光皮桦组织培养方法属于植物无性繁殖技术领域，包括如下步骤：将外植体在诱导培养基中诱导培养，得到诱导芽；将诱导芽在增殖培养基中增殖培养，得到增殖芽；和将所述增殖芽在包含6‑BA、IBA和NAA的生根培养基中生根培养，得到生根苗。本申请还涉及用于该方法的培养基和通过该方法产生的植物。
采集外植体的步骤，所述采集外植体的步骤包括从母树的基部取2-3cm长的幼嫩叶芽作为外植体；
将外植体在诱导培养基中诱导培养，得到诱导芽，所述诱导培养基包含1.2-1.8mg/L的
6-BA、0.15-0.25mg/L的NAA；1/4-3/4份的MS培养基中的大量元素和0.8-1.2份的MS培养基中的微量元素；糖类；凝固剂；以及1.6-2.4mg/L的氨基乙酸、0.08-0.12mg/L的盐酸硫胺素、
0.4-0.6mg/L的盐酸吡哆醇、0.4-0.6mg/L的烟酸和80-120mg/L的肌醇；
将诱导芽在增殖培养基中增殖培养，得到增殖芽，所述增殖培养基包含0.8-1.2mg/L的
6-BA、0.15-0.25mg/L的IBA和约0.1mg/L的NAA；0.8-1.2份的MS培养基中的大量元素和0.8-
1.2份的MS培养基中的微量元素；糖类；凝固剂；以及0.8-1.2mg/L的氨基乙酸、0.08-
0.12mg/L的盐酸硫胺素、0.4-0.6mg/L的盐酸吡哆醇、0.4-0.6mg/L的烟酸和40-60mg/L的肌醇；和将所述增殖芽在生根培养基中生根培养，得到生根苗，所述生根培养基包含0.15-
0.25mg/L的6-BA、0.8-1.2mg/L的IBA和0.8-1.2mg/L的NAA；1/8-3/8份的MS培养基中的大量元素和0.8-1.2份的MS培养基中的微量元素；糖类；凝固剂；以及0.8-1.2mg/L的氨基乙酸、
0.08-0.12mg/L的盐酸硫胺素、0.4-0.6mg/L的盐酸吡哆醇、0.4-0.6mg/L的烟酸和40-60mg/L的肌醇。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述诱导培养基还包含15000-25000mg/L的糖类。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述增殖培养基还包含25000-35000mg/L的糖类。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述生根培养基还包含15000-25000mg/L的糖类。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述凝固剂为卡拉胶、琼脂粉或其组合。
6.如权利要求1或4所述的方法，其中所述生根培养基包含约0.2mg/L的6-BA、约1.0mg/L的IBA和约1.0mg/L的NAA。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中所述诱导培养基包含约1.5mg/L的6-BA和约
8.如权利要求1或3所述的方法，其中所述增殖培养基包含约1.0mg/L的6-BA、约0.2mg/L的IBA和约0.1mg/L的NAA。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述诱导培养基包含约1/2份的MS培养基中的大量元素和约1份的MS培养基中的微量元素；以及约2mg/L的氨基乙酸、约0.1mg/L的盐酸硫胺素、约0.5mg/L的盐酸吡哆醇、约0.5mg/L的烟酸和约100mg/L的肌醇。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述诱导培养基包含约20000mg/L的糖类。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述增殖培养基包含约1份的MS培养基中的大量元素和约1份的MS培养基中的微量元素；以及约1mg/L的氨基乙酸、约0.1mg/L的盐酸硫胺素、约0.5mg/L的盐酸吡哆醇、约0.5mg/L的烟酸和约50mg/L的肌醇。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述增殖培养基包含约30000mg/L的糖类。
13.如权利要求6所述的方法，其中所述生根培养基包含约1/4份的MS培养基中的大量元素和约1份的MS培养基中的微量元素；以及约1mg/L的氨基乙酸、约0.1mg/L的盐酸硫胺素、约0.5mg/L的盐酸吡哆醇、约0.5mg/L的烟酸和约50mg/L的肌醇。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述生根培养基包含约20000mg/L的糖类。
