一种花菁类化合物及其应用

摘要

本发明涉及用于检测超氧阴离子(O2‑)和硫烷硫的荧光探针，具体的说是一种花菁类化合物及其应用。花菁类化合物如通式Ⅰ所示，并以所述花菁类化合物作为硫化氢的荧光探针。本发明所述荧光探针，在超氧阴离子(O2‑)和硫烷硫存在下，对应的荧光发射波长和强度发生变化，可用于生物超氧阴离子(O2‑)和硫烷硫的检测，并可大大降低外部检测条件的干扰，检测信噪比高、灵敏度和选择性好。这类化合物作为荧光探针可用于复杂生物样品中超氧阴离子(O2‑)和硫烷硫水平的联动检测，对研究超氧阴离子(O2‑)和硫烷硫的细胞信号转导，具有重要的生物医学意义。

权利要求

1.一种花菁类化合物，其特征在于：花菁类化合物如通式I所示，通式I中，

R1为C4-22的烷基；

R2为乙基；

X为N、O或S；

Y为-SH、-SeH或-TeH基团。

2.一种权利要求1所述的花菁类化合物的应用，其特征在于：以所述通式I所示的花菁类化合物作为非治疗和诊断目的的O2-或硫烷硫的荧光探针。

3.一种荧光探针，其特征在于：荧光探针为通式I所示的以花菁染料作为荧光母体，并在母体上引入烷基R1、R2，对具备线粒体、溶酶体定位功能团的检测基团Y；

通式I所示，

通式I中，

R1为C4-22的烷基；

R2为乙基；

X为N、O或S；

Y为-SH、-SeH或-TeH基团。

4.按权利要求3所述的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针用于定性/定量的检测生理环境下细胞或生物体内外的O2-或硫烷硫浓度。

说明书

一种花菁类化合物及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及用于检测超氧阴离子(O2-)和硫烷硫的荧光探针，具体的说是一种花菁类化合物及其应用。

背景技术

[0002] 生物体内高浓度的H2S可抑制线粒体呼吸，与此相反，硫烷硫的细胞毒性却非常低。在小鼠组织中，高速率的H2S生成和降解过程依赖着线粒体中活性氧的分解代谢来平衡。线粒体产生的O2-可将H2S迅速转化为硫烷硫稳定储存起来，直到响应生理信号时才会被释放。线粒体中硫烷硫的含量约占细胞总含量的60％以上。有证据表明，受控的O2-产生的过程，可以激活硫化氢和硫烷硫的可逆互变状态，从而介导细胞信号转导、调控细胞增殖和凋亡、调节机体正常生理过程、控制免疫系统应答。从目前研究来看，用于检测分析O2-介导硫烷硫信号转导的三个前提需要进行重新评估：1)前期报道认为生物体内可耐受的H2S水平幅度，比新的实验证据高几个数量级；2)在体外系统实验时，所检测的硫化氢可能是还原硫烷硫产生的；3)在活性氧存在下，外源补充硫化氢的同时也会补充硫烷硫。由于存在受活性氧调控的H2S和硫烷硫的可逆互变，目前无法将H2S和硫烷硫割裂开来研究。在未来研究中，区分细胞信号转导功能是H2S诱导的效应，还是硫烷硫介导的效果将是重要的努力方向。因此，细胞线粒体内的硫烷硫在多大程度上以及通过什么机制受O2-调控、并开启信号转导通路仍有待进一步明确。这就需要新的实验证据证明：在硫化氢信号转导过程中，硫烷硫分子是否为实际的信号传导分子。如果该情况得到证实，那么H2S可能只是基于硫烷硫信号传导终端所释放的终产物，即作为硫烷硫的还原产物。这也与生理状态的H2S浓度总是保持在较低的浓度(nM)相一致。本专利中所涉及的荧光探针将有助于探索H2S可能不是实际的细胞信号转导分子，许多生理效应是基于硫烷硫介导和调控的结果，以期解决这个关键的问题。

