，RT-PCR为定量RT-PCR，其能够定量对应于目标蛋白质的初始RNA。

[0088] 在本发明的某些实施方案中，通过RNA印迹法测定转运体，尤其是CFTR蛋白和/或NHE3蛋白的表达水平。

[0089] RNA印迹法，也称为北方转移，是根据RNA尺寸通过凝胶电泳法分离RNA，然后将RNA从凝胶转移至膜上的技术，在该膜上可以用对待定量蛋白质的RNA具有特异性的标记杂交探针检测所述RNA。

[0090] 生物样本

[0091] 根据本发明的一种方法包含测量测试菌株对生物样本中至少一种涉及结肠中水分吸收或分泌的转运体的表达，尤其是CFTR蛋白和/或NHE3蛋白的表达的影响。

[0092] 如在此所用，术语“生物样本”以其最广泛的意义使用。生物样本可为其中表达目标蛋白质，尤其是CFTR蛋白或NHE3蛋白，且因此可以被检测及定量的任何生物组织。

[0093] 当应用根据本发明的选择方法时可以使用的生物样本可为，例如来自肠、胰管、胆管、肾小管、气管-支气管树、生殖系统、汗腺及肾脏的肾单位的样本。

[0094] 在某些优选的实施方案中，生物样本是来自肠的样本，优选来自结肠的样本。

[0095] 优选地，组织样本通过例如活组织检查取自模式动物。优选地，所述模式动物为哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔子、猪、鸡、猴子。所述模式动物可为转基因动物。

[0096] 根据本发明的优选的生物样本是包含结肠细胞，即来自结肠黏膜的细胞的组织样本。

[0097] 生物样本也可以是衍生自表达目标蛋白质的组织的生物材料。

[0098] 所述衍生的生物材料是，例如选自从组织样本分离出的细胞或选自从组织样本分离出的细胞中提取的蛋白质。

[0099] 术语“生物样本”还包括已知可表达目标蛋白质，尤其是CFTR蛋白和/或NHE3蛋白的细胞系的细胞。

[0100] 表达CFTR蛋白的细胞系的实例包括从结肠分离的Caco-2细胞、从结肠分离的HT-29细胞或从结肠分离的T84细胞。

[0101] 表达NHE3蛋白的细胞系的实例包括从结肠分离的Caco-2细胞、从结肠分离的HT-29细胞或从结肠分离的T84细胞。

[0102] 这些细胞系可从，例如ATCC(美国菌种保存中心)购得。

[0103] 在某些实施方案中，所述生物样本是从表达目标蛋白质，尤其是CFTR蛋白和/或NHE3蛋白的细胞或组织中分离的蛋白质提取物。提取蛋白质的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如"Protein Methods",D.M.Bollag等,2nd Ed.,1996,Wiley-Liss；"Protein Purification Methods:A Practical Approach",E.L.Harris and S.Angal(Eds.),1989；"Protein Purification Techniques:A Practical Approach",S.Roe,2nd Ed.,
2001,Oxford University Press；"Principles and Reactions of Protein Extraction,Purification,and Characterization",H.Ahmed,2005,CRC Press:Boca Raton,FL)。还有用于从组织或从生物体液中提取蛋白质的试剂盒。这类试剂盒由，例如BioRad Laboratories(Hercules,CA)、BD Biosciences Clontech(Mountain View,CA)、Chemicon International,Inc.(Temecula,CA)、Calbiochem(SanDiego,CA)、Pierce Biotechnology(Rockford,IL)和Invitrogen Corp.(Carlsbad,CA)销售。

[0104] 本领域技术人员知道如何选择最适合情况的试剂盒。

[0105] 测试菌株的影响

[0106] 在根据本发明的方法中，测试菌株对涉及结肠中水分吸收或分泌的转运体的表达，尤其是CFTR蛋白和/或NHE3蛋白的表达的影响是通过比较从已使用该测试菌株治疗过的模式动物取得的生物样本中测得的目标蛋白质的表达量与未使用该测试菌株治疗过的模式动物(相同种类)取得的生物样本(相同种类)中测得的目标蛋白质的表达量来进行测定。最后提及的动物称为对照动物。

