本发明公开了一种华法林与氯吡格雷个体化用药相关基因多态性检测试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒包括通用芯片、引物组合物甲和引物组合物乙；引物组合物甲中的每个引物组合物单元用于鉴别华法林耐药性相关基因的一个多态性位点；引物组合物乙中的每个引物组合物单元用于鉴别氯吡格雷耐药性相关基因的一个多态性位点。本发明的试剂盒具有集成化程度高、灵敏度高、应用范围广、特异性高、检测结果稳定、可靠性高、使用方法快速简便、可操作性强、易于实现自动化等优点，可用于基因突变检测、基因多态性分析等方面，适用于临床疾病突变检测、药物基因组学分析、法医学鉴定等基因分析领域。
1.一种用于检测华法林耐药性相关基因的多态性和氯吡格雷耐药性相关基因的多态性的试剂盒，包括通用芯片、用于鉴别华法林耐药性相关基因的多态性的引物组合物甲和用于鉴别氯吡格雷耐药性相关基因的多态性的引物组合物乙；
所述引物组合物甲包括五个引物组合物单元，每个引物组合物单元用于鉴别华法林耐药性相关基因的一个多态性位点；所述引物组合物乙包括四个引物组合物单元，每个引物组合物单元用于鉴别氯吡格雷耐药性相关基因的一个多态性位点；
每个所述引物组合物单元由两条特异性引物和一条共用引物组成，其中一条特异性引物和所述共用引物的组合用于扩增野生型基因，另一条特异性引物和所述共用引物的组合用于扩增突变型基因；
所述特异性引物由Tag序列和靶序列区段组成；所有所述特异性引物的5′末端具有不同的Tag序列；所有所述Tag序列两两之间的Tm值之差均小于等于5℃；所有所述Tag序列之间、所有所述Tag序列与所有特异性引物的靶序列区段之间没有交叉杂交且无发夹结构；所有所述Tag序列与含有所述基因的物种的基因组的同源性较低；所述同源性较低是指连续匹配或相同的核苷酸数小于10个；
所述通用芯片上设有与所述Tag序列一一对应的Tag探针，每条Tag探针上具有与其相对应的Tag序列；
所述引物组合物甲由如下引物组合物单元组成：第一个引物组合物单元、第二个引物组合物单元、第三个引物组合物单元、第四个引物组合物单元和第五个引物组合物单元；所述引物组合物乙由如下引物组合物单元组成：第六个引物组合物单元、第七个引物组合物单元、第八个引物组合物单元和第九个引物组合物单元中；
第一个引物组 合物单元中 ：一条 特异性引物的 序列为Tag1序 列-CTGAAAAACAACCATTGTCCG，另一条特异性引物为Tag2序列-CTGAAAAACAACCATTTGCCA，共用引物的序列为TCAAGTGGTTCTCGTGCCTC；
第二个引物组 合物单元中 ：一条 特异性引物的 序列为Tag3序 列-GACCTCCCATCCTAGTCCAACA，另一条特异性引物的序列为Tag4序列-GACCTCCCATCCTAGTCCAATG，共用引物的序列为AGGTCTAAGATGAAAAGCAGGGC；
第三个引物组 合物单元中 ：一条 特异性引物的 序列为Tag5序 列-GCACGAGGTCCAGAGATCCA，另一条特异性引物的序列为Tag6序列-TGCACGAGGTCCAGAGATATC，共用引物的序列为CACCCGGTGATGGTAGAGG；
第四个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag7序列-CAGGGTCCGGCCACTC，另一条特异性引物的序列为Tag8序列-CAGGGTCCGGCCACTT，共用引物的序列为GACATTGTGCTCCCAGACGG；
第五个引物组 合物单元中 ：一条 特异性引物的 序列为Tag9序 列-CCCAGAAGACTCAGAGAACCAG，另一条特异性引物的序列为Tag10序列-GCCCAGAAGACTCAGAGACACAA，共用引物的序列为TGAACTACTGGGCTAAGGGGAC；
第六个引物组合物单元中：一条特异性 引物的序列为Tag11序列-CCCACTATCATTGATTATTTCCG，另一条特异性引物的序列为Tag12序列-CCACTATCATTGATTATTGCCCA，共用引物的序列为GCAATCAATAAAGTCCCGAGG；
第七个引物组合物单元中：一条特异性 引物的序列为Tag13序列-GATTGTAAGCACCCCCAGG，另一条特异性引物的序列为Tag14序列-AGGATTGTAAGCACCCCATGA，共用引物的序列为CACCCCATGGCTGTCTAGG；
第八个引物组合物单元中：一条特异性 引物的序列为Tag15序列-ACTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAGC，另一条特异性引物的序列为Tag16序列-TTTGTGTCTTCGGTTCTCAAAGT，共用引物的序列为ACACGTGAAGGCAGGAATTG；
第九个引物组合物单元中：一条特异性 引物的序列为Tag17序列-CCTCCCTCCTTCTCCATTTAC，另一条特异性引物的序列为Tag18序列-CCTCCCTCCTTCTCCATGGAT，共用引物的序列为TTCAGCTCTGTCCGATCTGG；
Tag1探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag1序列；
Tag2探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag2序列；
Tag3探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag3序列；
Tag4探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag4序列；
Tag5探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag5序列；
Tag6探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag6序列；
Tag7探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag7序列；
Tag8探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag8序列；
Tag9探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag9序列；
Tag10探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag10序列；
Tag11探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag11序列；
Tag12探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag12序列；