15.如权利要求2-4、10、12和14中任一项所述的方法，其中所述糖类为单糖或二糖。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述单糖为葡萄糖；所述二糖为蔗糖。
17.如权利要求5所述的方法，其中所述卡拉胶的量为5500-8500mg/L；所述琼脂粉的量为4000-6000mg/L。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述卡拉胶的量为约7000mg/L。
19.如权利要求17所述的方法，所述琼脂粉的量为约5000mg/L。
20.如权利要求1-4和9-14和16-19中任一项所述的方法，其中所述诱导培养的培养条件为：培养基pH值为5.6-6.0，培养温度24-28℃。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述诱导培养包括在暗培养7天后，再采用日光灯进行光照。
22.如权利要求21所述的方法，其中诱导培养时的光照强度为3500-4000lx，每天光照时间为10-12小时。
23.如权利要求1-4和9-14和16-19中任一项所述的方法，其中所述增殖培养的培养条件为：培养基pH值为5.6-6.0，培养温度24-28℃。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述增殖培养包括采用日光灯进行光照。
25.如权利要求24所述的方法，其中增殖培养时的光照强度为3500-4000lx，每天光照时间为10-12小时。
26.如权利要求23所述的方法，其中当外植体萌出3-4个侧芽，每个侧芽生长出2-3片小叶时，将小苗取出剪成单芽，重新接种至增殖培养基。
27.如权利要求1-4和9-14和16-19中任一项所述的方法，其中所述生根培养的培养条件为：培养基pH值为5.6-6.0，培养温度24-28℃。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述生根培养包括采用日光灯进行光照。
29.如权利要求28所述的方法，其中生根培养时的光照强度为3500-4000lx，每天光照时间为10-14小时。
30.如权利要求1所述的方法，其中所述母树为10年生以上且生长势旺盛的母树。
31.如权利要求1-4、9-14、16-19、21-22、24-26和28-30中任一项所述的方法，还包括对所述外植体进行消毒的步骤。
32.如权利要求31所述的方法，其还包括对所述外植体进行无菌水冲洗的步骤。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述外植体消毒的步骤包括用每50ml含2-3滴吐温
80的0.1％的HgCl2混合水溶液消毒外植体6min。
34.如权利要求31所述的方法，其还包括在所述消毒步骤之前用3％的洗衣粉水浸泡外植体20min，然后从每个外植体取1.5-2.0cm长放置到超净台上的无菌器皿中。
35.如权利要求1-4、9-14、16-19、21-22、24-26、28-30和32-34中任一项所述的方法，其还包括对所述生根苗进行炼苗的步骤。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述炼苗步骤的条件为：当生根苗生长至4-5cm高时，将其转移到温室或大棚，培养温度15-30℃，保持温室或大棚内良好的通风。
37.如权利要求36所述的方法，其中炼苗时的光照主要为太阳光的散射光。
38.如权利要求1-4、9-14、16-19、21-22、24-26、28-30、32-34和36-37中任一项所述的方法，其还包括组培苗移栽的步骤。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述移栽步骤通过以下进行：将炼苗后的组培苗从培养瓶中取出，移栽至用1-3‰高锰酸钾液消毒后的黄心土基质营养杯或轻基质营养杯。
40.如权利要求38所述的方法，其还包括组培苗的移栽后管理。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述组培苗的移栽后管理包括在所述移栽后管理期间，在晴天时用75％遮光率的遮荫网遮光以减弱光照强度。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述移栽后管理包括将移栽有组培苗的营养杯放置在有自动控制喷雾设备的苗床上，移栽后的前7天内白天喷雾频率为1次/10min，保持叶面湿润；晚上喷雾频率调整为1次/30min，7天以后白天喷雾频率调整为1次/20min，晚上1次/60min，持续培养30-40天后，按常规育苗方式管理。