[0107] 因此，例如当应用其中生物样本来自模式动物的本发明方法时，向所述模式动物施用指定量的通过培养该测试菌株所得的细胞。

[0108] 该细胞量可一次施用。

[0109] 或者，该细胞量可分成几次施用，无论是在同一天、或在数天、或数周之内施用。

[0110] 通过培养测试菌株所得的细胞可通过适合所用模式动物的任何施用方法施用。例如，施用可通过注射，尤其是通过胃内注射含有合适载体及指定量的通过培养该测试菌株所得的细胞的溶液或悬浮液进行。向对照动物施用仅包含载体的相同体积的溶液。

[0111] 再者，当应用其中该生物样本为细胞系的本发明方法时，测试菌株的影响是通过比较在已使用该测试菌株治疗过的细胞系的细胞上测得的目标蛋白质的表达量与在未使用该测试菌株治疗的(相同细胞系)细胞上测得的目标蛋白质的表达量来进行测定。这些最后提及的细胞称为对照细胞。

[0112] 因此，例如当应用其中该生物样本为细胞系的本发明方法时，细胞系的细胞与指定量的含有合适载体和指定量的通过培养测试菌株所得的细胞的溶液或悬浮液一起孵育。所述细胞系的对照细胞在同样条件下，仅含有所述载体的相同体积的溶液中孵育。

[0113] 培养菌株，无论是酵母菌株或细菌菌株，的方法是本领域已知的，且本领域技术人员知道如何就各菌株的性质来优化培养条件。

[0114] 再者，本领域技术人员知道如何确定通过培养测试菌株所得的细胞在向模式动物施用或与细胞株系细胞一起孵育时的最佳数量。

[0115] 例如，枯草芽孢杆菌细胞是通过在培养基中培养枯草芽孢杆菌菌株所得，尤其是，如Biotechnology,5th edition,R.Scriban,Edition Tec.&Doc.,1999,ISBN:2-7430-0309-X一书中所述。

[0116] 通常，通过培养枯草芽孢杆菌菌株来产生枯草芽孢杆菌细胞的方法包含以下步骤：

[0117] –用枯草芽孢杆菌菌株的接种物接种培养基，

[0118] -在有氧条件下培养以达到细胞增殖，

[0119] -将生物质从其培养基中分离以获得枯草芽孢杆菌细胞。

[0120] 由此所得的枯草芽孢杆菌细胞主要为繁殖体形式。

[0121] 表述“主要为繁殖体”意味着至少70％的细胞是繁殖体，优选至少80％，更优选至少90％。

[0122] 细菌的“繁殖体形式”是指置于有利条件下的细菌形式。

[0123] 有利条件的一个实例是在有利于细菌繁殖的温度和pH值下的非限制性培养基。

[0124] 非限制性培养基含有细胞繁殖必需的所有营养素。

[0125] 产生枯草芽孢杆菌细胞的方法还可包含介于在有氧条件下培养的步骤与分离生物质的步骤之间的将细胞置于不利条件下的中间步骤。因此，在生产方法结束时所得的枯草芽孢杆菌细胞主要为孢子形式。

[0126] 表述“主要为孢子形式”意味着至少有70％的细胞是孢子形式，优选至少80％，更优选至少90％。

[0127] 细菌的“孢子形式”是指置于不利条件下的细菌形式。因此，孢子形式是一种使细菌能够抵抗艰困环境，例如缺少营养物，即限制性营养培养基、水分压力、pH值或温度的变化很大、或通过消化道的抵抗形式。

[0128] 将细菌细胞置于不利条件下可通过，例如以下方式达成：不更新细菌的培养基、停止向培养基进料、使用限制性培养基、改变温度、改变pH值或它们的组合。

[0129] 产生枯草芽孢杆菌细胞的方法还可以包含进一步干燥该细胞的步骤，以或得干燥形式的枯草芽孢杆菌细胞。

[0130] 表述“干燥形式的枯草芽孢杆菌细胞”意指在产生枯草芽孢杆菌细胞的方法结束时所得的生物质包含超过90％的干燥物质，优选超过95％的干燥物质。

[0131] 所述干燥是通过，例如冷冻干燥、流化床干燥或喷雾干燥进行。

[0132] 用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株的鉴定

[0133] 通过比较使用测试菌株处理的样本中所测得的目标蛋白质的表达量与对照样本中所测得的目标蛋白质的表达量，可能确定所述测试菌株是否能引起目标蛋白质的表达减少或增加，或对所述表达没有影响。

