一种可用于治疗骨转移癌的氧化还原敏感骨靶向胶束

摘要

本发明公开了一种可用于治疗骨转移癌的氧化还原敏感骨靶向胶束，该胶束以阿仑膦酸钠(ALN)为骨靶向配基，以分子量5000的葡聚糖(DEX(5K))为亲水材料，以十四胺(MA)为疏水材料，以3,3二硫二丙酸(DPC)为交联剂，以阿霉素(DOX)为模型药物，制备出兼有主动骨靶向及对肿瘤细胞微环境有特异性响应的胶束DOX@MA‑DEX(5K)‑ALN。该骨靶向胶束DOX@MA‑DEX(5K)‑ALN对DOX具有较高的载药量与包封率，可明显增加DOX对羟基磷灰石(HA)的吸附量，将更多的DOX递送至骨转移瘤处，从而使DOX在肿瘤组织富集，增加DOX对骨转移癌的治疗作用，减轻肿瘤对骨的破坏作用；同时降低DOX在正常组织的分布，提高DOX的疗效，降低毒副作用，为治疗骨转移癌递药系统的开发提供新思路。

权利要求

1.一种用于治疗骨转移癌的氧化还原敏感骨靶向胶束，其特征是以阿仑膦酸钠(ALN)为骨靶向配基，以分子量5000的葡聚糖(DEX(5K))为亲水材料，以十四胺(MA)为疏水材料，以

3,3二硫二丙酸(DPC)为交联剂合成MA-DEX(5K)-ALN，以阿霉素(DOX)为模型药物，制备出兼有主动骨靶向及对肿瘤细胞微环境有特异性响应的纳米胶束DOX@MA-DEX(5K)-ALN；

具体制备方法如下：

(1)二硫二丙酸-阿仑膦酸钠(DPC-ALN)的合成方法

①在20mL的1,4二氧六环中加入2.4mmol的DPC 501.1mg，4.8mmol的EDCI 916.8mg，搅拌30min，然后加入5.0mmol的NHS 575.2mg以及150μL的TEA，继续搅拌活化3h；②在20mL的蒸馏水中加入1.2mmol的ALN 325.6mg，充分溶解后，分三批次缓慢滴加入上述反应液，在反应过程中，缓慢滴加0.2M NaOH使反应液的pH值稳定维持在7.0左右，2小时后继续滴加0.2M NaOH使pH调成9.0，继续反应过夜，反应结束后旋干溶剂，固体用大量二氯甲烷反复润洗三次，甲醇润洗三次，得产物；

(2)二硫二丙酸-十四胺(DPC-MA)的合成方法

在20mL的1,4二氧六环中加入2.4mmol的DPC 500mg，4.8mmol的EDCI 916.8mg，搅拌

30min，然后加入5.0mmol的NHS 575.2mg以及150μL的TEA，继续搅拌活化3h，随后在反应液中加入1.3mmol的MA 217.6mg，室温反应12h，TLC监测反应，结束反应后，过柱分离，其中展开剂以体积比计为：二氯甲烷:甲醇＝10:1；

(3)葡聚糖(5K)-3,3二硫二丙酸-十四胺(DEX(5K)-DPC-MA)的合成方法

称取一定量的DPC-MA、EDCI、NHS和TEA依次溶于30mL的DMSO中，充分溶解后加入一定量的DEX(5K)，室温反应12h，结束反应后，过滤反应液，得淡黄色澄清液体，滤液用大量二氯甲烷沉淀，并反复用二氯甲烷清洗沉淀，甲醇润洗沉淀三次，最后将沉淀溶于少量蒸馏水中透析冻干，即得DEX(5K)-DPC-OA；

(4)十四胺-3,3二硫二丙酸-葡聚糖(5K)-3,3二硫二丙酸-阿仑膦酸钠(MA-DPC-DEX(5K)-DPC-ALN)的合成方法称取一定量的DPC-ALN、EDCI、NHS和TEA依次溶于40mL的DMSO中，充分溶解后加入一定量的DEX(5K)-DPC-MA，油浴60℃反应48h，反应结束后透析冻干即得MA-DPC-DEX(5K)-DPC-ALN，缩写为MA-DEX(5K)-ALN；

