一种楮头红甾体皂苷及其应用

摘要

本发明公开了一种楮头红甾体皂苷及其应用，所述楮头红甾体皂苷为呋甾烷型甾体皂苷，分子式为C32H50O9，分子量482。由药用植物楮头红经乙醇提取、正丁醇萃取，TLC和PHPLC分离纯化而成。体外生物活性实验表明，楮头红甾体皂苷具有抑制HepG2.2.2.15细胞培养中HBsAg、HBeAg的分泌和HBV?DNA的复制，具有一定的体外抗HBV活性作用，可用于制备抗乙肝病毒的药物中。

权利要求

1.一种楮头红甾体皂苷，其特征在于：所述皂苷结构式为 ，其中R= 戊糖基；

所述楮头红甾体皂苷制备方法如下：

1）由楮头红全草粉末，经乙醇提取并减压浓缩提取液成浸膏；

2）浸膏用蒸馏水混悬，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取，弃去萃取液；

3）水混悬最后用正丁醇萃取，收集萃取液，减压浓缩，冷冻干燥得固体粉末状物质；

4）将此固体粉末状物质溶于甲醇，经硅胶柱层析和制备高效液相色谱（PHPLC）分离，结晶得一种物质单体，经鉴定为呋甾烷型甾体皂苷，糖基为戊糖，分子式为C32H50O9，分子量

482。

2.一种如权利要求1所述的楮头红甾体皂苷在制备抗乙肝病毒的药物中的应用。

说明书

一种楮头红甾体皂苷及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及楮头红甾体皂苷及其应用，属于医药领域。

背景技术

[0002] 乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)从发现至今已有四十余年。1963年，Blumberg等发现澳大利亚血友病患者血清中含有一种能与美国血友病患者血清起反应的抗原，称其为澳大利亚抗原（即乙型肝炎病毒表面抗原，Hepatitis B Virus Surface Antigen，HBsAg）。1970年Dane等在乙肝病人血清中发现了42nm大小的HBV颗粒，其外膜成分中含有HBsAg，1986年国际病毒命名委员会正式将HBV归为嗜肝DNA病毒科。

[0003] 乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个世界性的健康问题，呈世界性分布，它不仅可以导致急、慢性HBV感染与75%―90%的原发性肝癌相关。全球慢性HBV感染约有3.5亿人，我国属HBV感染的高流行区。据我国传染病报告和疾病监测统计，乙肝占急性肝炎病例的25%左右，与HBV感染有关的肝病死亡率约23/10万，其中肝癌死亡率约13/10万，乙肝对人类健康危害最为严重，是我国最重要的公共卫生问题之一。由一些数据估计，我国慢性无症状HBV携带者（AsC）超过1.2亿，占全世界HBV感染的1/3，其中慢性乙型肝炎有3000万人，先、现患率约为2770/10万，这些患者10%―30%可发展为肝硬化，一部分可进一步发展为肝癌，累计现行的和既往的，我国已有一半以上人口经受HBV感染，所以慢性乙肝的治疗是亟待解决的问题。

[0004] 目前临床上用于治疗HBV感染的药物除干扰素（Interferon，IFN）外，还有少数天然药物及众多化学合成药物如核苷类似物阿糖腺苷（adenine arabinside，Ara-A）、拉米夫定（lamivudine）、泛昔洛韦（famciclovir）、阿地福韦（adefovir）、恩他卡韦（ontacavir）等。这些药物已在实验室和临床应用中证实能显著抑制HBV DNA的复制或抑制HBsAg、HBeAg的表达与分泌。然而这些药物却存在一定的不足，干扰素的缺点主要表现在：①价格昂贵；②注射制剂；③对患者的选择有严格的限制性；④明显的不良反应，如发热、血小板减少、暂时性脱发等；⑤在失代偿性肝病患者中应用有一定的风险。核苷类药物的不足表现在：①需要长期治疗；②耐药性病毒变异的发生率高；③停药后发生ALT反跳，甚至发生重症肝炎。上述的种种不足都使得临床应用受到了极大的限制。因此，寻找和开发无污染、低毒副作用、价格低廉、安全有效的新型抗HBV药物具有十分重要的理论、经济和社会意义。