Tag13探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag13序列；
Tag14探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag14序列；
Tag15探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag15序列；
Tag16探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag16序列；
Tag17探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag17序列；
Tag18探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag18序列；
所述Tag1序列至所述Tag18序列依次如序列表的序列1至序列表的序列18所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述共用引物上具有荧光分子、可通过化学发光进行标记检测的分子或可通过固体微粒进行标记检测的分子。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述多态性位点为SNP位点；每个引物组合物单元中，一条特异性引物的3′末端核苷酸与一个SNP位点的野生型核苷酸相同或互补，另一条特异性引物的3′末端核苷酸与该SNP位点的突变型核苷酸相同或互补。
4.一种引物组，由第一个引物组合物单元、第二个引物组合物单元、第三个引物组合物单元、第四个引物组合物单元、第五个引物组合物单元、第六个引物组合物单元、第七个引物组合物单元、第八个引物组合物单元和第九个引物组合物单元组成；每个所述引物组合物单元由两条特异性引物和一条共用引物组成；
第一个引物组 合物单元中 ：一条 特异性引物的 序列为Tag1序 列-CTGAAAAACAACCATTGTCCG，另一条特异性引物为Tag2序列-CTGAAAAACAACCATTTGCCA，共用引物的序列为TCAAGTGGTTCTCGTGCCTC；
第二个引物组 合物单元中 ：一条 特异性引物的 序列为Tag3序 列-GACCTCCCATCCTAGTCCAACA，另一条特异性引物的序列为Tag4序列-GACCTCCCATCCTAGTCCAATG，共用引物的序列为AGGTCTAAGATGAAAAGCAGGGC；
第三个引物组 合物单元中 ：一条 特异性引物的 序列为Tag5序 列-GCACGAGGTCCAGAGATCCA，另一条特异性引物的序列为Tag6序列-TGCACGAGGTCCAGAGATATC，共用引物的序列为CACCCGGTGATGGTAGAGG；
第四个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag7序列-CAGGGTCCGGCCACTC，另一条特异性引物的序列为Tag8序列-CAGGGTCCGGCCACTT，共用引物的序列为GACATTGTGCTCCCAGACGG；
第五个引物组 合物单元中 ：一条 特异性引物的 序列为Tag9序 列-CCCAGAAGACTCAGAGAACCAG，另一条特异性引物的序列为Tag10序列-GCCCAGAAGACTCAGAGACACAA，共用引物的序列为TGAACTACTGGGCTAAGGGGAC；
第六个引物组合物单元中：一条特异性 引物的序列为Tag11序列-CCCACTATCATTGATTATTTCCG，另一条特异性引物的序列为Tag12序列-CCACTATCATTGATTATTGCCCA，共用引物的序列为GCAATCAATAAAGTCCCGAGG；
第七个引物组合物单元中：一条特异性 引物的序列为Tag13序列-GATTGTAAGCACCCCCAGG，另一条特异性引物的序列为Tag14序列-AGGATTGTAAGCACCCCATGA，共用引物的序列为CACCCCATGGCTGTCTAGG；
第八个引物组合物单元中：一条特异性 引物的序列为Tag15序列-ACTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAGC，另一条特异性引物的序列为Tag16序列-TTTGTGTCTTCGGTTCTCAAAGT，共用引物的序列为ACACGTGAAGGCAGGAATTG；
第九个引物组合物单元中：一条特异性 引物的序列为Tag17序列-CCTCCCTCCTTCTCCATTTAC，另一条特异性引物的序列为Tag18序列-CCTCCCTCCTTCTCCATGGAT，共用引物的序列为TTCAGCTCTGTCCGATCTGG；
所述Tag1序列至所述Tag18序列依次如序列表的序列1至序列表的序列18所示。
Tag1探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag1序列；
Tag2探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag2序列；
Tag3探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag3序列；
Tag4探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag4序列；
Tag5探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag5序列；
Tag6探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag6序列；
Tag7探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag7序列；
Tag8探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag8序列；
Tag9探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag9序列；
Tag10探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag10序列；
Tag11探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag11序列；
Tag12探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag12序列；
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Tag15探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag15序列；