(5)MA-DEX(5K)-ALN载阿霉素(DOX)胶束的制备

称取3mg DOX·HCl于4mL DMSO中，再加入3μL的TEA，在60℃油浴中避光磁力搅拌1h使其充分溶解，加10mg的MA-DEX(5K)-ALN于制备液中，持续搅拌2h后缓慢滴加蒸馏水32mL，继续搅拌12h；将上述混合液装入分子截留量为2000的透析袋中，透析48h，每6h换一次水，透析后冷冻干燥得聚合物载药胶束。

说明书

一种可用于治疗骨转移癌的氧化还原敏感骨靶向胶束

技术领域

[0001] 本发明涉及一种新型葡聚糖(DEX)氧化还原敏感骨靶向胶束的设计制备及应用方案。

背景技术

[0002] 研究发现至少50％的癌症晚期患者会出现骨转移的现象。肿瘤骨转移的发生影响了药物对肿瘤的治疗，增加了患者的疼痛，降低了患者的存活率。由于骨质硬度大、血管分布少、药物渗透性低等特点，传统给药方式很难将药物有效递送至骨转移瘤处。如何有效递送药物，是解决骨转移瘤治疗难题的关键。骨靶向递药系统的提出，为骨转移瘤的治疗带来了曙光。

[0003] 双膦酸盐类(BPs)对骨的HA具有很高的亲和力。一旦BPs进入体内后，BPs就会被快速从血液循环中清除而吸附到暴露的骨矿物质区域。阿仑膦酸钠(ALN)属于第三代BPs类药物，具有很强的亲骨性，其结构简单，可化学修饰，被广泛用作递药系统中的骨靶向配体。研究表明，对环境响应的递药系统对药物的可控释放起到关键作用。二硫键是一种对谷胱甘肽(GSH)敏感的化学键，在肿瘤细胞内外GSH的含量差别巨大。其中肿瘤细胞内GSH的浓度可达到2-10mM，而肿瘤细胞外GSH的浓度约为2-20μM，浓度几乎相差1000倍。利用二硫键连接的递药系统可以选择性的将药物释放在GSH含量高的肿瘤细胞内，而在血液中可以稳定存在。

[0004] 葡聚糖(DEX)具有良好的生物相容性和水溶性，已被广泛应用于生物医药领域。基于DEX制备的胶束递药系统，因其具有粒径小、载药力强等特征已被广泛研究。最近的研究还表明基于DEX的胶束在体内循环也具有类似PEG“隐形”的功能。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种可用于治疗骨转移癌的氧化还原敏感骨靶向胶束，可以将更多DOX递送到骨转移瘤处，同时显著降低DOX在正常组织的分布，从而有效提高DOX的抗肿瘤活性，降低其毒副作用，为治疗骨转移癌递药系统的开发提供新思路。

[0006] 一种可用于治疗骨转移癌的氧化还原敏感骨靶向胶束，其特征是以阿仑膦酸钠(ALN)为骨靶向配基，以分子量5000的葡聚糖(DEX(5K))为亲水材料，以十四胺(MA)为疏水材料，以3,3二硫二丙酸(DPC)为交联剂合成MA-DEX(5K)-ALN，以阿霉素(DOX)为模型药物，制备出兼有主动骨靶向及对肿瘤细胞微环境有特异性响应的纳米胶束DOX@MA-DEX(5K)-ALN。

[0007] 具体制备方法如下：

[0008] (1)二硫二丙酸-阿仑膦酸钠(DPC-ALN)的合成方法

[0009] ①在20mL的1,4二氧六环中加入2.4mmol的DPC 501.1mg，4.8mmol的EDCI 916.8mg，搅拌30min，然后加入5.0mmol的NHS 575.2mg以及150μL的TEA，继续搅拌活化3h；
②在20mL的蒸馏水中加入1.2mmol的ALN 325.6mg，充分溶解后，分三批次缓慢滴加入上述反应液，在反应过程中，缓慢滴加0.2M NaOH使反应液的pH值稳定维持在7.0左右，2小时后继续滴加0.2M NaOH使pH调成9.0，继续反应过夜，反应结束后旋干溶剂，固体用大量二氯甲烷反复润洗三次，甲醇润洗三次，得产物；