[0005] 随着天然植物及其提取物或有效成分抗病毒、抗肿瘤、调节免疫等研究的不断深入，人们发现，天然药物具有对人体低毒副作用，不易产生耐药性等显著特点。针对目前病毒性肝炎治疗中的困难，寻找与证实有效天然药物已经成为临床治疗病毒性肝炎的希望与重要手段。传统中草药品种繁多，已广泛应用于临床治疗慢性乙型肝炎并取得一定疗效，积累了丰富的临床经验，但中草药抗HBV的作用机理还有待于深入研究，所以筛选中草药抗HBV这方面的工作尚有很大的潜力；而且传统中草药不良反应少，价格低，日益受到国内外研究者的普遍重视，寻求有抗病毒作用的天然药物是当前研究的热点。目前国内外对天然药物生物活性与功能的研究已发展为研究与分析天然药物的活性部位、活性成分及至活性成分的结构或构型，以进一步明确药物的作用机理，真正实现“天然药物现代化”这一目标。如美国Holk等在天然植物茜草抗HBV作用的深入研究中，发现其抑制HBsAg、HBeAg表达的具体有效成分为三种奈-氢醌化合物。日本学者Nin等研究证明治疗肝炎的传统药物甘草中起免疫调节作用的成分为一种糖类（甘草甜素）。

[0006] 楮头红（Sarcopyramis nepalensis Wall），野牡丹科肉穗草属，别名：风樻斗草、卫环草。主要分布于我国的福建、台湾、四川、云南、江西、广西、广东、湖北、贵州等地。楮头红为直立草本，一年生，高10～30 cm，茎无毛，肉质，四棱形，整棵植株为紫红色。叶对生，阔卵形或披针形，顶端渐尖，边缘有锯齿，3～5条脉，叶柄无毛，叶面粗糙疏毛，呈青绿色，叶背微柔毛，呈灰绿色；花生于枝顶或叶腋，两性，数朵簇生，花瓣紫红色；花萼为倒圆锥形，呈风樻斗状，故此得名。楮头红的功用主治：去肝火，治耳聋、耳鸣及目雾羞明，风湿痹痛，主治肺热咳嗽，急性肝炎。在福建民间楮头红被广泛用于治疗急慢性肝炎，价格便宜，取材方便，疗效显著，这是一种很好的中药材。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种楮头红甾体皂苷及其应用。

[0008] 本发明所述的楮头红甾体皂苷为呋甾烷型甾体皂苷，所述皂苷结构式为，其中R= 戊糖基，分子式为C32H50O9，分子量为482。从楮头红中提取并将其应用于抗乙肝病毒药物中。

[0009] 本发明所述的楮头红甾体皂苷类物质的应用，包括如下步骤：

[0010] 1）楮头红全草用蒸馏水洗净，常温下晾干，粉碎，称取楮头红全草粉末，乙醇回流浸提减压浓缩乙醇成浸膏。浸膏用蒸馏水混悬，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取，最后用正丁醇多次萃取，直至正丁醇层无色。收集正丁醇层萃取液，减压浓缩，冷冻干燥得固体粉末状物质；将此固体粉末状物质溶于甲醇，经硅胶柱层析和制备高效液相（PHPLC）分离，获得一种物质单体，经波谱学鉴定为呋甾烷型甾体皂苷，糖基为戊糖，分子量482。并将应用于抗乙肝病毒活性试验研究。

[0011] 2）上述步骤1）楮头红甾体皂苷应用于抗乙肝病毒活性试验研究，采用1）所述获得的楮头红甾体皂苷化合物进行了体外抗乙肝病毒试验研究，结果显示楮头红甾体皂苷具有抑制HepG2.2.2.15细胞培养中HBsAg、HBeAg的分泌和HBV-DNA的复制，具有一定的体外抗HBV活性作用。

[0012] 本发明的有益效果：1、楮头红甾体皂苷目前未有报道具有抗乙肝病毒作用，本发明发现楮头红甾体皂苷能作为抗乙肝病毒药物，此药物其最大优点是天然产物，与现有抗病毒药相比，毒副小，无不良反应，且还有抗氧化、提高机体免疫力等作用，可长期使用；2、与直接使用中草药相比，楮头红甾体皂苷作为具体化学组分的物质直接作为抗病毒的药效成分，用药量少，无其它非药用组分，因而能减少其它成分可能对肌体的伤害（副作用），临床用药简单；3、楮头红中草药原料易得，价廉，提取分离工艺简单，生产方便，开发价值高。