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Tag17探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag17序列；
Tag18探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag18序列；
所述芯片还包括一种引物组，由第一个引物组合物单元、第二个引物组合物单元、第三个引物组合物单元、第四个引物组合物单元、第五个引物组合物单元、第六个引物组合物单元、第七个引物组合物单元、第八个引物组合物单元和第九个引物组合物单元组成；每个所述引物组合物单元由两条特异性引物和一条共用引物组成；
第一个引物组 合物单元中 ：一条 特异性引物的 序列为Tag1序 列-CTGAAAAACAACCATTGTCCG，另一条特异性引物为Tag2序列-CTGAAAAACAACCATTTGCCA，共用引物的序列为TCAAGTGGTTCTCGTGCCTC；
第二个引物组 合物单元中 ：一条 特异性引物的 序列为Tag3序 列-GACCTCCCATCCTAGTCCAACA，另一条特异性引物的序列为Tag4序列-GACCTCCCATCCTAGTCCAATG，共用引物的序列为AGGTCTAAGATGAAAAGCAGGGC；
第三个引物组 合物单元中 ：一条 特异性引物的 序列为Tag5序 列-GCACGAGGTCCAGAGATCCA，另一条特异性引物的序列为Tag6序列-TGCACGAGGTCCAGAGATATC，共用引物的序列为CACCCGGTGATGGTAGAGG；
第四个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag7序列-CAGGGTCCGGCCACTC，另一条特异性引物的序列为Tag8序列-CAGGGTCCGGCCACTT，共用引物的序列为GACATTGTGCTCCCAGACGG；
第五个引物组 合物单元中 ：一条 特异性引物的 序列为Tag9序 列-CCCAGAAGACTCAGAGAACCAG，另一条特异性引物的序列为Tag10序列-GCCCAGAAGACTCAGAGACACAA，共用引物的序列为TGAACTACTGGGCTAAGGGGAC；
第六个引物组合物单元中：一条特异性 引物的序列为Tag11序列-CCCACTATCATTGATTATTTCCG，另一条特异性引物的序列为Tag12序列-CCACTATCATTGATTATTGCCCA，共用引物的序列为GCAATCAATAAAGTCCCGAGG；
第七个引物组合物单元中：一条特异性 引物的序列为Tag13序列-GATTGTAAGCACCCCCAGG，另一条特异性引物的序列为Tag14序列-AGGATTGTAAGCACCCCATGA，共用引物的序列为CACCCCATGGCTGTCTAGG；
第八个引物组合物单元中：一条特异性 引物的序列为Tag15序列-ACTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAGC，另一条特异性引物的序列为Tag16序列-TTTGTGTCTTCGGTTCTCAAAGT，共用引物的序列为ACACGTGAAGGCAGGAATTG；
第九个引物组合物单元中：一条特异性 引物的序列为Tag17序列-CCTCCCTCCTTCTCCATTTAC，另一条特异性引物的序列为Tag18序列-CCTCCCTCCTTCTCCATGGAT，共用引物的序列为TTCAGCTCTGTCCGATCTGG；
所述Tag1序列至所述Tag18序列依次如序列表的序列1至序列表的序列18所示。
用于检测华法林与氯吡格雷个体化用药相关基因的多态性的
试剂盒及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于检测华法林与氯吡格雷个体化用药相关基因的多态性的试剂盒及其应用。
背景技术
[0002] 华法林是一种香豆素类口服抗凝药，上世纪40年代由美国Wisconsin大学合成。目前华法林被广泛用于预防和治疗静脉血栓、肺栓塞、慢性心房纤维颤动、心肌梗塞、缺血性休克等多种血栓性疾病和人工心脏瓣膜植入手术，它的抗凝效果超过了目前批准的其它口服类抗凝药。但由于华法林治疗指数窄，剂量个体差异大以及有出血危险，使得它位居严重药物不良反应药物的前十名。随着药物遗传学的研究进展，国内外学者发现遗传因素是影响华法林用量个体差异的主要原因[Copper GM,Johnson JA,et al.2008.A genome-wide scan for common genetic variants with a large influence on warfarin maintenance dose.Blood.112(4):1022-7.]。
[0003] 维生素K环氧化物还原酶复合体(VKOR)是维生素K循环中的关键酶，华法林是该酶的特异性抑制剂，VKOR主要由VKORC1(维生素K环氧化物还原酶复合体1)基因编码。VKOR能够催化环氧化的维生素K生成还原性维生素K，还原性维生素K是γ谷氨酰基羧化酶(γ-glutamyl carboxylase,GGCX)的必要辅助因子。含有谷氨酸残基的维生素K依赖性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、蛋白质C和蛋白质S必需经过GGCX的羧化作用才具有活性，进而发生一系列级联反应引起血液凝固。华法林能够抑制VKOR的催化反应，进而影响有活性的凝血因子形成，最终阻止血液凝固。华法林经口服后大部分与血浆白蛋白结合，只有少量游离华法林被肝脏吸收发挥生物学活性后被CYP2C9酶代谢。
[0004] 华法林是由S-对映体和R-对映体组成的消旋混合物，两种对应体被不同的细胞色素P450酶催化，其中，R-对映体是由CYP1A1、CYP1A2和CYP3A4酶代谢[Yin T,MiyataT.2007.Warfarin dose and the pharmacogenomics of CYP2C9and VKORC1-rationaleand perspectives.Thrombosis research.120(1):1-10.]。S-华法林拮抗维生素K的能力是R-华法林的5倍。在稳定状态下，S-华法林能够发挥60％-70％的抗凝作用，并主要经CYP2C9酶代谢[Takahashi H,Echizen H.2001.Pharmacogenetics of warfarin elimination and its clinical implications.Clinical Pharmacokinetics.40(8):
587-603.]。