[0134] 如上述指出，已通过本发明的选择方法测定能引起至少一种涉及结肠中水分分泌的转运体的表达减少和/或至少一种涉及结肠中水分吸收的转运体的表达增加的菌株是可用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株。

[0135] 本发明人已表明，这类益生菌菌株能够引起结肠中存在的过量水分的吸收，因而发现能应用于治疗和/或预防腹泻。

[0136] “涉及结肠中水分分泌的转运体的表达减少”是指相对于没有该测试菌株存在时的表达，所述转运体的表达显著减少。

[0137] 所述减少的“显著”特征是通过统计分析确定。

[0138] 当通过免疫组织化学测量对所述转运体的表达的影响时，“转运体的表达减少”是指对应所述转运体表达的荧光强度/μm2相对于没有该测试菌株存在时的表达显著减少。

[0139] “涉及结肠中水分吸收的转运体的表达增加”是指相对于没有该测试菌株存在时的表达，所述转运体的表达显著增加。

[0140] 所述增加的“显著”特征是通过统计分析确定。

[0141] 当通过免疫组织化学测量对所述转运体的表达的影响时，“转运体的表达增加”是指对应所述转运体表达的荧光强度/μm2相对于没有该测试菌株存在时的表达显著增加。

[0142] 如本领域技术人员所理解，用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株可仅使用根据本发明的一种选择方法鉴定。根据本发明的方法可使用单一类型的生物样本，例如指定的模式动物，或使用数种类型的生物样本，例如一种细胞系，然后至少一种模式动物进行。

[0143] 或者，能作用于结肠中水分吸收的益生菌菌株的鉴定可以使用根据本发明的选择方法进行，再以本领域技术人员所熟知的一系列测试和临床试验补充所述选择。

[0144] II.益生菌菌株用于治疗和/或预防腹泻的用途

[0145] 本发明涉及任何通过本发明方法鉴定的能够引起结肠中过量水分的吸收，以用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株。本发明还涉及这类益生菌菌株在制备用于治疗和/或预防腹泻的医药产品中的用途。

[0146] 如上文所指出，所述益生菌菌株可以是任何微生物菌株，尤其是酵母菌株或细菌菌株，例如上文中所提及的那些。

[0147] 具体地，本发明者已表明，以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1是对结肠中过量水分的吸收起作用的益生菌菌株，因而可用于治疗和/或预防腹泻。

[0148] 所述菌株已描述于文献FR 2837835中，其公开了用于胃肠道黏膜水平免疫的包含所述菌株的活佐剂。

[0149] 本发明还涉及所有通过培养由本发明方法鉴定的益生菌菌株所得的酵母细胞或细菌细胞用于治疗和/或预防腹泻的用途。

[0150] 如上文所指出，菌株的培养条件为本领域所周知，或容易由本领域技术人员确定。

[0151] 具体地，本发明涉及通过培养以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1所得的细胞用于治疗和/或预防腹泻的用途。

[0152] 以下，所述“通过培养以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1所得的细胞”被称为“CU1细胞”。

[0153] CU1细胞的产生可按照上文所述进行。

[0154] 用于治疗和/或预防腹泻的CU1细胞是孢子形式和/或繁殖体形式的细胞。

[0155] 在一个优选的实施方案中，所述CU1细胞主要是孢子形式。

[0156] 在一个优选的实施方案中，所述用于治疗和/或预防腹泻的CU1细胞是干燥形式。

[0157] 在本发明的一个特别有利的实施方案中，所述用于治疗和/或预防腹泻的CU1细胞主要是孢子形式且是干燥形式。

[0158] 本发明还涉及任何益生菌酵母细胞提取物或益生菌细菌细胞提取物，和来自益生菌菌株培养物的任何滤液，所述提取物或滤液能够引起CFTR蛋白的表达减少和/或NHE3蛋白的表达增加，因此能够引起结肠中过量水分的吸收。