附图说明

[0013] 图1 楮头红甾体皂苷的ESI-MS。

[0014] 图2楮头红甾体皂苷的红外光谱。

[0015] 图3楮头红甾体皂苷的苷元结构。

具体实施方式

[0016] 实施例1

[0017] 1.楮头红甾体皂苷的制备

[0018] 1.1楮头红甾体皂苷的提取

[0019] 楮头红全草用蒸馏水洗净，常温下晾干，粉碎，称取楮头红全草粉末200g，置于圆底烧瓶（2000mL）中，加入95%乙醇1000mL，80℃回流浸提3h，过滤，滤渣重复浸提两次（浸提时间为2h，2h），合并三次滤液。减压浓缩乙醇成浸膏。浸膏用100mL蒸馏水混悬，依次用石油醚（30~60℃）、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取，最后用正丁醇多次萃取，直至正丁醇层无色。收集正丁醇层萃取液，减压浓缩，冷冻干燥得楮头红粗皂苷粉。

[0020] 楮头红甾体皂苷分离纯化

[0021] 粗制皂苷通过硅胶柱层析分离，采用TLC进行柱层析前溶剂体系的摸索和层析后样品组分的鉴定，柱层析淋洗液采用氯仿：甲醇=10~3 : 0~7；淋洗洗脱时依次用极性递增的洗脱剂洗脱，根据样品量、柱体积确定淋洗液的收集每10~50mL收集一杯；收集液采用TLC检测，显色相同的合并、浓缩。本组分收集的淋洗液比例为氯仿：甲醇8:2。

[0022] 采用PHPLC进行纯化和制备，制备条件为C18制备色谱柱、检测波长200~254nm、流动相甲醇（乙腈）：水=5~60:95~40、进样量根据制备柱填料直径和内径以及样品浓度20~200μL。根据色谱峰收集不同组分。本组分经2次PHPLC，乙腈-水（12:88~18:82）梯度洗脱，收集其中一较大单一色谱峰组分。将收集到的组分，通过HPLC进行纯度验证（色谱条件：色谱柱：C18，MaxMw=107Da，7.8×300 mm；Detector：UV检测波长：203nm，210nm；流速：1 mL·min-1；
进样量：10µL；流动相：乙腈和水（20:80））。本皂苷化合物的纯度为97.8%。 浓缩收集液结晶获得纯皂苷单体——经波谱学进行结构鉴定，相关鉴定数据、图谱参见附录：图一、二、三和附表1，该皂苷分子量482，为呋甾烷型甾体皂苷。

[0023] 附表1 楮头红甾体皂苷的13CNMR数据

[0024]

[0025] 2、楮头红甾体皂苷体外抗乙肝病毒研究

[0026] 本试验采用目前应用最广泛的体外抗乙肝病毒药物筛选模型HepG2.2.2.15细胞模型，从楮头红中提取分离得到的皂苷与HepG2.2.2.15细胞作用，取其细胞上清液，分别测定其乙肝表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)的滴度变化，来判断该药物是否有效，并采用MTT法测定各部分的细胞毒性。综合这二个指标，对楮头红甾体皂苷进行体外抗乙肝药效学试验，并选用临床上已证实的具有抗乙肝病毒作用的阿昔洛韦（ACV）作为阳性对照药物，以评价皂苷抗乙肝病毒的效果。

[0027] 实验材料

[0028] 2.1.1 细胞株

[0029] 乙型肝炎病毒（HBV）DNA克隆转染人肝癌细胞（HepG2）的2.2.15细胞系，美国Mount Sinai医学中心构建，北京军事医学科学院引进并保藏。引进后自进行传代培养。置5%CO2培养箱，37℃培养。培养基为DMEM,添加10%的胎牛血清，加入200 mg/ml的G418。

[0030] 试验药物

[0031] 楮头红甾体皂苷样品、阳性对照药物阿昔洛韦（ACV）用DMSO适量溶解后，DMEM稀释配制成所需各浓度，4℃冰箱保存备用（临用前经0.22μm滤膜滤过）。