43.光皮桦植物组织培养基，其包括诱导培养基、生根培养基和增殖培养基，其特征在于所述诱导培养基包含1.2-1.8mg/L的6-BA和0.15-0.25mg/L的NAA；1/4-3/4份的MS培养基中的大量元素和0.8-1.2份的MS培养基中的微量元素；糖类；凝固剂；以及1.6-2.4mg/L的氨基乙酸、0.08-0.12mg/L的盐酸硫胺素、0.4-0.6mg/L的盐酸吡哆醇、0.4-0.6mg/L的烟酸和80-120mg/L的肌醇；
所述增殖培养基包含0.8-1.2mg/L的6-BA、0.15-0.25mg/L的IBA和约0.1mg/L的NAA；
0.8-1.2份的MS培养基中的大量元素和0.8-1.2份的MS培养基中的微量元素；糖类；凝固剂；
以及0.8-1.2mg/L的氨基乙酸、0.08-0.12mg/L的盐酸硫胺素、0.4-0.6mg/L的盐酸吡哆醇、
0.4-0.6mg/L的烟酸和40-60mg/L的肌醇；
所述生根培养基包含0.15-0.25mg/L的6-BA、0.8-1.2mg/L的IBA和0.8-1.2mg/L的NAA；
1/8-3/8份的MS培养基中的大量元素和0.8-1.2份的MS培养基中的微量元素；糖类；凝固剂；
以及0.8-1.2mg/L的氨基乙酸、0.08-0.12mg/L的盐酸硫胺素、0.4-0.6mg/L的盐酸吡哆醇、
0.4-0.6mg/L的烟酸和40-60mg/L的肌醇。
44.如权利要求43所述的组织培养基，其中所述诱导培养基还包含15000-25000mg/L的糖类。
45.如权利要求43所述的组织培养基，其中所述增殖培养基还包含25000-35000mg/L的糖类。
46.如权利要求43所述的组织培养基，其中所述生根培养基还包含15000-25000mg/L的糖类。
47.如权利要求43-46中任一项所述的组织培养基，其中所述凝固剂为卡拉胶、琼脂粉或其组合。
48.如权利要求43或46所述的组织培养基，其中所述生根培养基包含约0.2mg/L的6-BA、约1.0mg/L的IBA和约1.0mg/L的NAA。
49.如权利要求43或44所述的组织培养基，其中所述诱导培养基包含约1.5mg/L的6-BA和约0.2mg/L的NAA。
50.如权利要求43或45所述的组织培养基，其中所述增殖培养基包含约1.0mg/L的6-BA、约0.2mg/L的IBA和约0.1mg/L的NAA。
51.如权利要求49所述的组织培养基，其中所述诱导培养基包含约1/2份的MS培养基中的大量元素和约1份的MS培养基中的微量元素；以及约2mg/L的氨基乙酸、约0.1mg/L的盐酸硫胺素、约0.5mg/L的盐酸吡哆醇、约0.5mg/L的烟酸和约100mg/L的肌醇。
52.如权利要求51所述的组织培养基，其中所述诱导培养基包含约20000mg/L的糖类。
53.如权利要求50所述的组织培养基，其中所述增殖培养基包含约1份的MS培养基中的大量元素和约1份的MS培养基中的微量元素；以及约1mg/L的氨基乙酸、约0.1mg/L的盐酸硫胺素、约0.5mg/L的盐酸吡哆醇、约0.5mg/L的烟酸和约50mg/L的肌醇。
54.如权利要求53所述的组织培养基，其中所述增殖培养基包含约30000mg/L的糖类。
55.如权利要求48所述的组织培养基，其中所述生根培养基包含约1/4份的MS培养基中的大量元素和约1份的MS培养基中的微量元素；以及约1mg/L的氨基乙酸、约0.1mg/L的盐酸硫胺素、约0.5mg/L的盐酸吡哆醇、约0.5mg/L的烟酸和约50mg/L的肌醇。
56.如权利要求55所述的组织培养基，其中所述生根培养基包含约20000mg/L的糖类。
57.如权利要求44-46、52、54和56中任一项所述的组织培养基，其中所述糖类为单糖或二糖。
58.如权利要求57所述的组织培养基，其中所述单糖为葡萄糖；所述二糖为蔗糖。
59.如权利要求47所述的组织培养基，其中所述卡拉胶的量为5500-8500mg/L；所述琼脂粉的量为4000-6000mg/L。
60.如权利要求59所述的组织培养基，其中所述卡拉胶的量为约7000mg/L。
61.如权利要求59所述的组织培养基，其中所述琼脂粉的量为约5000mg/L。
光皮桦植物组织培养方法及其培养基
技术领域
[0001] 本申请涉及植物无性繁殖技术领域。
背景技术
[0002] 光皮桦(Betula luminifera)，又名亮叶桦，其是广泛分布于我国亚热带地区的一种珍贵用材树种。光皮桦木材质地良好，供制各种器具，可用于家具、航空、军工等多种用途。目前林业生产部门主要采用种子培育实生苗造林，实生苗因为基因的多样性，造林后生长表型不一，很难达到群体高产的目的。