[0005] 大量的研究和GWAS数据显示，VKORC1和CYP2C9基因多态性影响着个体对于华法林剂量的需求[Klein TE,Altman RB,et al.2009.Estimation of the warfarin dosewith clinical and pharmacogenetic data.The New England journal of medicine.361(16):1613.]。VKORC1基因目前主要的研究位点有：1639A>G(rs9923231)和1173T>C(rs9934438)。其中，VKORC1-1639A>G位于基因启动子区，而1173C>T位于内含子1区。VKORC1基因启动子区1639A>G有三种基因型：AA型、AG型与GG型。Yuan等研究发现，三种基因型中GG和AG基因型启动子活性较高，可能导致高水平的VKORC1mRNA及蛋白表达，VKORC1蛋白是华法林作用靶位点，因此GG和AG这两种基因型需要较大剂量华法林来抑制VKORC1蛋白[Yuan HY,Chen JJ,et al.2005.A novel functional VKORC1promoter polymorphism is associated with inter-individual and inter-ethnic differences in warfarin sensitivity.Human molecular genetics.14(13):1745-51.]。由于1639A>G(rs9923231)和1173T>C基因多态性增加了对华法林的敏感性，因此降低了对华法林的需求剂量。
[0006] CYP2C9基因具有遗传多态性，已知的CYP2C9的基因多态性超过30种(http://www.cypalleles.ki.se/cyp2c9.htm)。其中CYP2C9*1为野生型，此外，最常见的两种突变体为CYP2C9*2(rs1799853)、CYP2C9*3(rs1057910)。CYP2C9*2(rs1799853)突变体是多肽链第144位氨基酸由Arg突变为Cys，导致该处的一个限制性内切酶AvaⅡ位点丢失，而CYP2C9*3(rs1057910)突变体是多肽链第359位氨基酸由Ile突变为Leu，导致该处的一个限制性内切酶NsiⅠ位点的丢失。体外研究发现，CYP2C9*2和CYP2C9*3分别影响S-华法林代谢的30-40％和80-90％。目前研究显示，在中国人群中尚未发现CYP2C9*2(rs1799853)纯合突变[Takahashi H,Echizen H.2001.Pharmacogenetics of warfarin elimination and its clinical implications.Clinical Pharmacokinetics.40(8):587-603.]。此外，CYP4F2(rs2108622)多态性能够影响1％-2％的华法林个体差异代谢[Caldwell MD,Awad T,Johnson JA.2008.CYP4F2genetic variant alters required warfarin dose.Blood.111(8):4106-12.]。另有研究表明GGCX(rs12714145)多态性与华法林个体差异剂量相关[Chen LY,Eriksson N,Gwilliam R,Bentley D,Deloukas P,Wadelius M.2005.Gamma-glutamyl carboxylase(GGCX)microsatellite and warfarin dosing.Blood.106(10):3673-4.]。
[0007] 氯吡格雷，属于噻吩吡啶类抗血小板药物，目前被广泛应用于急性冠状动脉综合征(ACS)和经皮冠状动脉介入治疗(PCI)的抗栓治疗。治疗目的有防治心肌梗死，缺血性脑血栓，闭塞性脉管炎和动脉粥样硬化及血栓栓塞引起的并发症。氯吡格雷本身不具有生物学活性，是一种药物前体，原型药物约85％通过酯酶水解为无活性羧酸衍生物，大约15％通过肝细胞色素P450酶代谢为2-氧-氯吡格雷，并进一步被氧化为活性代谢物-氯吡格雷的硫醇衍生物，活性代谢产物不可逆地与血小板膜表面分布的P2Y1和P2Y12两种ADP受体相结合，与P2Y12受体结合的作用更为显著，可使P2Y12受体失活，减少血小板膜ADP的结合位点，阻断ADP对腺苷环化酶的抑制作用，促进cAMP依赖的舒血管物质磷酸蛋白的磷酸化，抑制纤维蛋白原与血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受体结合及继发的ADP介导的糖蛋白GPⅡb/Ⅲa复合物的活化，进而抑制血小板聚集。
[0008] 临床上将病人在常规氯吡格雷剂量治疗过程中仍然发生血栓的事件称为氯吡格雷抵抗。研究显示，氯吡格雷抵抗发生率在4％-31％之间[Nguyen TA,Diodati JG,Pharand C.2005.Resistance to clopidogrel:a review of the evidence.Journal of the American College of Cardiology.45(8):1157-64.]。CYP2C19是一种重要的催化氯吡格雷生成活性代谢产物的酶，CYP2C19基因多态性被认为是氯吡格雷反应个体差异性的重要决定因素，是氯吡格雷抵抗的可能机制之一。其中，研究最为广泛的为CYP2C19*2型，即位于第五个外显子681G>A(rs4244285)，和CYP2C19*3型，位于第四个外显子636G>A(rs4986893)，这两种突变使得酶的活性完全丧失从而发生氯吡格雷抵抗。除此之外，CYP2C19*17(rs12248560)型和CYP3A4(rs2242480)也是引起氯吡格雷反应个体差异的重要因素[Johnson JA,Cavallari LH,Beitelshees AL,Lewis JP,Shuldiner AR,Roden DM.2011.Pharmacogenomics:application to the management of cardiovascular disease.Clinical pharmacology and therapeutics.90(4):519-31.]。
[0009] 目前，华法林与氯吡格雷两种药物在心血管疾病治疗方面被广泛的使用来用于抗凝治疗。美国食品药品监督局(FDA)明确标注了在服用华法林与氯吡格雷两种药物前要注意遗传信息，人的遗传差异可能影响对该药物的反应。临床上也提出在服用两种药物前要进行基因型检测的强烈需求。此外，由于两种药的抗凝机制不同，在临床上也可能涉及到两种药的联合使用或相互替代使用。而目前，国内尚无产品能够同时对两种药物相关的耐药基因型进行检测。因此，有必要研发出一个可以同时检测华法林与氯吡格雷两种药物耐药基因型的产品。
发明内容
[0010] 本发明的目的是提供一种用于检测华法林与氯吡格雷个体化用药相关基因的多态性的试剂盒及其应用。
[0011] 本发明提供了一种用于检测华法林耐药性相关基因的多态性和氯吡格雷耐药性相关基因的多态性的试剂盒，包括通用芯片、用于鉴别华法林耐药性相关基因的多态性的引物组合物甲和用于鉴别氯吡格雷耐药性相关基因的多态性的引物组合物乙；