[0032] 主要试剂和仪器为常规试剂及仪器。

[0033] 主要试剂的配制

[0034] 2.1.4.1 DMEM培养基

[0035] 配制每升DMEM培养基，应在950ml去离子水中加入：

[0036] DMEM培养基干粉 13.39克

[0037] NaHCO3 3.7克

[0038] HEPES 3.5克

[0039] 充分搅拌溶解后，定容至1000ml，用5% NaHCO3调pH值至7.2，微孔滤膜(0.22μm)无菌过滤后4℃贮存。

[0040] 血清

[0041] 购得的胎牛血清56℃灭活30min，分装后-20℃贮存。

[0042] 溶液

[0043] EDTA.4Na 200mg

[0044] 无Ca2+、Mg2+的PBS 加至1L

[0045] 用5% NaHCO3或1NHCL调 PH值至7.2，高压消毒灭菌（121℃；15min）,分装小瓶于4℃贮存。

[0046] 盐酸异丙醇

[0047] 异丙醇       300ml

[0048] 浓盐酸       1ml

[0049] 混匀后分装小瓶于4℃贮存。

[0050] 谷氨酰胺溶液（100倍浓度）

[0051] 谷氨酰胺     2.922克

[0052] 去离子水     加至100ml

[0053] 充分搅拌溶解后，微孔滤膜(0.22μm)无菌过滤，分装小瓶，后-20℃贮存。

[0054] 溶液（20000ug/ml, 100倍浓度）

[0055] G418       100mg

[0056] 生理盐水   5ml

[0057] 充分溶解后, 过滤除菌，于4℃贮存。

[0058] 青霉素、链霉素溶液（100倍浓度）

[0059] 青、链霉素           1.0×106IU

[0060] 生理盐水            加至100ml

[0061] 过滤除菌，分装小瓶，-20℃贮存，用时每100ml溶液加此溶液1ml。

[0062] 溶液（5mg/ml）

[0063] MTT                               5mg

[0064] 培养液（无血清、酚红）或生理盐水     1ml

[0065] 微孔滤膜(0.22μm)无菌过滤, 于4℃避光保存，可使用2周，若暂不用，先冻存。

[0066] 冻存液

[0067] 二甲基亚砜（DMSO）           一份

[0068] 培养液                        九份

[0069] 现用，或配制后放入普通冰箱冰盒内保存，使用前于室温下水浴溶解。

[0070] 实验方法

[0071] 2.2.1 细胞的复苏

[0072] 基本步骤：调配37℃~40℃的温水；从液氮罐中取出HepG2.2.2.15细胞冻存管，立即投入37℃~40℃的温水中快速晃动，直至冻存液完全融解，融解过程在1-2min内完成；将细胞冻存悬液移入离心管，加入约5ml培养液，轻轻吹匀；将细胞悬液800r-1000r/min离心5min，弃上清液；给细胞沉淀加入完全培养液，轻轻吹吸打匀，将细胞悬液移入培养瓶，加足培养液进行培养，置于37℃，5%CO2细胞培养箱培养。

[0073] 细胞的传代培养

[0074] HepG2.2.2.15细胞置于5%CO2，37℃培养。培养基为DMEM，添加10%的胎牛血清，3% L-谷氨酰胺1%，G418 200ug/ml，青霉素100u/ml，链霉素 100u/ml。2.2.15细胞长满培养瓶后，先用EDTA消化10-30秒，再用0.25%胰酶37℃消化3-10min，加培养液吹打，1：3或1：4传5
代，8天长满，采用细胞记数板记数，配制成10个/ml接种细胞培养板，96孔板每孔0.1ml；24孔板每孔1ml，5%CO2，37℃培养24小时进行实验。

[0075] 细胞计数方法

[0076] 一般用血细胞计数板，按白细胞计数法进行计数。

[0077] 取待稀释的细胞悬液1ml加生理盐水做5倍稀释，用10×10的倍数进行计数，中央为红细胞计数用，四角大格为白细胞计数用，计数时仅统计完整的细胞，若聚成一团的细胞按一个细胞进行计数，在一个方格中，如果有细胞位于线上，一般计上线不计下线，计左线不计右线，计数误差不超过±5%，计数后需计算每ml悬液中的细胞数，由于计数板中的每一2 3
方格的面积为0.1cm，高为0.01cm，体积为0.0001cm。每ml细胞数按式1计算：

[0078] 每ml细胞数=(n/4)×10000×5                         （1）

[0079] 式中：n为四大格细胞总数

[0080] 2.2.4 MTT比色法测细胞存活率

[0081] HepG2.2.2.15细胞培养于96孔培养板，每孔80μl培养液；加入20μlMTT，继续培养3-4h；吸去100μl培养液，加入等量0.04-0.1mol/L盐酸异丙醇溶液，室温下约10min（或将平板置于微型震荡器震荡），使结晶物溶解；在酶标仪上测定光吸收，测定波长为570nm。