[0010] (2)二硫二丙酸-十四胺(DPC-MA)的合成方法

[0011] 在20mL的1,4二氧六环中加入2.4mmol的DPC 500mg，4.8mmol的EDCI 916.8mg，搅拌30min，然后加入5.0mmol的NHS 575.2mg以及150μL的TEA，继续搅拌活化3h，随后在反应液中加入1.3mmol的MA 217.6mg，室温反应12h，TLC监测反应，结束反应后，过柱分离，其中展开剂以体积比计为：二氯甲烷:甲醇＝10:1；

[0012] (3)葡聚糖(5K)-3,3二硫二丙酸-十四胺(DEX(5K)-DPC-MA)的合成方法[0013] 称取一定量的DPC-MA、EDCI、NHS和TEA依次溶于30mL的DMSO中，充分溶解后加入一定量的DEX(5K)，室温反应12h，结束反应后，过滤反应液，得淡黄色澄清液体，滤液用大量二氯甲烷沉淀，并反复用二氯甲烷清洗沉淀，甲醇润洗沉淀三次，最后将沉淀溶于少量蒸馏水中透析冻干，即得DEX(5K)-DPC-OA；

[0014] (4)十四胺-3,3二硫二丙酸-葡聚糖(5K)-3,3二硫二丙酸-阿仑膦酸钠(MA-DPC-DEX(5K)-DPC-ALN)的合成方法

[0015] 称取一定量的DPC-ALN、EDCI、NHS和TEA依次溶于40mL的DMSO中，充分溶解后加入一定量的DEX(5K)-DPC-MA，油浴60℃反应48h，反应结束后透析冻干即得MA-DPC-DEX(5K)-DPC-ALN，缩写为MA-DEX(5K)-ALN；

[0016] (5)MA-DEX(5K)-ALN载阿霉素(DOX)胶束的制备

[0017] 称取3mg DOX·HCl于4mL DMSO中，再加入3μL的TEA，在60℃油浴中避光磁力搅拌1h使其充分溶解，加10mg的MA-DEX(5K)-ALN于制备液中，持续搅拌2h后缓慢滴加蒸馏水
32mL，继续搅拌12h；将上述混合液装入分子截留量为2000的透析袋中，透析48h，每6h换一次水，透析后冷冻干燥得聚合物载药胶束。

[0018] 本发明骨靶向胶束DOX@MA-DEX(5K)-ALN对DOX具有较高的载药量与包封率，可明显增加DOX对羟基磷灰石(HA)的吸附量，将更多的DOX递送至骨转移瘤处，从而使DOX在肿瘤组织富集，增加DOX对骨转移癌的治疗作用，减轻肿瘤对骨的破坏作用；同时降低DOX在正常组织的分布，提高DOX的疗效，降低毒副作用。

附图说明

[0019] 图1是DOX及DOX@MA-DEX(5K)-ALN胶束治疗荷瘤裸鼠后肿瘤体积的变化图。裸鼠胫骨骨髓腔注射A549细胞造模，尾静脉给药。A：普通相机观察荷瘤裸鼠肿瘤体积；B：测量荷瘤裸鼠肿瘤体积变化；C：各给药组肿瘤体积抑制率。n＝3， *P<0.05，VS DOX；#P<0.05，VS Control。

[0020] 图2是DOX及DOX@MA-DEX(5K)-ALN胶束治疗荷瘤裸鼠后裸鼠体重的变化曲线图。裸鼠胫骨骨髓腔注射A549细胞造模，尾静脉给药。n＝3， *P<0.05，VS DOX。

[0021] 图3是DOX及DOX@MA-DEX(5K)-ALN胶束治疗荷瘤裸鼠后荷瘤裸鼠右后肢Micro-CT重建(A)及矢状位图像(B)；荷瘤裸鼠右后肢Micro-CT数据分析(C和D)。BV/TV为骨体积/组织体积。n＝3， *P<0.05，VS DOX。