[0159] 根据本发明的用于治疗和/或预防腹泻的方法包含向患者施用有效量的酵母细胞或细菌细胞，所述酵母细胞或细菌细胞是通过培养由本文所述的方法鉴定的益生菌菌株来获得。所述可以一个或多个剂量施用的酵母细胞或细菌细胞的有效量可由医师决定。根据患者的年龄、体重及总体状况、腹泻的性质和严重程度等，待施用的确切量在患者之间可能有所不同。待施用的确切量还可根据所需的治疗效果而有所不同(即，用于预防腹泻或用于治疗腹泻)。

[0160] 施用途径，经口服或经肠胃道外，可根据腹泻的性质和/或根据患者的年龄和总体状况来选择。

[0161] 在预防腹泻的情况下，所述通过培养由本发明的方法鉴定的益生菌菌株所得的酵母细胞或细菌细胞是在症状出现之前施用。

[0162] 在治疗腹泻的情况下，所述通过培养由本发明的方法鉴定的益生菌菌株所得的酵母细胞或细菌细胞是在症状出现之后施用。

[0163] 总体上，任何形式的腹泻可以使用根据本发明的益生菌菌株或通过培养所述益生菌菌株所得的细胞治疗，包括急性形式的腹泻和慢性形式的腹泻。

[0164] “急性腹泻”是指其症状持续不到两周的腹泻，而“慢性腹泻”是指其症状持续至少两周，优选至少一个月的腹泻。

[0165] 急性腹泻包括，例如病毒性肠胃炎、细菌性胃肠炎及食物中毒(例如沙门氏杆菌病(salmonelloses)、志贺氏菌病(shigelloses)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染、蜡状芽胞杆菌感染、大肠杆菌感染)。

[0166] 慢性腹泻包括，例如吸收不良症候群、胃肠病(乳糜泻、惠普尔氏病、克罗恩氏病等)、运动性腹泻(即，由于肠道运输加速造成的腹泻)、分泌性腹泻(即，由于小肠和/或结肠中水分-电解质分泌加速造成的腹泻)、渗透性腹泻(即，由于胃肠道中存在吸收差且产生渗透作用的溶质而造成的腹泻)。

[0167] 可使用根据本发明的益生菌菌株或通过培养根据本发明的益生菌菌株所得的细胞来治疗的其他腹泻包括由于焦虑或紧张情绪造成的腹泻、由于食物不耐受(例如牛奶中的乳糖、山梨糖醇、麸质等)造成的腹泻、由于某些治疗，例如氧化镁疗法、放射疗法、或化学疗法造成的腹泻、或由于某些形式的手术，例如胃切除术或回肠切除术造成的腹泻、由于胃、小肠、结肠等的过度负载或刺激造成的腹泻、由于停药，例如海洛因造成的腹泻、由于某些药物，例如抗生素造成的腹泻。

[0168] 可使用根据本发明的益生菌菌株或通过培养根据本发明的益生菌菌株所得的细胞来治疗的其他腹泻实例包括伴随胆汁病或消化不良的腹泻、由于过度食用某些泻药食品造成的腹泻，和跑步者的腹泻。

[0169] 在某些有利的实施方案中，所述使用根据本发明的益生菌菌株或通过培养根据本发明的益生菌菌株所得的细胞治疗的腹泻不是由施用抗生素，或更普遍的由施用医药产品引起的腹泻。

[0170] 在其他有利的实施方案中，所述使用根据本发明的益生菌菌株或通过培养根据本发明的益生菌菌株所得的细胞治疗的腹泻不是传染源性的腹泻。

[0171] III.组合物

[0172] 本发明还涉及用于治疗和/或预防腹泻的组合物，所述组合物包含至少一种根据本发明的益生菌菌株，或更具体地，通过培养这类菌株所得的细胞。具体地，所述组合物包含有效量的通过培养以保藏号1-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1所得的细胞。