[0082] 法测药物毒性

[0083] 将HepG2.2.2.15细胞按105 个/ml接种于96孔培养板中，0.1 ml/孔，次日用培养液将待测药物分别配成几种不同的浓度，加入细胞孔，每孔浓度加3孔，0.1ml/孔，并设无药细胞对照及阳性对照药。加药后培养4天，弃上清用MTT染色，每孔加1mg/ml的MTT无血清培养液0.1ml，孵育4小时，弃上清，加入0.04mol/L盐酸异丙醇0.1ml溶解后，用570nm波长比色测定OD值，实验重复3次。

[0084] 测HBsAg、HBeAg分泌规律

[0085] 将HepG2.2.2.15细胞105/ml接种于24孔细胞培养板，每孔1.0ml，共10孔，第3、5、8、11、13天收集上清250μl，培养液补足原量至第13天，培养上清于-20℃冻存，最后集中按试剂盒说明书，用ELISA法测定HBsAg、HBeAg。

[0086] 药物对HBV抑制试验

[0087] 将HepG2.2.2.15细胞按105/ml接种于24孔板，每孔1.0ml，次日弃培养液，以待测药物的HepG2.2.2.15细胞的半数毒性浓度为起始浓度用培养液进行倍比稀释，另设无药对照及阳性对照药，培养于37℃、5%CO2培养箱中。每4天收取上清，并换加原浓度药液继续培养，将收集的上清-20℃冻存，于第12天收集完，集中用ELISA法测定HBsAg、HBeAg，实验重复3次。

[0088] 法测HBsAg、HBeAg

[0089] （1）将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18~25℃）。

[0090] （2）浓缩洗涤液配制前充分摇匀如有晶体应充分融解，浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。

[0091] （3）将微孔板条固定于支架，按序编号。

[0092] （4）每孔加入待测标本50μl，设阴、阳对照各2孔，每孔加入阴、阳对照各50μl，并设空白对照一孔；

[0093] （5）每孔加入酶标记抗体50μl（除空白对照外）、充分混匀后封板，置于37℃环境中孵育30min；

[0094] （6）手工洗板；弃去孔内液体，洗涤液贮满各孔，静置5秒后甩干，重复5次后拍干；

[0095] （7）每孔加显色剂A液、B液各50μl，充分混匀，封板，置37℃环境中孵育15min；

[0096] （8）每孔加入终止液50μl，混匀；

[0097] （9）用酶标仪读数，取波长450nm，先用空白空校零。然后读取各孔OD值。（阴性对照OD值低于0.05作为0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。）

[0098] 2.2.9 数据分析

[0099] 2.2.9.1 MTT法测药物毒性后可得：

[0100]              （2）

[0101] 根据Red-Meuench法计算半数有毒浓度TC50可得

[0102]     （3）

[0103] 式中：B——

[0104]      A——

[0105]      C——A-B

[0106] 2.2.9.2 采用ELISA法，显色反应完成后用自动酶标仪读取OD值，计算抑制率，以抑制率大于50%为有抑制作用。根据测定数据计算药物抑制抗原百分率[公式（4）]；药物抑制抗原半数有效浓度IC50[公式（5）]，即HBsAg和HBeAg抑制率为50%时的药物浓度；选择治疗指数TI[公式（6）],TI大于1以上者为有效，在1~2之间说明药物有效，但有一定毒性；大于2则效果较好，毒性较小；指数越大，则疗效越好，安全范围越大。统计学处理，采用t检验作组间均数比较，数据统计分析由SPSS11.5软件处理，P<0.05表示差异有显著性。

[0107]     （4）

[0108]          （5）

[0109] 式中：B——

[0110]      A——

[0111]      C——A-B

[0112]                                        （6）

[0113] 2.3 结果分析

[0114] 2.3.1 阳性药物（ACV）的体外抗乙肝病毒试验结果

[0115] 2.3.1.1 阳性药物（ACV）对HepG2.2.2.15细胞的毒性

[0116] 不同浓度ACV处理培养后，MTT试验结果显示对HepG2.2.2.15细胞生长有抑制作用，且其作用具有一定的浓度依赖性，浓度越大，抑制作用越明显。在浓度为0.31mg/ml时的细胞抑制率为3.51%，此浓度下的细胞存活率为96.49%(>95%)，由此可知ACV的TC0为0.31mg/ml。根据公式（3）可得TC50为4.36 mg/ml。ACV的细胞毒性测定结果见表1。