[0012] 所述引物组合物甲包括一个以上引物组合物单元，每个引物组合物单元用于鉴别华法林耐药性相关基因的一个多态性位点；所述引物组合物乙包括一个以上引物组合物单元，每个引物组合物单元用于鉴别氯吡格雷耐药性相关基因的一个多态性位点；
[0013] 每个所述引物组合物单元由两条特异性引物和一条共用引物组成，其中一条特异性引物和所述共用引物的组合用于扩增野生型基因，另一条特异性引物和所述共用引物的组合用于扩增突变型基因；
[0014] 所述特异性引物由Tag序列和靶序列区段组成；所有所述特异性引物的5′末端具有不同的Tag序列；所有所述Tag序列两两之间的Tm值之差均小于等于5℃；所有所述Tag序列之间、所有所述Tag序列与所有特异性引物的靶序列区段之间没有交叉杂交且无发夹结构；所有所述Tag序列与含有所述基因的物种的基因组的同源性较低；所述同源性较低是指连续匹配或相同的核苷酸数小于10个；
[0015] 所述通用芯片上设有与所述Tag序列一一对应的Tag探针，每条Tag探针上具有与其相对应的Tag序列。
[0016] 所述共用引物上具有荧光分子、可通过化学发光进行标记检测的分子或可通过固体微粒进行标记检测的分子。具体来说，所述共用引物的5’末端具有荧光染料TAMRA。
[0017] 所述多态性位点为SNP(单核苷酸多态性)位点；每个引物组合物单元中，一条特异性引物的3′末端核苷酸与一个SNP位点的野生型核苷酸相同或互补，另一条特异性引物的3′末端核苷酸与该SNP位点的突变型核苷酸相同或互补。
[0018] 所述特异性引物中可引入人工错配核苷酸；所述人工错配核苷酸是天然的A、T、C、G或其类似物。
[0019] 所述Tag序列为单链寡核苷酸或肽核酸。
[0020] 所述引物组合物甲由如下引物组合物单元组成：第一个引物组合物单元、第二个引物组合物单元、第三个引物组合物单元、第四个引物组合物单元和第五个引物组合物单元中的至少一个。所述引物组合物乙由如下引物组合物单元组成：第六个引物组合物单元、第七个引物组合物单元、第八个引物组合物单元和第九个引物组合物单元中的至少一个。
[0021] 第一个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag1序列-CTGAAAAACAACCATTGTCCG，另一条特异性引物为Tag2序列-CTGAAAAACAACCATTTGCCA，共用引物的序列为TCAAGTGGTTCTCGTGCCTC；
[0022] 第二个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag3序列-GACCTCCCATCCTAGTCCAACA，另一条特异性引物的序列为Tag4序列-
GACCTCCCATCCTAGTCCAATG，共用引物的序列为AGGTCTAAGATGAAAAGCAGGGC；
[0023] 第三个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag5序列-GCACGAGGTCCAGAGATCCA，另一条特异性引物的序列为Tag6序列-TGCACGAGGTCCAGAGATATC，共用引物的序列为CACCCGGTGATGGTAGAGG；
[0024] 第四个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag7序列-CAGGGTCCGGCCACTC，另一条特异性引物的序列为Tag8序列-CAGGGTCCGGCCACTT，共用引物的序列为GACATTGTGCTCCCAGACGG；
[0025] 第五个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag9序列-CCCAGAAGACTCAGAGAACCAG，另一条特异性引物的序列为Tag10序列-
GCCCAGAAGACTCAGAGACACAA，共用引物的序列为TGAACTACTGGGCTAAGGGGAC；
[0026] 第六个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag11序列-CCCACTATCATTGATTATTTCCG，另一条特异性引物的序列为Tag12序列-
CCACTATCATTGATTATTGCCCA，共用引物的序列为GCAATCAATAAAGTCCCGAGG；
[0027] 第七个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag13序列-GATTGTAAGCACCCCCAGG，另一条特异性引物的序列为Tag14序列-AGGATTGTAAGCACCCCATGA，共用引物的序列为CACCCCATGGCTGTCTAGG；
[0028] 第八个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag15序列-ACTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAGC，另一条特异性引物的序列为Tag16序列-
TTTGTGTCTTCGGTTCTCAAAGT，共用引物的序列为ACACGTGAAGGCAGGAATTG；
[0029] 第九个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag17序列-CCTCCCTCCTTCTCCATTTAC，另一条特异性引物的序列为Tag18序列-
CCTCCCTCCTTCTCCATGGAT，共用引物的序列为TTCAGCTCTGTCCGATCTGG。
[0030] 以上序列均为5′→3′方向。
[0031] 所述引物组合物甲具体可由所述第一个引物组合物单元、所述第二个引物组合物单元、所述第三个引物组合物单元、所述第四个引物组合物单元和所述第五个引物组合物单元组成。所述第一个引物组合物单元、所述第二个引物组合物单元、所述第三个引物组合物单元、所述第四个引物组合物单元和所述第五个引物组合物单元可以混合包装。
[0032] 所述引物组合物乙具体可由所述第六个引物组合物单元、所述第七个引物组合物单元、所述第八个引物组合物单元和所述第九个引物组合物单元组成。所述第六个引物组合物单元、所述第七个引物组合物单元、所述第八个引物组合物单元和所述第九个引物组合物单元可以混合包装。
[0033] 具体来说，所述通用芯片上包括如下18个探针：
[0034] Tag1探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag1序列；
[0035] Tag2探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag2序列；
[0036] Tag3探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag3序列；
[0037] Tag4探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag4序列；