[0003] 鉴于O2-调控硫烷硫细胞信号转导通路的重要生物医学意义，发展用于检测O2-和硫烷硫浓度变化水平的分析方法已经变得越来越迫切。目前，用于检测O2-的方法有:电子顺磁共振法，SOD酶活性测定法，高效液相色谱法(HPLC)以及电化学方法；用于检测硫烷硫的方法有:比色法，电化学分析，色谱分析法。但是这些方法往往需要试样预处理，荧光探针方法以其高时空分辨、操作简便和原位非损伤检测等优点，在生物活性物种检测领域，已成为一种功能强大的研究辅助工具。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种花菁类化合物及其应用。

[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

[0006] 一种花菁类化合物，花菁类化合物如通式Ⅰ所示，

[0007]

[0008] 通式Ⅰ中，

[0009] R1为烷基链或有机酸酯链；

[0010] R2为三苯基鏻阳离子或丙基吗啉；

[0011] X为N、O或S；

[0012] Y为-SH、-SeH或-TeH基团。

[0013] 所述烷基为C4-22的烷基；有机酸酯为甲酸酯或丁酸酯。

[0014] 进一步的说，所述通式Ⅰ中R1为有机酸酯链、R2为三苯基鏻阳离子或丙基吗啉；X为N、O或S；Y为-SH、-SeH或-TeH基团。

[0015] 一种花菁类化合物的应用，以所述通式Ⅰ所示的花菁类化合物作为O2-或硫烷硫的荧光探针。

[0016] 一种荧光探针：荧光探针为通式Ⅰ所示的以花菁染料作为荧光母体，并在母体上引入亲脂性基团有机酸酯链或烷基，对具备线粒体、溶酶体定位功能团的三苯基鏻、吗啉或检测基团Y。

[0017] 所述检测基团Y为-SH、-SeH或-TeH基团。

[0018] 所述荧光探针用于定性/定量的检测生理环境下细胞或生物体内外的O2-或硫烷硫浓度。

[0019] 本发明的有益效果：

[0020] 本发明化合物用于作为O2-和硫烷硫联动检测的荧光探针，其在检测O2-前后荧光探针吸收和荧光发射最大波长会有改变；检测硫烷硫前后荧光探针荧光发射强度会有所改变。可用于水体系、模拟生理环境和细胞内O2-和硫烷硫水平的联动检测，并可大大降低外部检测条件的干扰，提高检测精度。本发明化合物用作荧光探针，可用于细胞内O2-和硫烷硫联动检测，这对深入研究O2-和硫烷硫在生物体内的信号转导过程和机理，进一步了解O2-和硫烷硫的生理和毒理作用具有重要的生物医学意义。

附图说明

[0021] 图1为本发明实施例提供的采用的荧光探针对O2-检测前后荧光变化。

[0022] 图2为本发明实施例提供的所采用的荧光探针对O2-的选择性示意图；其中，横坐标从左至右依次为：超氧阴离子、羟基自由基、双氧水、脂质过氧化物、枯析氢过氧化物、过氧化叔丁醇、一氧化氮、过氧化亚硝、次氯酸。

[0023] 图3为本发明实施例提供的所采用的荧光探针对硫烷硫检测前后荧光光谱的变化。

[0024] 图4为本发明实施例提供的所采用的荧光探针对硫烷硫的选择性示意图；其中，横坐标从左至右依次为：过硫化钠、多硫半胱氨酸、斜方硫、硫化氢、谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸、氧化型半胱氨酸、氧化型谷胱甘肽。

具体实施方式

[0025] 荧光探针通式为：

[0026]

[0027] 通式Ⅰ中，

[0028] R1为烷基或有机酸酯；

[0029] R2为三苯基鏻阳离子或丙基吗啉；

[0030] X为N、O或S；

[0031] Y为-SH、-SeH或-TeH基团；

[0032] 优选为：

[0033] X为O时，所述花菁类化合物的通式为：

[0034]

[0035] 通式II中：

[0036] R1为乙基链；

[0037] R2三苯基鏻阳离子或丙基吗啉；

[0038] Y为-SH、-SeH或-TeH基团；

[0039] 将通式Ⅰ与待测定水体、模拟生理环境或生物体内外的超氧阴离子反应从而导致荧光强度的改变，所得通式III结构的化合物；

[0040]

[0041] 将通式III与待测定水体、模拟生理环境或生物体内外的硫烷硫反应从而导致荧光强度的改变，所得通式IV结构的化合物；

[0042]