[0173] 根据本发明的组合物可以是食品组合物、食品补充剂或药物组合物。

[0174] 食品组合物是指任何类型的食物、饮料或糕点糖果。

[0175] 食品组合物可以是，例如饮料、谷物棒、口香糖、巧克力、牛奶制品，例如发酵的乳制品、植物来源的发酵产品。

[0176] “食品补充剂”是指其目的是补充正常饮食的食品。食品补充剂单独或组合的构成营养物的浓缩来源，或具有营养或生理效果的其他物质的浓缩来源。

[0177] 食品补充剂是以剂型销售，即，例如胶囊、锭剂、片剂、丸剂及其他类似形式、粉剂药囊、液体安瓿、配备滴管的瓶子，及其他旨在以测量好的少量单位服用的液体或粉末制剂的类似形式。

[0178] 当旨在供人使用时，根据本发明的组合物适合例如以1.108CFU至1.1011CFU，优选1.109CFU至1.1010CFU的量每日使用通过培养益生菌菌株所得的细胞。

[0179] 当旨在供兽医使用时，根据本发明的组合物适合例如以1.105CFU至1.1011CFU，优选1.106CFU至1.1010CFU的量每日使用通过培养益生菌菌株所得的细胞。

[0180] 术语CFU表示菌落形成单位。

[0181] IV.药物组合物

[0182] 由于其直接作用于涉及调控肠液的转运体上，通过本发明方法鉴定的益生菌菌株，或更具体地，通过培养这类菌株所得的酵母细胞或细菌细胞，可用作治疗剂。

[0183] 这些酵母或细菌细胞可以就这样施用，或在至少一种生理学上可接受的载体或赋形剂的存在下，以制剂或药物组合物的形式施用。在本发明的全文中，“生理学上可接受的载体或赋形剂”是指在其施用浓度下，不会干扰活性成分(在此为酵母或细菌细胞)的生物活性的效力，且对患者或受试者没有过量毒性的任何基质或添加剂。生理学上可接受的载体或赋形剂可以是适合向人和/或动物(尤其是哺乳动物)施用的载体或赋形剂。

[0184] 根据本发明的药物组合物可使用任何有效的剂量和施用途径的组合以获得所需的治疗效果。施用的确切量可根据患者的年龄、体重及总体状况、腹泻的性质和严重性等在患者之间有所变化。施用途径(口服或肠胃道外)可根据腹泻的性质和/或根据患者的年龄和/或健康选择。

[0185] 例如，本发明涉及如上定义的供每日使用通过培养所述益生菌菌株所得的细胞的药物组合物，当旨在供人使用时，所述药物组合物中的细胞含量为1.108CFU至1.1011CFU，优选1.109CFU至1.1010CFU。

[0186] 本发明还涉及如上定义的供每日使用通过培养所述益生菌菌株所得的细胞的药5 11
物组合物，当旨在供兽医使用时，所述药物组合物中的细胞含量为l.10CFU至1.10 CFU，优选l.l06CFU至1.1010CFU。

[0187] 根据本发明的药物组合物的制剂可根据施用途径及意欲使用的组合物的剂量而有所不同。在与至少一种生理学上可接受的载体或赋形剂配制后，本发明的药物组合物可以是适合向哺乳动物，尤其是人施用的任何形式，例如锭剂、片剂、糖衣丸剂、胶囊、糖浆、油膏、可注射溶液、栓剂等。本领域技术人员知道如何选择最适合用于制备指定剂型的载体和赋形剂。因此，例如常用于可注射制剂的配方的赋形剂有，例如水、2,3-丁二醇、林格氏液、氯化钠的等渗溶液、合成的单或二甘油酯及油酸。液体组合物，包括乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆、酏剂等可在溶剂、增溶剂、乳化剂、油、脂肪酸，和其他添加剂，例如悬浮剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、黏度调节剂、着色剂等的存在下配制。用于通过口服途径施用的固体组合物可在惰性赋形剂，例如柠檬酸钠，以及任选的添加剂，例如黏合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、润滑剂等的存在下配制。

[0188] 在某些实施方案中，根据本发明的药物组合物被配制成用于立即释放活性成分，尤其是通过培养益生菌菌株所得的酵母细胞或细菌细胞。或者，药物组合物可被配制成用于长期或靶向释放活性成分，或用于保护活性成分，例如抗胃酸和酶。