[0038] Tag5探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag5序列；
[0039] Tag6探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag6序列；
[0040] Tag7探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag7序列；
[0041] Tag8探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag8序列；
[0042] Tag9探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag9序列；
[0043] Tag10探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag10序列；
[0044] Tag11探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag11序列；
[0045] Tag12探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag12序列；
[0046] Tag13探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag13序列；
[0047] Tag14探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag14序列；
[0048] Tag15探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag15序列；
[0049] Tag16探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag16序列；
[0050] Tag17探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag17序列；
[0051] Tag18探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag18序列。
[0052] 所述Tag1序列至所述Tag18序列依次如序列表的序列1至序列表的序列18所示。
[0053] 以上序列均为5′→3′方向。
[0054] 所述通用芯片上还可包括QC(表面化学质控探针)、PC(杂交质控探针)、NC(阴性对照探针)和IC(基因扩增内对照探针)。
[0055] 所述芯片的载体可为硅片、用各种功能基团修饰的玻片或用各种功能基团衍生的膜，优选为带有醛基基团的玻片。
[0056] 所述试剂盒还可包括进行PCR反应和分子杂交的反应液。
[0057] 应用所述试剂盒的方法如下：以待测样品的基因组DNA为模板，采用9个引物组合物单元和不具有3′→5′外切核酸酶活性的DNA聚合酶，进行多重PCR扩增，将得到的多重PCR扩增产物与通用芯片杂交，根据杂交结果确定是哪种基因。所述多重PCR扩增可在一管中进行，也可分为多管进行多管多重PCR反应。具体可以分别采用所述引物组合物甲和所述引物组合物乙进行多重PCR扩增。
[0058] 本发明还保护一种引物组，由第一个引物组合物单元、第二个引物组合物单元、第三个引物组合物单元、第四个引物组合物单元、第五个引物组合物单元、第六个引物组合物单元、第七个引物组合物单元、第八个引物组合物单元和第九个引物组合物单元中的至少一个引物组合物单元组成；每个所述引物组合物单元由两条特异性引物和一条共用引物组成；
[0059] 第一个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag1序列-CTGAAAAACAACCATTGTCCG，另一条特异性引物为Tag2序列-CTGAAAAACAACCATTTGCCA，共用引物的序列为TCAAGTGGTTCTCGTGCCTC；
[0060] 第二个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag3序列-GACCTCCCATCCTAGTCCAACA，另一条特异性引物的序列为Tag4序列-
GACCTCCCATCCTAGTCCAATG，共用引物的序列为AGGTCTAAGATGAAAAGCAGGGC；
[0061] 第三个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag5序列-GCACGAGGTCCAGAGATCCA，另一条特异性引物的序列为Tag6序列-TGCACGAGGTCCAGAGATATC，共用引物的序列为CACCCGGTGATGGTAGAGG；
[0062] 第四个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag7序列-CAGGGTCCGGCCACTC，另一条特异性引物的序列为Tag8序列-CAGGGTCCGGCCACTT，共用引物的序列为GACATTGTGCTCCCAGACGG；
[0063] 第五个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag9序列-CCCAGAAGACTCAGAGAACCAG，另一条特异性引物的序列为Tag10序列-
GCCCAGAAGACTCAGAGACACAA，共用引物的序列为TGAACTACTGGGCTAAGGGGAC；
[0064] 第六个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag11序列-CCCACTATCATTGATTATTTCCG，另一条特异性引物的序列为Tag12序列-
CCACTATCATTGATTATTGCCCA，共用引物的序列为GCAATCAATAAAGTCCCGAGG；
[0065] 第七个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag13序列-GATTGTAAGCACCCCCAGG，另一条特异性引物的序列为Tag14序列-AGGATTGTAAGCACCCCATGA，共用引物的序列为CACCCCATGGCTGTCTAGG；
[0066] 第八个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag15序列-ACTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAGC，另一条特异性引物的序列为Tag16序列-
TTTGTGTCTTCGGTTCTCAAAGT，共用引物的序列为ACACGTGAAGGCAGGAATTG；
[0067] 第九个引物组合物单元中：一条特异性引物的序列为Tag17序列-CCTCCCTCCTTCTCCATTTAC，另一条特异性引物的序列为Tag18序列-