[0022] 具体实施方法

[0023] DOX@MA-DEX(5K)-ALN胶束的体内外抗肿瘤活性研究

[0024] 1目的：通过体内外实验，评价DOX@MA-DEX(5K)-ALN胶束的抗肿瘤活性。

[0025] 2研究方法：

[0026] 2.1包封率及载药量测定

[0027] 应用荧光分光光度法测定DOX浓度，激发波长为470nm，发射波长为597nm，用DMSO作为溶媒配制100μg/mL DOX标准储备液，然后分别稀释为0.1、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、25.0μg/mL，荧光分光光度计测定荧光强度，以荧光强度对浓度进行线性拟合，得到检测DOX标准曲线的回归方程为y＝20.118x-15.352，R2＝0.9976。其中DOX在0.1-25μg/mL范围内，荧光光度值与浓度具有良好的线性关系。

[0028] 称取1mg的载药胶束DOX@MA-DEX(5K)-ALN溶解于3mLDMSO中，测定DOX荧光强度，每个样品测定三次。载药量以及包封率由以下公式计算：

[0029] 载药量＝(胶束中药物量/胶束的量)×100％

[0030] 包封率＝(胶束中包封的药物量/制备胶束投入的药物总量)×100％

[0031] 2.2评价DOX@MA-DEX(5K)-ALN胶束与HA的吸附动力学

[0032] 精密称取1mg的DOX和DOX@MA-DEX(5K)-ALN胶束溶解于10mL的PBS中，测定溶液的吸光度值，记录数据。然后分别加入100mg的HA搅拌，在5、15、30和60min时，样品于5000rmp离心10min，吸取上清液分别测定吸光度值。

[0033] 吸附率＝[(测前-测后)/测前]×100％

[0034] 2.3评价DOX@MA-DEX(5K)-ALN胶束的体外细胞毒性

[0035] 利用MTT法测定DOX以及DOX@MA-DEX(5K)-ALN胶束对A549细胞、PC-3细胞、MDA-MB-231细胞及MDA-MB-231/ADR细胞的毒性作用。取对数生长期的肿瘤细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化，接种于96孔板(细胞浓度1×104/mL，接种体积200μL)。置于孵箱(37℃)中培养24h，弃去培养液。分别将DOX和DOX@MA-DEX(5K)-ALN胶束溶于无血清的培养液中，以不加药物为阴性对照组。胶束折合DOX的浓度分别为0.08、0.8、8.0和40.0μg/mL，每孔加入200μL药物溶液，孵育24h。每孔加入20μL MTT溶液，继续培养4h后弃去培养液，每孔加入200μL的DMSO。将培养板置于摇床振摇10min，酶标仪490nm处测定吸光度值。细胞生存率％＝(给药后的吸光度值/阴性对照的吸光度值)×100％。

[0036] 2.4评价DOX@MA-DEX(5K)-ALN胶束的体内抗肿瘤活性

[0037] 2.4.1试验分组

[0038] 雄性裸鼠随机分为3组：荷瘤模型组、DOX组(5mg/kg)、DOX@MA-DEX(5K)-ALN胶束组(5mg/kg)。

[0039] 2.4.2荷瘤动物模型的建立

[0040] 取对数生长期的A549细胞，经洗涤、消化、离心后得到浓缩细胞，然后加入无血清7
RPMI 1640培养液稀释细胞使其浓度达到1×10 /mL，待用。将裸鼠膝关节弯曲60°，然后用
1mL的注射器吸取100μL的上述细胞悬液，针头倾斜插入裸鼠胫骨骨髓腔内，将细胞注入，建立荷瘤动物模型。待肿瘤可触及时，按照分组，分别静脉注射药物，七天后再次给予相同剂量药物。

[0041] 2.4.3观察指标

[0042] ①观察肿瘤的体积变化：每天观察肿瘤生长情况，根据公式计算肿瘤体积。

[0043] Tumor Volume＝L×W2×0.5(L，W分别代表肿瘤最长直径和最短直径)[0044] ②观察裸鼠的体重变化。记录动物体重变化，绘制体重变化曲线，观察药物对动物体重的影响。

[0045] ③Micro-CT观察骨转移瘤处骨质的变化。

[0046] 3实验结果：

[0047] 3.1包封率及载药量

[0048] 表1 DOX@MA-DEX(5K)-ALN胶束的载药量及包封率

[0049]