[0189] 因此，使用能够抵抗pH值和/或胃酶作用的涂层、对pH值和/或酶的作用敏感的涂层、或附着于胃或肠壁的生物黏附涂层、或通过使用包封系统是可行的。

[0190] 再者，根据本发明的药物组合物可含有至少一种额外的活性药物成分(即，通过培养益生菌菌株所得的酵母细胞或细菌细胞除外)。

[0191] “活性药物成分”是指施用时对待施用的患者或个体的健康或总体状况具有疗效或有益效果的任何化合物或物质。

[0192] 因此，活性药物成分可有效对抗待通过施用医药组合物来防止或治疗的腹泻；可有效对抗与腹泻相关的病况或症状(例如发烧、呕吐或腹部痉挛)；或可增加所述药物组合物的活性成分的可利用性及/或活性。

[0193] 可存在于本发明的组合物中的活性药物成分的实例包括，但不限于，抗炎剂、抗生素、解热剂、止吐剂、抗组织胺药、维生素、抗痉挛药等。

[0194] 在一个有利的实施方案中，另一活性药物成分不是枯草芽孢杆菌菌株或通过培养这类菌株所得的细胞，优选地，不是细菌菌株或通过培养这类菌株所得的细胞，更优选地，不是益生菌菌株或通过培养这类菌株所得的细胞。

[0195] 根据本发明的药物组合物的一个实例是包含通过培养益生菌菌株所得的酵母细胞或细菌细胞作为唯一活性药物成分的组合物。

[0196] 在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含通过培养以保藏号I-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1所得的细胞，不包括任何其他细菌菌株。

[0197] 在另一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含通过培养以保藏号I-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1所得的细胞，不包括任何其他细菌菌株或酵母菌株。

[0198] 再在另一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含通过培养以保藏号I-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1所得的细胞，其作为唯一药学活性成分。

[0199] 除非另有定义，本说明书中所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中的一般专业人士所通常理解的具有相同的含义。此外，本文所提及的所有出版物、专利申请、所有专利及所有其他参考文献均以引用方式并入本文。

附图说明

[0200] 图1.用枯草芽孢杆菌菌株CU1处理对结肠CFTR蛋白的表达的影响。图中显示对照组(白色)以及用CU1(黑色)处理后的荧光强度/μm2。*p<0.005

[0201] 图2.用枯草芽孢杆菌菌株CU1处理对结肠NHE3蛋白的表达的影响。图中显示对照组(白色)以及用CU1(黑色)处理后的荧光强度/μm2。*p<0.005

[0202] 图3.用植物乳杆菌菌株处理对结肠CFTR蛋白的表达没有影响。图中显示对照组(白色)以及用LR(黑色)处理后的荧光强度/μm2。*p<0.005

[0203] 图4.用植物乳杆菌菌株处理对结肠NHE3蛋白的表达没有影响。图中显示对照组(白色)以及用LR(黑色)处理后的荧光强度/μm2。*p<0.005

[0204] 图5.向小鼠静脉内施用LPS(15mg/kg)或生理盐水后在60分钟内(黑色)及60分钟至120分钟之间(白色)粪便内排泄的水分(以mg计)(平均值±SEM，n＝10-20)。T-:接受生理盐水注射，未以CU1处理的小鼠；T+:接受LPS注射，未以CU1处理的小鼠；T-/CU1:接受生理盐水注射的用CU1处理的小鼠；T+/CU1:接受LPS注射的用CU1处理的小鼠。*相对于T-，P<0.05；t相对于T+，P<0.05

[0205] 图6.向小鼠胃内施用蓖麻油(200μL)或生理盐水后在60分钟内(黑色)、在60分钟至120分钟之间(灰色)，及在120分钟至180分钟之间(白色)粪便内排泄的水分(以mg计)(平均值±SEM，n＝10-19)。T-:接受生理盐水注射，未以CU1处理的小鼠；T+:接受蓖麻油注射的未用CU1处理的小鼠；T-/CU1:接受生理盐水注射的用CU1处理的小鼠；T+/CU1:接受蓖麻油注射的用CU1处理的小鼠。*相对于T-，P<0.05；t相对于T+，P<0.05