[0003] 植物活细胞具有能够发育成为完整植株的潜在能力，称之为细胞的全能性。植物组织培养是根据植物细胞的全能性原理发展起来的一项植物无性繁殖技术，在无菌和人工控制条件下，对植物的原生质体、细胞、组织和器官进行离体培养，并控制其生长发育，其是当今世界新技术革命的重要组成部分，为植物学科的研究及植物生产提供了有效而简便的方法。植物组织培养能为林业生产中苗木的培育提供有效的无性繁殖方法。
[0004] 无性系是某一原始母株通过无性繁殖产生的无数分株的总称，无性系苗木因为基因相同，造林后表型均一。采用光皮桦组织培养方法能够繁殖大量的优良无性系苗木，造林后可达到群体高产的目的。
[0005] MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。
[0006] 谌红辉等人(2006)开发了光皮桦叶芽离体培养再生植株技术，其增殖培养增殖系数为3.2，生根培养的生根率为86％。
[0007] 孙晓敏(2012)建立了光皮桦组织快繁技术，其使用6-BA和TDZ直接诱导丛生不定芽分化，并单独使用IBA对不定芽诱导生根。
发明内容
[0008] 本申请涉及光皮桦植物组织培养方法，其包括以下步骤：将外植体在诱导培养基中诱导培养，得到诱导芽；将诱导芽在增殖培养基中增殖培养，得到增殖芽；和将所述增殖芽在包含6-BA、IBA和NAA的生根培养基中生根培养，得到生根苗。
[0009] 本申请还涉及光皮桦植物组织培养基，其包括诱导培养基、生根培养基和任选地增殖培养基，其特征在于所述生根培养基包含6-BA、IBA和NAA。
[0010] 本申请另外涉及由本申请所述的培养方法产生的诱导芽、增殖芽或生根苗。任选地，还涉及由本申请所述的培养方法产生的植物。
附图说明
[0011] 图1为根据本申请方法中诱导培养步骤得到的外植体诱导芽。
[0012] 图2例示了本申请增殖培养步骤的效果。
[0013] 图3为根据本申请方法中生根培养步骤得到的生根苗。具体实施方案
[0014] 本申请提供了改进的用于光皮桦组织培养方法及用于该方法的培养基，以及通过该方法产生的植物，其与已知的培养基及方法相比提供了显著的优势。本申请利用植物组织培养方法，采集光皮桦树叶芽进行无性繁殖，培育出优良无性系苗木用于生产造林，以提高林地木材产量。本申请能通过技术组装配套，对优良无性系苗进行工厂化快速繁育，既能保证按计划生产苗木，摆脱树木产种量大小年对苗木的限制，降低苗木生产成本，又能提高林地木材产量，相对于传统的实生苗培育有着明显的整体优势。
[0015] 在第一方面，本申请提供了光皮桦植物组织培养方法，其包括以下步骤：将外植体在诱导培养基中诱导培养，得到诱导芽；将诱导芽在增殖培养基中增殖培养，得到增殖芽；和将所述增殖芽在包含6-BA、IBA和NAA的生根培养基中生根培养，得到生根苗。
[0016] 6-BA，6-苄氨基腺嘌呤，属于一种安全高效的植物生长调节剂，主要用于促进细胞分裂，促进非分化组织分化，促进侧芽发生，防止老化等作用。
[0017] IBA，吲哚丁酸，可诱导根原体的形成，促进细胞分化和分裂，有利于新根生成和维管束系统的分化，促进插条不定根的形成。
[0018] NAA，萘乙酸，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根。
[0019] 在一实施方案中，所述生根培养基包含约0.15-0.25mg/L的6-BA、约0.8-1.2mg/L的IBA和约0.8-1.2mg/L的NAA。在一实施方案中，所述生根培养基包含约0.2mg/L的6-BA、约1.0mg/L的IBA和约1.0mg/L的NAA。
[0020] 在一实施方案中，所述诱导培养基包含6-BA和NAA。在一实施方案中，所述诱导培养基包含约1.2-1.8mg/L的6-BA和约0.15-0.25mg/L的NAA。在一实施方案中，所述诱导培养基包含约1.5mg/L的6-BA和约0.2mg/L的NAA。
[0021] 在一实施方案中，所述增殖培养基包含6-BA、IBA和NAA。在一实施方案中，所述增殖培养基包含约0.8-1.2mg/L的6-BA、约0.15-0.25mg/L的IBA和约0.8-1.2mg/L的NAA。在一实施方案中，所述增殖培养基包含约1.0mg/L的6-BA、约0.2mg/L的IBA和约0.1mg/L的NAA。
[0022] 申请人根据长期实验结果，选用MS培养基作为光皮桦培养基的基础组分，并进行改良。MS培养基的大量元素和微量元素组成如表1所示。
[0023] 表1MS培养基中的大量元素和微量元素配方
[0024]
[0025] 在一实施方案中，所述诱导培养基包含约1/4-3/4份的MS培养基中的大量元素和约0.8-1.2份的MS培养基中的微量元素。在一实施方案中，所述诱导培养基包含约1/2份的MS培养基中的大量元素和约1份的MS培养基中的微量元素。