CCTCCCTCCTTCTCCATGGAT，共用引物的序列为TTCAGCTCTGTCCGATCTGG。
[0068] 以上序列均为5′→3′方向。
[0069] 所有Tag序列两两之间的Tm值之差均小于等于5℃；所有述Tag序列之间没有交叉杂交且无发夹结构。
[0070] 所述Tag1序列至所述Tag18序列依次如序列表的序列1至序列表的序列18所示。
[0071] 所述第一个引物组合物单元、所述第二个引物组合物单元、所述第三个引物组合物单元、所述第四个引物组合物单元和所述第五个引物组合物单元可以混合包装，形成引物组合物甲。
[0072] 所述第六个引物组合物单元、所述第七个引物组合物单元、所述第八个引物组合物单元和所述第九个引物组合物单元可以混合包装，形成引物组合物乙。
[0073] 本发明还保护一种芯片，包括如下18个探针：
[0074] Tag1探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag1序列；
[0075] Tag2探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag2序列；
[0076] Tag3探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag3序列；
[0077] Tag4探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag4序列；
[0078] Tag5探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag5序列；
[0079] Tag6探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag6序列；
[0080] Tag7探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag7序列；
[0081] Tag8探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag8序列；
[0082] Tag9探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag9序列；
[0083] Tag10探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag10序列；
[0084] Tag11探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag11序列；
[0085] Tag12探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag12序列；
[0086] Tag13探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag13序列；
[0087] Tag14探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag14序列；
[0088] Tag15探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag15序列；
[0089] Tag16探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag16序列；
[0090] Tag17探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag17序列；
[0091] Tag18探针的序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag18序列。
[0092] 以上序列均为5′→3′方向。
[0093] 所有Tag序列两两之间的Tm值之差均小于等于5℃；所有述Tag序列之间没有交叉杂交且无发夹结构。
[0094] 所述Tag1序列至所述Tag18序列依次如序列表的序列1至序列表的序列18所示。
[0095] 本发明还保护以上任一所述的试剂盒或所述引物组或所述芯片在用于检测华法林耐药性相关基因的多态性和氯吡格雷耐药性相关基因的多态性中的应用。
[0096] 以上任一所述的华法林耐药性相关基因的多态性位点可为SNP位点，具体可为rs9923231、rs9934438、rs1057910、rs2108622和rs12714145中的至少一种。
[0097] 以上任一所述的氯吡格雷耐药性相关基因的多态性位为SNP位点，具体可为rs4244285、rs4986893、rs12248560和rs2242480中的至少一种。
[0098] 所述Tag序列具体可以通过生物信息学的方法人工设计20－24bp序列，或者取自不同于含有所述目的基因的物种的基因组DNA序列，如目的基因来源于人，可取自细菌等其它物种的基因组DNA序列，如结核分支杆菌等。
[0099] 为提高检测的特异性，基因特异性引物中引入人工错配碱基，所述人工错配碱基是天然的A、T、C、G四种碱基或其类似物。当这种新引入的人工突变遇到引物中原有的天然的碱基突变时将产生协同作用，使得引物和目的基因序列的结合更加不稳定，而当引物中仅有人工突变时则可以和目的基因序列结合，这样使得匹配引物(仅有人工突变的引物)的扩增产量与不匹配引物(既有人工突变，又有天然突变的引物)的扩增产量差异变大，从而特异的区分靶分子中的单碱基差异。
[0100] 使用多重不对称PCR扩增获得用于杂交的靶标，为了提高单链PCR产物的量，每个位点的荧光标记的共用引物与特异性引物的量比例为10-25：1，共用引物浓度高于特异性引物，从而通过引物浓度的差异获得大量的单链产物，用于杂交。所述共用引物序列与所述特异性引物的Tm值之差小于等于5℃，无发夹结构和二聚体形成，与含有所述目的基因的物种的基因组同源性较低(连续匹配或相同的碱基数小于10个)，与所有的Tag序列无交叉杂交。
[0101] 单核苷酸多态性是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，变异可由单个碱基的转换或颠换所引起，单核苷酸多态性具有数量多，可遗传，多态性丰富等特点。
[0102] 上述方法可以结合微型全分析系统制成自动化检测装置。
[0103] 本发明将多重基因特异性PCR技术与通用芯片技术相结合，建立了一种高通量、低成本、易于操作的基因序列分析方法，其反应原理如图1所示：首先，在反应管中用引物组合物(包括特异性引物和共用引物)进行多重基因特异性PCR反应，然后把PCR产物与通用芯片进行杂交反应，最后通过芯片扫描进行结果检测。