具体实施方式

[0206] 下列实施例描述本发明的一些实施方案。然而，应当理解这些实施例的呈现仅用于说明目的，而不以任何方式限制本发明的范围。

[0207] 实施例1:意欲用于预防及/或治疗腹泻的益生菌菌株的选择

[0208] 材料和方法

[0209] 测试的益生菌菌株。

[0210] 测试的菌株如下：植物乳杆菌菌株和枯草芽孢杆菌株CU1。

[0211] 所使用的枯草芽孢杆菌CU1(以下称为CU1)的细胞是孢子形式且是干燥的。

[0212] 所使用的植物乳杆菌(以下称为LR)的细胞是冻干的繁殖体形式。

[0213] 益生菌菌株对CFTR和NHE3表达的效果的测量。

[0214] 四只小鼠各用l09CFU/天的CU1处理2周。

[0215] 四只小鼠各用l09CFU/天的LR处理2周。

[0216] 四只未用CU1处理的小鼠用作对照。

[0217] 如下所述，通过免疫组织化学测量从用CU1处理的小鼠和对照小鼠中取得的结肠细胞上的CFTR和NHE3的表达。

[0218] 将小鼠处死后，即刻用0.9％NaCl溶液洗涤近端结肠样本(1cm长)，在4％甲醛缓冲溶液中固定(6h)并在4℃浸没于30％蔗糖溶液中24小时。

[0219] 将样本固定在Tissue Tek培养基(Euromedex，Souffelweyersheim，France)中，并将其在-45℃冷冻于异戊烷中。用丙酮进行冷冻切片的后固定(10分钟，-20℃)并在磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS)-奶溶液中水合。在封闭液(带有含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的0.25％Triton X-100的PBS)中孵育后，将切片与兔子抗小鼠CFTR(1/100)、抗小鼠NHE3(1/
200)或抗小鼠TLR4(1/100)多克隆抗体(Abeam，Cambridge,UK)在4℃下孵育过夜。然后，将切片与FITC标记的驴抗兔抗体(1/2000，Uptima， France)在室温下孵肓1小
时。然后，将切片封固在“Vectashield HardSet封固剂”(Abcys,Les Ulis,France)中，并在Nikon 90i荧光显微镜(Nikon,Champigny_sur-Marne,France)下检查。用Nis-Elements Ar软件(Nikon)测量免疫标记的荧光强度/μm2。在来自一组4只小鼠的5个切片上进行分析。

[0220] 结果

[0221] 在测试的益生菌菌株中，仅发现枯草芽孢杆菌菌株CU1对涉及通过结肠黏膜的水分运动的两种转运体CFTR和NHE3的表达具有影响。实际上，如图1所示，用枯草芽孢杆菌菌株CU1处理小鼠两周导致健康小鼠结肠中的结肠细胞顶极上的CFTR的表达明显减少。如图2所示，用枯草芽孢杆菌菌株CU1处理小鼠两周导致健康小鼠结肠中的结肠细胞顶极上的NHE3的表达明显增加。

[0222] 相反，如图3和图4所示，用植物乳杆菌株处理并未明显改变CFTR或NHE3的表达。

[0223] 实施例2:益生菌菌株CU1用于预防和/或治疗腹泻的用途

[0224] 材料和方法

[0225] LPS诱导的腹泻模式

[0226] 向雄性DBA/2小鼠通过胃内途径施用待评估的109CFU/天/动物的益生菌菌株14天。

[0227] 然后，通过静脉内施用200L水处理对照组中的小鼠(12只小鼠)，而测试组中的小鼠(12只小鼠)则接受静脉施用的剂量为15mg/kg的肠炎沙门氏菌(Salmonella enteriditis)脂多醣(LPS)(Sigma，Saint Quentin Fallavier,France)，以诱导腹泻。注射LPS后，将小鼠放置在单独的笼子中，地板上覆盖铝片以允许每隔30分钟收集粪便，共120分钟。将收集的粪便物质称重，并在100℃加热24h，再次称重。粪便物质的湿重(加热前)与干重之间的差值对应于排泄的水分。相对于施用LPS后的全部水分排泄来评估腹泻。