[0026] 在一实施方案中，所述诱导培养基还包含约1.6-2.4mg/L的氨基乙酸，约0.08-0.12mg/L的盐酸硫胺素、约0.4-0.6mg/L的盐酸吡哆醇、约0.4-0.6mg/L的烟酸和约80-
120mg/L的肌醇。在一实施方案中，所述诱导培养基包含约2mg/L的氨基乙酸，约0.1mg/L的盐酸硫胺素、约0.5mg/L的盐酸吡哆醇、约0.5mg/L的烟酸和约100mg/L的肌醇。
[0027] 在一实施方案中，所述诱导培养基还包含约15000-25000mg/L的糖类。在一实施方案中，所述诱导培养基包含约20000mg/L的糖类。
[0028] 在一实施方案中，所述诱导培养基还包含凝固剂。
[0029] 在一实施方案中，所述增殖培养基包含约0.8-1.2份的MS培养基中的大量元素和约0.8-1.2份的MS培养基中的微量元素。在一实施方案中，所述增殖培养基包含约1份的MS培养基中的大量元素和约1份的MS培养基中的微量元素。
[0030] 在一实施方案中，所述增殖培养基还包含约0.8-1.2mg/L的氨基乙酸，约0.08-0.12mg/L的盐酸硫胺素、约0.4-0.6mg/L的盐酸吡哆醇、约0.4-0.6mg/L的烟酸和约40-
60mg/L的肌醇。在一实施方案中，所述增殖培养基包含约1mg/L的氨基乙酸，约0.1mg/L的盐酸硫胺素、约0.5mg/L的盐酸吡哆醇、约0.5mg/L的烟酸和约50mg/L的肌醇。
[0031] 在一实施方案中，所述增殖培养基还包含约25000-35000mg/L的糖类。在一实施方案中，所述增殖培养基包含约30000mg/L的糖类。
[0032] 在一实施方案中，所述增殖培养基还包含凝固剂。
[0033] 在一实施方案中，所述生根培养基包含约1/8-3/8份的MS培养基中的大量元素和约0.8-1.2份的MS培养基中的微量元素。在一实施方案中，所述生根培养基包含约1/4份的MS培养基中的大量元素和约1份的MS培养基中的微量元素。
[0034] 在一实施方案中，所述生根培养基还包含约0.8-1.2mg/L的氨基乙酸，约0.08-0.12mg/L的盐酸硫胺素、约0.4-0.6mg/L的盐酸吡哆醇、约0.4-0.6mg/L的烟酸和约40-
60mg/L的肌醇。在一实施方案中，所述生根培养基包含约1mg/L的氨基乙酸，约0.1mg/L的盐酸硫胺素、约0.5mg/L的盐酸吡哆醇、约0.5mg/L的烟酸和约50mg/L的肌醇。
[0035] 在一实施方案中，所述生根培养基还包含约15000-25000mg/L的糖类。在一实施方案中，所述生根培养基包含约20000mg/L的糖类。
[0036] 在一实施方案中，所述生根培养基还包含凝固剂。
[0037] 在上述实施方案中，糖类可以为单糖或二糖。在一实施方案中，所述单糖为葡萄糖。在一实施方案中，所述二糖为蔗糖。
[0038] 在上述实施方案中，所述凝固剂可以为卡拉胶、琼脂粉或其任选的组合。在一实施方案中，凝固剂可以为卡拉胶。在一实施方案中，所述卡拉胶的量为约5500-8500mg/L。在一实施方案中，所述卡拉胶的量为约7000mg/L。在一实施方案中，凝固剂可以为琼脂粉。在一实施方案中，所述琼脂粉的量为约4000-6000mg/L。在一实施方案中，所述琼脂粉的量为约5000mg/L。
[0039] 任选地，FeSO4·7H2O先与Na2EDTA配制成络合物，然后才与其它溶液混合。优选地，培养基配制好后，分装并灭菌，优选在121℃下高温灭菌25-30min。
[0040] 在一具体实施方案中，诱导培养基、增殖培养基和生根培养基分别包含表2中所示组分。
[0041] 表2光皮桦组织培养的培养基组成
[0042]
[0043]
[0044] 本申请中所述的约1/8份、1/4份、3/8份、约1/2份、3/4份、约0.8份、约1份和约1.2份并非严格限定其所修饰的项目中各组分的比例，即，大量元素和微量元素中的各组分可各自为MS基本培养基中组分量的约1/8倍、1/4倍、3/8倍、约1/2倍、3/4倍、约0.8倍、约1倍和约1.2倍。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡，因此所述大量元素和微量元素中各组分，以及氨基乙酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、糖类的量可以为上述量±20％以内的量。凝固剂在培养基中主要起支持作用，其含量只要使培养基具有可成固体的硬度即可，因此凝固剂的量可以为上述量±20％以内的量。
[0045] 在一实施方案中，所述方法还包括采集外植体的步骤，任选地所述采集外植体的步骤包括从母树的基部取2-3cm长的幼嫩叶芽作为外植体，任选地所述母树为10年生以上且生长势旺盛的母树。在一实施方案中，在母树的基部选择健壮的萌芽，用剪刀剪取其2-3cm长的幼嫩叶芽作为外植体。