[0043] 将通式II结构应用于检测超氧阴离子时，与O2-作用后，生成具有通式VI结构的化合物，从而导致荧光强度的改变；

[0044]

[0045] 将通式VI结构应用于检测硫烷硫时，与硫烷硫作用后，生成具有通式VII结构的化合物，从而导致荧光波长的改变；

[0046]

[0047] 通式III可对O2-或硫烷硫进行定性、定量的检测。

[0048] 本发明中使用的术语“有机酸酯链”包括直链有机酸酯基和支有机酸酯基。如提及单个烷基如“丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。

具体实施方式

[0049] 实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。

[0050] 实施例1.花菁类化合物的制备：

[0051] 通式Ⅰ中所示花菁类荧光团来自市售商品，然后在荧光团相应的位置分别修饰上不同的定位基团。最后将修饰定位基团的荧光团和取代苯甲酸在二氯甲烷溶剂中反应得到的相应的花菁类化合物。具体实施例如下：

[0052] 制备式一化合物：

[0053] 在氩气保护下，2,2’-二硫代二苯甲酸(1.53g,5mmol)和草酰氯(2.96g,23.3mmol)于100ml二氯甲烷中，冰水浴下反应3小时，蒸干溶剂待用。冰水浴下，将花菁荧光团(500mg,1.08mmol)溶于二氯甲烷中，然后滴加2,2’-二硫代二苯甲酰氯，冰浴下反应1小时后水洗至中性，然后二氯甲烷(100ml╳3)萃取，蒸干溶剂后，将粗产品溶于50ml乙醇，冰水浴下分批滴加硼氢化钠(g,mol)，反应持续15分钟后以稀盐酸(10％)中和至中性，然后二氯甲烷(100ml╳3)萃取，加硫酸钠干燥，蒸干溶剂后用硅胶柱色谱(200-300目)分离。洗脱剂为二氯甲烷和石油醚(1:1/v/v)，收集黄色组分，蒸干溶剂后得得产品0.51g，收率:75％。

[0054] 式一化合物:1H NMR(500MHz,CDCl3-D1)δ(ppm):1.12-1.47(m,14H),1.79(s,6H),2.60-2.86(t,8H),3.43(s,1H),4.48(s,1H),5.34-5.54(m,3H),6.08(s,1H),6.51-6.80(m,
4H),7.01-7.61(m,7H).LC-MS(API-ES):m/z C41H46N2O2S Calcd630.3280,found[M-1]-
629.3208.

[0055]

[0056] 制备式二化合物：

[0057] 在氩气保护下，在氩气保护下，2,2’-二硫代二苯甲酸(1.53g,5mmol)和草酰氯(2.96g,23.3mmol)于100ml二氯甲烷中，冰水浴下反应3小时，蒸干溶剂待用。冰水浴下，将花菁荧光团(500mg,1.08mmol)溶于二氯甲烷中，然后滴加2,2’-二硫代二苯甲酰氯，冰浴下反应1小时后水洗至中性，然后二氯甲烷(100ml╳3)萃取，蒸干溶剂后，将粗产品溶于50ml乙醇，冰水浴下分批滴加硼氢化钠(g,mol)，反应持续15分钟后以稀盐酸(10％)中和至中性，然后二氯甲烷(100ml╳3)萃取，加硫酸钠干燥，蒸干溶剂后用硅胶柱色谱(200-300目)分离。洗脱剂为二氯甲烷和乙酸乙酯(5:1/v/v)，收集黄色组分，蒸干溶剂后得得产品0.63g，收率:80％。

[0058] 式二化合物1H NMR(500MHz,CDCl3-D1)δ(ppm):1H NMR(500MHz,CDCl3-D1)δ(ppm):1.15-1.48(m,13H),1.70(s,6H),2.66-2.88(t,14H),3.31-3.21(s,4H),3.49(s,1H),4.50(s,1H),5.31-5.60(m,3H),6.18(s,1H),6.50-6.85(m,4H),7.06-7.68(m,7H).LC-MS(API-ES):m/z C46H55N3O3S Calcd729.3964,found[M+H]+730.4037.