[0117] 表1 ACV在HepG2.2.2.15细胞培养中的毒性（n=3, ）

[0118]

[0119] 2.3.1.2 阳性药物（ACV）抑制HepG2.2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的作用[0120] 不同浓度ACV处理培养4天和8天后收集细胞上清液，ELISA法测HBsAg、HBeAg水平显示ACV对HBsAg、HBeAg均有抑制作用，且随着ACV浓度的增加，其抑制作用增强，抑制率增加，显示出一定的量效关系。并且随着培养时间的推移抑制作用也逐渐增强。不同浓度ACV在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg、HBeAg的抑制作用结果见表2和3。

[0121] 表2 ACV在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg的抑制作用（n=3, ）

[0122]

[0123] 表3 ACV在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBeAg的抑制作用（n=3, ）

[0124]

[0125] 2.3.1.3 阳性药物（ACV）体外抗乙肝病的治疗指数（TI）

[0126] 根据公式（5），我们可以得到ACV在第8天抑制HepG2.2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的时的IC50分别为0.56mg/ml 和0.48mg/ml。根据公式（6）可以得到ACV对HBsAg、HBeAg的治疗指数TI分别为7.68和9.13。具体结果见表4。

[0127] 表4 ACV在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg和HBeAg的IC50和TI

[0128]

[0129] 2.3.2 楮头红甾体皂苷的体外抗乙肝病毒作用

[0130] 2.3.2.1 楮头红甾体皂苷对HepG2.2.2.15细胞的毒性

[0131] 不同浓度楮头红甾体皂苷处理组培养后，MTT试验结果显示对HepG2.2.2.15细胞生长有抑制作用，且其作用具有一定的浓度依赖性，浓度越大，抑制作用越明显。在浓度为3.0mg/ml时的细胞抑制率为1.50%，此浓度下的细胞存活率为98.48%(>95%)，由此可知楮头红甾体皂苷的TC0为1.50mg/ml。根据公式（2），（3）可得TC50为15.62 mg/ml。楮头红甾体皂苷的细胞毒性测定结果见表5。

[0132] 表5 楮头红甾体皂苷在HepG2.2.2.15细胞培养中的毒性（n=3, ）

[0133]

[0134] 2.3.2.2 楮头红甾体皂苷抑制HepG2.2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的作用[0135] 不同浓度楮头红甾体皂苷处理培养4天和8天后收集细胞上清液，ELISA法测HBsAg、HBeAg水平显示楮头红甾体皂苷对HBsAg、HBeAg均有抑制作用，且随着楮头红甾体皂苷浓度的增加，其抑制作用增强，抑制率增加，显示出一定的量效关系。并且随着培养时间的推移抑制作用也逐渐增强。不同浓度楮头红甾体皂苷在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg、HBeAg的抑制作用结果见表6和7。

[0136] 表6 楮头红甾体皂苷在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg的抑制作用（n=3, ）[0137]

[0138] 表7 楮头红甾体皂苷在HepG2.2.2.15细胞 培养中对HBeAg的抑制作用（n=3, ）[0139]

[0140] 2.3.2.3 楮头红甾体皂苷体外抗乙肝病的治疗指数（TI）

[0141] 根据公式（5），我们可以得到楮头红甾体皂苷在第8天抑制HepG2.2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的时的IC50分别为2.49mg/ml 和3.79mg/ml。根据公式（6）可以得到楮头红甾体皂苷对HBsAg、HBeAg的治疗指数TI分别为6.27和4.12。具体结果见表8。

[0142] 表8 楮头红甾体皂苷在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg和HBeAg的IC50和TI[0143]

[0144] 3 结论

[0145] 本试验结果显示楮头红甾体皂苷与细胞对照组相比均显示明显的抑制作用，且随着甾体皂苷浓度的增加，其抑制作用增强，显示出一定的量效关系，对HBsAg、HBeAg的治疗指数有效低毒(TI分别为6.27和4.12)。可见楮头红对HepG2.2.2.15细胞抑制作用的有效成分之一为甾体皂苷，这种皂苷可以抑制HepG2.2.2.15细胞培养中HBsAg、HBeAg的分泌和HBV-DNA的复制，具有一定的体外抗HBV活性。本研究为进一步深入研究植物的抗乙肝病毒生物活性奠定了实验基础，亦为高效低毒的抗药物筛选、临床应用提供了一个新的选择。

[0146] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。