[0046] 在一实施方案中，所述方法还包括对外植体进行消毒的步骤。可以使用领域内常用的消毒剂对外植体进行消毒，例如使用NaClO3、HgCl2、84消毒液、双氧水、酒精等消毒剂或其任选的组合，任选地在消毒后使用无菌水冲洗。任选地使用每50ml含2-3滴吐温80的0.1％的HgCl2混合水溶液对外植体进行消毒。任选地在消毒之前使用3％的洗衣粉水浸泡外植体20min。在一实施方案中，将采集的外植体剪除多余的叶片后，先用3％的洗衣粉水浸泡20min，然后每根叶芽剪取1.5-2.0cm长放置到超净台上的无菌器皿中。用每50ml含2-3滴吐温80的0.1％的HgCl2混合水溶液消毒6min，然后用无菌水冲洗5-7遍。
[0047] 在一实施方案中，将洗净并消毒处理后的叶芽外植体垂直接种于外植体的诱导培养基上。外植体的诱导培养的培养条件优选为：培养基pH值为5.6-6.0，培养温度24-28℃。任选地，在暗培养7天后，再采用日光灯进行光照。任选地，诱导培养时的光照强度3500-
4000lx，每天光照时间为10-12小时。诱导培养时间任选地为30-40天。
[0048] 在一实施方案中，将诱导成功并萌发出诱导芽的外植体转接至增殖培养基上。外植体的增殖培养的培养条件优选为：培养基pH值为5.6-6.0，培养温度24-28℃。任选地，采用日光灯进行光照。任选地，增殖培养时的光照强度为3500-4000lx，每天光照时间10-12小时。任选地，增殖培养时间为35-40天。在一实施方案中，当外植体萌出3-4个侧芽，每个例芽生长出2-3片小叶时，将外植体取出剪成单芽，重新接种至增殖培养基，促进侧芽萌发生长，得到增殖芽，如此循环增殖培养，达到增殖的目的。
[0049] 在一实施方案中，将经过增殖培养的外植体，剪成带1-2片小叶的单芽，接种至生根培养基上。芽的生根培养的培养条件优选为：培养基pH值为5.6-6.0，培养温度24-28℃。任选地，采用日光灯进行光照。任选地，生根培养时的光照强度3500-4000lx，每天光照时间
10-14小时，培养时间30-40天。
[0050] 在一实施方案中，所述方法还包括对生根苗进行炼苗的步骤。任选地，当生根苗生长到4-5cm高时，将其转移到温室或大棚进行炼苗培养，培养温度15-30℃，保持温室或大棚内良好的通风，炼苗培养时间10-15天。任选地，炼苗时的光照主要为太阳光的散射光。
[0051] 在一实施方案中，所述方法还包括对组培苗进行移栽的步骤。在一实施方案中，将炼苗培养后的组培苗从培养瓶中取出，移栽至用1-3‰高锰酸钾液消毒后的黄心土基质营养杯或轻基质营养杯。
[0052] 在一实施方案中，所述方法还包括对移栽苗进行移栽后管理的步骤。在一实施方案中，将移栽有组培苗的营养杯放置在有自动控制喷雾设备的苗床上，晴天用75％遮光率的遮荫网遮光以减弱光照强度。任选地，在移栽后的前7天内白天喷雾频率为1次/10min，保持叶面湿润，晚上喷雾频率调整为1次/30min。任选地在移栽7天以后白天喷雾频率调整为1次/20min，晚上1次/60min，持续培养30-40天后，按常规育苗方式管理。
[0053] 在第二方面，本申请提供了通过以上方法获得的光皮桦组培苗。
[0054] 在第三方面，本申请提供了光皮桦植物组织培养基，其包括诱导培养基、生根培养基和任选地增殖培养基，其特征在于所述生根培养基包含6-BA、IBA和NAA。
[0055] 在一实施方案中，所述生根培养基包含约0.15-0.25mg/L的6-BA、约0.8-1.2mg/L的IBA和约0.8-1.2mg/L的NAA。在一实施方案中，所述生根培养基包含约0.2mg/L的6-BA、约1.0mg/L的IBA和约1.0mg/L的NAA。
[0056] 在一实施方案中，所述诱导培养基包含6-BA和NAA。在一实施方案中，所述诱导培养基包含约1.2-1.8mg/L的6-BA和约0.15-0.25mg/L的NAA。在一实施方案中，所述诱导培养基包含约1.5mg/L的6-BA和约0.2mg/L的NAA。
[0057] 在一实施方案中，所述增殖培养基包含6-BA、IBA和NAA。在一实施方案中，所述增殖培养基包含约0.8-1.2mg/L的6-BA、约0.15-0.25mg/L的IBA和约0.8-1.2mg/L的NAA。在一实施方案中，所述增殖培养基包含约1.0mg/L的6-BA、约0.2mg/L的IBA和约0.1mg/L的NAA。
[0058] 申请人根据长期实验结果，选用MS培养基作为光皮桦培养基的基础组分，并进行改良。MS培养基的大量元素和微量元素组成如表1所示。
[0059] 在一实施方案中，所述诱导培养基包含约1/4-3/4份的MS培养基中的大量元素和约0.8-1.2份的MS培养基中的微量元素。在一实施方案中，所述诱导培养基包含约1/2份的MS培养基中的大量元素和约1份的MS培养基中的微量元素。