[0059]

[0060] 制备式三化合物：

[0061] 在氩气保护下，在氩气保护下，2,2’-二硫代二苯甲酸(1.53g,5mmol)和草酰氯(2.96g,23.3mmol)于100ml二氯甲烷中，冰水浴下反应3小时，蒸干溶剂待用。冰水浴下，将花菁荧光团(500mg,1.08mmol)溶于二氯甲烷中，然后滴加2,2’-二硫代二苯甲酰氯，冰浴下反应1小时后水洗至中性，然后二氯甲烷(100ml╳3)萃取，蒸干溶剂后，将粗产品溶于50ml乙醇，冰水浴下分批滴加硼氢化钠(g,mol)，反应持续15分钟后以稀盐酸(10％)中和至中性，然后二氯甲烷(100ml╳3)萃取，加硫酸钠干燥，蒸干溶剂后用硅胶柱色谱(200-300目)分离。洗脱剂为二氯甲烷和乙酸乙酯(3:1/v/v)，收集黄色组分，蒸干溶剂后得得产品0.69g，收率:70％。

[0062] 式三化合物1H NMR(500MHz,CDCl3-D1)δ(ppm):1.11-1.44(m,13H),1.73(s,6H),2.64-2.81(t,12H),3.44(s,1H),4.49(s,1H),5.39-5.56(m,3H),6.04(s,1H),6.54-6.82(m,4H),7.02-7.63(m,22H).LC-MS(API-ES):m/z C61H64N2O2PS+Calcd919.4421,found[M]+
919.4422.

[0063]

[0064] 另外，通式Ⅰ所示的其它化合物按照上述的说明制备获得。

[0065] 现以式一所指化合物为例说明测定过程，以下实施例中涉及到的探针化合物均为式一所指化合物：

[0066] 实施例2

[0067] 将制备所得式一化合物作为探针应用于水体系、模拟生理环境和细胞内进行对硫烷硫的检测，模拟生理条件，以下各项实验均在pH＝7.4条件下进行(HEPES缓冲溶液，浓度为40mM)，探针浓度采用2μM。

[0068] 上述制备所得化合物式一对超氧阴离子的响应：

[0069] pH采用HEPES缓冲溶液控制。于10ml比色管中加入2μM化合物式一，再加入40mM HEPES，然后加入5μM超氧阴离子，超纯水定容到10ml，摇匀溶液，平衡10min后，将上述工作液加入荧光皿中测定荧光光谱。荧光光谱在检测超氧阴离子前后的变化如图1所示。本化合物可用于实现生物体内的超氧阴离子检测。同时，本发明实施例提供的探针与超氧阴离子反应后产物结构如下：

[0070]

[0071] 实施例3

[0072] 化合物式一对超氧阴离子的选择性

[0073] pH采用HEPES缓冲溶液控制。取多个10ml比色管，并在每个10ml比色管中加入2μM化合物式一，再加入40mM pH为7.4的HEPES缓冲液，然后分别加入如图2所示，待测物依次为：超氧阴离子、羟基自由基、双氧水、过氧化亚油酸、枯烯氢过氧化物、过氧化叔丁醇、一氧化氮、过氧化亚硝酰阴离子和次氯酸。最后用超纯水定容到10ml。摇匀溶液，25℃下平衡10min后，将各个比色管中工作液分别倒入到荧光皿中测定荧光光谱。式一化合物对超氧阴离子的选择性如图2所示。并由图可知式一化合物对超氧阴离子具有很好的选择性。

[0074] 实施例4

[0075] 实施例2操作后，继续向待测液中加入10μM硫烷硫(Na2S2)，摇匀溶液，平衡10min后，将上述工作液加入荧光皿中测定荧光光谱。荧光光谱在检测超氧阴离子前后的变化如图3所示。本化合物可用于实现生物体内的硫烷硫的检测。同时，本发明实施例提供的探针与硫烷硫反应后产物结构如下：

[0076]

[0077] 实施例5

[0078] 实施例2操作后，向待测液中加入化合物如图2所示，待测物依次为：Na2S2、多硫半胱氨酸、斜方硫、硫氢化钠、氧化型谷胱甘肽、氧化型半胱氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸和硫辛酸。摇匀溶液，25℃下平衡10min后，将各个比色管中工作液分别倒入到荧光皿中测定荧光光谱。式一化合物对硫烷硫的选择性如图4所示。并由图可知式一化合物对硫烷硫具有很好的选择性。

[0079] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。