[0228] 由蓖麻油诱导的腹泻模式

[0229] 向雄性NMRI小鼠通过胃内途径施用待评估的109CFU/天/动物的益生菌菌株14天。

[0230] 通过胃内途径施用200L水处理对照组中的小鼠(12只小鼠)，并通过胃内途径向“测试”组中的雄性NMRI小鼠(12只小鼠)施用200μL蓖麻油(Sigma)，以诱导腹泻。施用蓖麻油后，将小鼠放置在单独的笼子中，地板上覆盖铝片以允许每隔30分钟收集粪便，共180分钟。将收集的粪便物质称重，并在100℃加热24h，再次称重。粪便物质的湿重(加热前)与干重之间的差值对应于排泄的水分。相对于施用蓖麻油后的全部水分排泄来评估腹泻。

[0231] 由抗生素诱导的腹泻模式

[0232] 使用数量减少的抗生素建立由抗生素诱导的腹泻的动物模式(基于Chen等，2008，Gastroenterology，135(6):1984-92的工作)。施用抗生素引起菌群生态失调(不平衡)和免疫反应，以及小鼠肠道黏液产生细胞的数量改变。抗生素处理能显著诱导艰难梭状芽孢杆菌的出现。

[0233] 在此模式中，以109CFU/天/动物的速率向一组5只小鼠施用共14天及18天，来测试使用CU1菌株的预防性治疗。使用CU1菌株7天后，将5种抗生素的混合物在饮用水中施用3天，然后在第二天，用抗生素处理的小鼠接受腹膜内注射克林霉素。在实验开始后的第14天和第18天观察处理效果。用CU1菌株处理的小鼠在整个测试中均接受该菌株。

[0234] 结果

[0235] 在各种小鼠的腹泻模式中测试枯草芽孢杆菌菌株CU1。

[0236] 枯草芽孢杆菌菌株CU1的止泻性能

[0237] 如图4和图5所示，明显地发现菌株CU1显著预防了由LPS(图5)和由蓖麻油诱导的腹泻(图6)。

[0238] 实际上，CU1细胞的施用显著减少了在施用LPS后的第一个小时内粪便中所排泄的水分(在4个测试中，减少的百分比为35％、38％、36％和40％)。

[0239] 在由蓖麻油诱导的腹泻模式中，CU1细胞的施用显著减少了在第二个小时内粪便中所排泄的水分(在3个测试中，减少的百分比为63％、46％、44％)。

[0240] CU1菌株还对由施用抗生素诱导的腹泻具有预防效果。此效果在用CU1细胞进行预防性处理后观察到：该小鼠然后显示出肠道菌群正常化，以及在肠黏膜的黏液产生细胞和巨噬细胞水平上由抗生素引起的变化的改善。

[0241] 与洛哌丁胺的效果的比较

[0242] 发现用CU1菌株预防性处理15天其减少由LPS或蓖麻油诱导的腹泻的效果与腹泻开始前1小时经口服途径施用单剂量(1mg/kg)的洛哌丁胺(参考的止泻分子)相同。施用LPS后，洛哌丁胺可减少50％粪便中排泄的水分(CU1为40％)，施用蓖麻油后，其可减少60％粪便中排泄的水分(CU1为60％)。

[0243] 结论

[0244] 在体内，枯草芽孢杆菌菌株CU1能够改善结肠在过量流体状况中的吸收能力。

[0245] 另外的研究表明枯草芽孢杆菌菌株CU1：

[0246] -在蓖麻油模式和LPS模式中对小肠的分泌/吸收能力没有影响，

[0247] -取消结肠壁水平的由LPS诱导的旁细胞渗透性增加，但由蓖麻油诱导的则不，[0248] –降低结肠壁水平的由蓖麻油诱导的短路电流，这表明在由蓖麻油诱导的泻药腹泻的情况下结肠吸收水分的能力加强(但在基线情况下则不)。

[0249] 因此，枯草芽孢杆菌菌株CU1及通过培养此菌株所得的细胞可用于治疗和/或预防任何类型的腹泻。