[0060] 在一实施方案中，所述诱导培养基还包含约1.6-2.4mg/L的氨基乙酸，约0.08-0.12mg/L的盐酸硫胺素、约0.4-0.6mg/L的盐酸吡哆醇、约0.4-0.6mg/L的烟酸和约80-
120mg/L的肌醇。在一实施方案中，所述诱导培养基包含约2mg/L的氨基乙酸，约0.1mg/L的盐酸硫胺素、约0.5mg/L的盐酸吡哆醇、约0.5mg/L的烟酸和约100mg/L的肌醇。
[0061] 在一实施方案中，所述诱导培养基还包含约15000-25000mg/L的糖类。在一实施方案中，所述诱导培养基包含约20000mg/L的糖类。
[0062] 在一实施方案中，所述诱导培养基还包含凝固剂。
[0063] 在一实施方案中，所述增殖培养基包含约0.8-1.2份的MS培养基中的大量元素和约0.8-1.2份的MS培养基中的微量元素。在一实施方案中，所述增殖培养基包含约1份的MS培养基中的大量元素和约1份的MS培养基中的微量元素。
[0064] 在一实施方案中，所述增殖培养基还包含约0.8-1.2mg/L的氨基乙酸，约0.08-0.12mg/L的盐酸硫胺素、约0.4-0.6mg/L的盐酸吡哆醇、约0.4-0.6mg/L的烟酸和约40-
60mg/L的肌醇。在一实施方案中，所述增殖培养基包含约1mg/L的氨基乙酸，约0.1mg/L的盐酸硫胺素、约0.5mg/L的盐酸吡哆醇、约0.5mg/L的烟酸和约50mg/L的肌醇。
[0065] 在一实施方案中，所述增殖培养基还包含约25000-35000mg/L的糖类。在一实施方案中，所述增殖培养基包含约30000mg/L的糖类。
[0066] 在一实施方案中，所述增殖培养基还包含凝固剂。
[0067] 在一实施方案中，所述生根培养基包含约1/8-3/8份的MS培养基中的大量元素和约0.8-1.2份的MS培养基中的微量元素。在一实施方案中，所述生根培养基包含约1/4份的MS培养基中的大量元素和约1份的MS培养基中的微量元素。
[0068] 在一实施方案中，所述生根培养基还包含约0.8-1.2mg/L的氨基乙酸，约0.08-0.12mg/L的盐酸硫胺素、约0.4-0.6mg/L的盐酸吡哆醇、约0.4-0.6mg/L的烟酸和约40-
60mg/L的肌醇。在一实施方案中，所述生根培养基包含约1mg/L的氨基乙酸，约0.1mg/L的盐酸硫胺素、约0.5mg/L的盐酸吡哆醇、约0.5mg/L的烟酸和约50mg/L的肌醇。
[0069] 在一实施方案中，所述生根培养基还包含约15000-25000mg/L的糖类。在一实施方案中，所述生根培养基包含约20000mg/L的糖类。
[0070] 在一实施方案中，所述生根培养基还包含凝固剂。
[0071] 在上述实施方案中，糖类可以为单糖或二糖。在一实施方案中，所述单糖为葡萄糖。在一实施方案中，所述二糖为蔗糖。
[0072] 在上述实施方案中，所述凝固剂可以为卡拉胶、琼脂粉或其任选的组合。在一实施方案中，凝固剂可以为卡拉胶。在一实施方案中，所述卡拉胶的量为约5500-8500mg/L。在一实施方案中，所述卡拉胶的量为约7000mg/L。在一实施方案中，凝固剂可以为琼脂粉。在一实施方案中，所述琼脂粉的量为约4000-6000mg/L。在一实施方案中，所述琼脂粉的量为约5000mg/L。
[0073] 任选地，FeSO4·7H2O先与Na2EDTA配制成络合物，然后才与其它溶液混合。优选地，培养基配制好后，分装并灭菌，优选在121℃下高温灭菌25-30min。
[0074] 在一具体实施方案中，诱导培养基、增殖培养基和生根培养基分别包含表2中所示组分。
[0075] 本申请中所述的约1/8份、1/4份、3/8份、约1/2份、3/4份、约0.8份、约1份和约1.2份并非严格限定其所修饰的项目中各组分的比例，即，大量元素和微量元素中的各组分可各自为MS基本培养基中组分量的约1/8倍、1/4倍、3/8倍、约1/2倍、3/4倍、约0.8倍、约1倍和约1.2倍。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡，因此所述大量元素和微量元素中各组分，以及氨基乙酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、糖类的量可以为上述量±20％以内的量。凝固剂在培养基中主要起支持作用，其含量只要使培养基具有可成固体的硬度即可，因此凝固剂的量可以为上述量±20％以内的量。
[0076] 除非另外定义，否则本文所用术语(包括技术及科学术语)被赋予其对于本领域普通技术人员而言普通且惯用的含义，且并不限于特殊或专用含义，除非本文明确如此定义。