[0050] 结果显示本专利设计的胶束具有高载药量和高包封率特性。

[0051] 3.2体外抗肿瘤活性

[0052] DOX@MA-DEX(5K)-ALN胶束对A549细胞、PC-3细胞、MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231/ADR细胞的毒性具有明显的浓度依赖性，随着DOX浓度的增大细胞存活率逐渐降低。相比于DOX，DOX@MA-DEX(5K)-ALN胶束对A549细胞、PC-3细胞、MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231/ADR细胞的毒性更强。DOX对MDA-MB-231/ADR细胞几乎无毒性，而DOX@MA-DEX(5K)-ALN胶束显示出较强的细胞毒性。

[0053] 细胞毒性研究为评价药物体外抗肿瘤活性的重要指标，上述结果显示，DOX@MA-DEX(5K)–ALN胶束对肿瘤细胞具有突出的细胞毒性，同时对于耐药肿瘤细胞也具有良好的体外抗肿瘤效果。

[0054] 3.3体内抗肿瘤活性

[0055] 图1A是利用普通相机记录的各组荷瘤裸鼠的生长情况，图1B所示为荷瘤裸鼠肿瘤体积的变化。从图中可以看出，空白对照组的裸鼠肿瘤体积增长迅速。在第30天的时候，空白对照组的平均肿瘤体积已经增加到4168±204mm3。DOX组的治疗能一定程度抑制肿瘤的快速增长，在第30天肿瘤体积到达了2711±372mm3。而相同剂量条件下，DOX@MA-DEX(5K)-ALN表现出比DOX更好的抗肿瘤效果。在给药第30后DOX@MA-DEX(5K)-ALN给药组裸鼠肿瘤体积为789±118mm3。图1C为不同给药组对荷瘤裸鼠的肿瘤抑制率。从图中可以看出DOX@MA-DEX(5K)-ALN相比于DOX具有更好的肿瘤抑制能力。实验结束后，DOX、DOX@MA-DEX(5K)-ALN的肿瘤抑制率分别是38.4％，67.9％。

[0056] 图2所示为裸鼠的体重变化。从图中可以看出所有裸鼠在最初的两周内体重都有缓慢上升，但是随着治疗时间的延长，空白对照组和DOX给药组裸鼠的体重出现迅速下降趋势。DOX@MA-DEX(5K)-ALN给药组的裸鼠体重略有下降。体重变化是衡量DOX对机体毒副作用的一个重要指标，DOX装载于MA-DEX(5K)-ALN胶束后，体重变化较游离DOX显著降低，毒副作用明显下降。

[0057] 利用Micro-CT对骨转移瘤处的骨组织进行扫描。从图3A、图3B中可以看出阳性对照组的小鼠胫骨及腓骨处被严重破坏，呈现出明显的溶骨性病变，皮质破坏，大多数骨小梁消失。而DOX组的裸鼠胫骨及腓骨处呈现出中度破坏，部分皮质尚完整存在，骨小梁也相对较多。DOX@MA-DEX(5K)-ALN给药组对骨质的破坏较小，与阴性对照组相比，骨质基本保持完整形态。图3C、图3D结果是利用Micro-CT分析软件对胫骨骨小梁的体积以及数量做了进一步的分析。结果显示DOX@MA-DEX(5K)-ALN给药组可以明显改善肿瘤细胞对骨小梁的破坏作用。同时利用Micro-CT对胫骨近端的骨密度值进行了检测，从结果可以看出DOX@MA-DEX(5K)-ALN给药组骨密度值均大于DOX组，且具有显著性差异；DOX@MA-DEX(5K)-ALN与正常对照组相比，没有显著性差异。结果说明DOX@MA-DEX(5K)-ALN通过积极地抗肿瘤作用能够减弱肿瘤对骨质的侵袭，减轻对骨密度的降低作用。

[0058] 4结论：

[0059] 体内外的抗肿瘤实验结果表明，与游离DOX相比，DOX@MA-DEX(5K)-ALN胶束可有效提高DOX在肿瘤组织的富集，同时显著减少DOX在正常组织的分布，减轻毒副作用，呈现出显著增强的抗肿瘤活性，具有良好的开发前景。