[0077] 在提供值范围的情况下，应了解在实施方案中涵盖上限及下限以及范围的上限与下限之间的各居中值。例如本文中使用的24-28℃也包括25℃、26℃、27℃以及其之间任意的范围，例如25-28℃、26-28℃、27-28℃、24-27℃、25-27℃、26-27℃、24-26℃、25-26℃、24-25℃。
[0078] 本说明书中所用的表示成分、反应条件等的量的所有数值应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非明确指出不适用，否则本文的数值参数为可根据希望获得的特性而改变的近似值。例如，本文中使用的100mg/L应理解为约100mg/L。除非另外明确说明，否则术语“约”是指其所修饰的量±10％以内的量。
[0079] 除非另外明确说明，否则本申请中、尤其权利要求书中所用的术语及短语及其变体应视作具开放性而非具限制性。作为实例，术语“包括，，应理解为意指“包括，但不限于”，其为开放性且不排除其他未叙述的组分或方法步骤；术语“具有”应理解为“至少具有”；术语“实例”用于提供所讨论项目的示例性范例，而非其详尽性或限制性列表；且使用如“优选”、“任选”的术语及具有类似含义的词语意欲强调在本发明实施方案的基础上，可以用于该实施方案中的替代或额外特征。本领域技术人员还可以理解，在一个实施方案中描述的特征或步骤，其并不限于该特定的实施方案，其可以用于其他的实施方案中，与其中的特征或步骤进行任意组合，以解决本发明的技术问题。
[0080] 实施例
[0081] 下面结合实施例对光皮桦组织培养方法做进一步描述。
[0082] 实施例1.光皮桦组织培养
[0083] 以下为光皮桦(Betula luminifera)组织培养的具体操作步骤。
[0084] (1)采集外植体。申请人于2010年4月选择一棵11年生光皮桦优树作为采集繁殖材料的母树。
[0085] (2)叶芽外植体材料的消毒。在树干基部采集幼嫩的萌生叶芽带回室内，用剪刀剪取其2-3cm长的幼嫩叶芽作为外植体，剪除多余的叶片后，先用3％的洗衣粉水浸泡20min，然后每根叶芽剪取1.5-2.0cm长放置到超净台上的无菌器皿中。用每50ml含3滴吐温80的0.1％的HgCl2混合水溶液消毒6min，然后用无菌水冲洗7遍。
[0086] (3)叶芽外植体的诱导培养。将洗净并消毒处理后的叶芽外植体垂直接种于外植体的诱导培养基上(培养基组成见表3)，培养基pH值为5.7，培养温度25-27℃，暗培养7天后，再采用日光灯进行光照，光照强度为3500-4000lx，每天光照时间12小时，培养30天后，消毒成功的叶芽外植体开始萌发生长，10至15天诱导芽生长至2-3cm，且苗芽健壮。
[0087] (4)组培苗的增殖培养。将诱导成功并萌发出新叶芽的外植体转接至增殖培养基上(培养基组成见表3)，培养基pH值为5.7，培养温度25-28℃，采用日光灯进行光照，光照强度3500-4000lx，每天光照时间12小时，培养35天后，外植体萌出3-4个侧芽，且每个侧芽生长出2-3片小叶，将小苗取出剪成单芽，重新接种至增殖培养基，促进侧芽萌发生长，循环增殖培养，平均增殖系数达3.4以上，达到了增殖的目的。
[0088] (5)组培苗的生根培养。将经过增殖培养的增殖芽，剪成带1-2片小叶的单芽，接种至生根培养基上(培养基组成见表3)，培养基pH值为5.7，培养温度25-28℃，采用日光灯进行光照，光照强度3500-4000lx，每天光照时间12小时，培养30天后每根小苗生出根2条以上，根系长达2-4cm，平均生根率达82％以上，根系生长健壮。
[0089] 表3光皮桦组织培养的培养基组成
[0090]
[0091]
[0092] (6)生根苗的炼苗和移栽。当组培苗生根并生长到4-5cm高时，转移到温室或大棚进行炼苗培养，培养温度25-30℃，以接受太阳光的散射光为主，保持温室或大棚内良好的通风，炼苗培养时间10天。将炼苗培养后的组培苗从培养瓶中取出，洗净根部的培养基，移栽至用1-3‰高锰酸钾液消毒后轻基质营养杯。
[0093] (7)生根苗移栽后的管理。将移栽有组培苗的营养杯放置在有自动控制喷雾设备的苗床上，晴天用75％遮光率的遮荫网遮光以减弱光照强度。移栽后的前7天内白天喷雾频率为1次/10min，保持叶面湿润，晚上喷雾频率调整为1次/30min。7天以后白天喷雾频率调整为1次/20min，晚上1次/60min，持续培养30天后，组培苗已生出新根并恢复了抗性与自养能力。
[0094] 本申请公开了所涉及发明的一般描述和多个具体实施方式或方案。但是，不得将本申请所涉及的发明仅限制为这些一般描述和公开的具体实施方式或方案。根据本申请的公开，本领域所属技术人员可以对所述具体的实施方式或方案进行适当的调整，例如将不同实施方案中的具体技术特征进行重新组合，形成仍然属于该发明构思的其他实施方案。