[0104] 本发明中的多重基因特异性PCR不同于一般意义上的简单多重PCR。首先，其特异性引物的3′末端碱基有两种形式，一种是末端碱基和待检测的多态性位点的野生型核苷酸匹配，一种是末端碱基和待检测的多态性位点的突变型核苷酸匹配，二者相互对照，这增加了反应的特异性和准确性；其次，在引物的末端或者连接Tag标签序列用于对待检测的多态性位点进行编码，或者连接有标记分子用于最终的检测；另外，为了增强反应的特异性可以在引物序列中引入人工突变点，为了提高检测敏感性可以在共用引物序列末端引入通用引物，在PCR体系中加入荧光标记的通用引物(与共用引物末端的通用引物序列相同)，待前两轮PCR反应结束后，产生通用引物的互补序列，荧光标记的通用引物与之结合继续扩增，增加了PCR产物中单链DNA产量，从而增强杂交信号。
[0105] 本发明中的通用芯片也不同于一般意义上的固定有序列特异性探针的基因芯片，在普通芯片上固定的探针是针对基因的特定位点进行检测的基因片段，检测不同的目标基因需要设计不同的探针，制备不同的芯片。而本发明中所指的通用芯片是一种用来对预先筛选出的一套序列特异性基因片段(Tag序列)进行识别的基因芯片，芯片上固定的探针不是针对特定的基因序列，而是针对特定的Tag序列。Tag序列可以用来对不同的基因位点、对不同基因的不同位点、对不同物种的不同基因位点进行编码(相当于一个条码)，对于不同的检测目的可以用相同的一套Tag序列，这样对于不同检测目的，只要在芯片上固定一套可以识别这套Tag序列的基因片段就可完成检测任务。因此该通用芯片是一种真正意义上的“通用”芯片，尽管检测目的不同，但都可以用同样的一张芯片来进行检测，检测过程是一个对编码在不同基因位点上的Tag序列进行解码的过程。这种芯片是与普通意义上的核酸序列特异性基因芯片完全不同的一种方便实用的生物芯片。
[0106] 本发明的试剂盒可以同时检测华法林耐药性相关基因的多态性和氯吡格雷耐药性相关基因的多态性，具有集成化程度高、灵敏度高、应用范围广、特异性高、检测结果稳定、可靠性高、使用方法快速简便、可操作性强、易于实现自动化等优点，有助于指导个性化用药，可用于基因突变检测、基因多态性分析等方面，适用于临床疾病突变检测、药物基因组学分析、法医学鉴定等基因分析领域。
附图说明
[0107] 图1为本发明方法的反应原理示意图。
[0108] 图2为通用芯片点阵排布示意图。
[0109] 图3为用荧光标记的通用芯片检测结果。
具体实施方式
[0110] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0111] 实施例1、用本发明提供的通用芯片和方法检测病例样品的华法林和氯吡格雷个体化用药相关基因的SNP分型
[0112] 1、临床样品的获得及其DNA的提取
[0113] 已知心血管疾病个体化用药相关基因突变分型的病例样品(全血，已测序验证相关基因的突变分型)由中国医学科学院阜外心血管病医院血栓学与心血管研究室科提供。使用 Genomic DNA Purification Kit(Promega,Madison,USA)提取全血中的基因组DNA。
[0114] 2、制备引物和探针
[0115] 检测六个目的基因共9个SNP位点的多重PCR引物及探针见表1。
[0116] (1)引物
[0117] 表1的“突变形式”一列中，“＞”表示SNP位点单个核苷酸的变异，如“1639A＞G”表示与华法林个体化用药相关的VKORC1基因的GenBank SNP Number为rs9923231的SNP位点碱基由A变异为G。
[0118] 表1的“引物名称”一列中，后缀为WT的引物代表扩增包括SNP位点在内的野生型基因的特异性引物，引物名称中后缀为MU的引物代表扩增包括SNP位点在内的突变型基因的特异性引物，引物名称中后缀为C的引物代表扩增包括该SNP位点在内的野生型和突变型基因片段的共用引物，每个SNP位点的两种基因的特异性引物分别与该SNP位点的共用引物配对，如1639A＞G-WT和1639A＞G-C配对，1639A＞G-MU和1639A＞G-C配对。
[0119] 表1的“引物序列”一列中，Tag1序列至Tag18序列依次为序列表中的序列1至序列18所示的单链DNA片段；共用引物的5′末端有荧光染料TAMRA修饰。为提高检测的特异性，部分特异性引物中引入人工错配碱基(用下划线示)。
[0120] 特异性引物1639A>G-WT、1075A>C-WT、rs2108622C>T-WT、3261G>A-WT、681G>A-WT、636G>A-WT、806C>T-WT和894C>T-WT的3′末端碱基(粗体示)与目的基因SNP位点的野生型碱基相同，特异性引物1639A>G-MU、1075A>C-MU、rs2108622C>T-MU、3261G>A-MU、681G>A-MU、
636G>A-MU、806C>T-MU和894C>T-MU的3′末端碱基(粗体示)与目的基因SNP位点的突变型碱基相同，特异性引物1173T>C-WT的3′末端碱基(粗体示)与目的基因SNP位点的野生型碱基互补，特异性引物1173T>C-MU的3′末端碱基(粗体示)与目的基因SNP位点的突变型碱基互补。
[0121] (2)通用芯片和探针
[0122] 通用芯片是由与多重PCR产物杂交的18种Tag探针、QC(表面化学质控探针)、BC(空白对照探针)、PC(杂交质控探针)、NC(阴性对照探针)和IC(基因扩增内对照探针)组成的阵列。
[0123] 通用芯片上的Tag探针序列结构通式为：NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-TagX序列，其中X为1至18中的任何一个自然数。如Tag1探针的序列结构为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag1序列，Tag18探针的序列结构为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tag18序列。即探针的5′末端为氨基修饰，氨基下游连接poly-T15，然后是Tag1序列、Tag2序列、Tag3序列、Tag4序列、Tag5序列、Tag6序列、Tag7序列、Tag8序列、Tag9序列、Tag10序列、Tag11序列、Tag12序列、Tag13序列、Tag14序列、Tag15序列、Tag16序列、Tag17序列或Tag18序列(Tag1序列至Tag18序列依次为序列表中的序列1至序列18所示的单链DNA片段)。
[0124] QC是一端带有Hex标记，另一端具有氨基修饰的寡核苷酸探针，探针序列的5′端连接有15个T，用于观察芯片点样和固定的效率，其核苷酸序列如序列表的序列19所示。BC为基因点样液，点于QC之后，用于质控点样过程中有无样品残留污染。PC是一段氨基修饰的寡核苷酸探针，探针序列的5′端连接有15个T，可以与杂交液中添加的荧光标记的互补序列(c-PC)杂交，用于杂交过程的质控，其核苷酸序列如序列表的序列20所示。NC是一段氨基修饰的寡核苷酸探针，探针序列的5′端连接有15个T，与杂交液中的所有待检测序列不会杂交，用于观察有无非特异杂交，其核苷酸序列如序列表的序列21所示。IC是一段氨基修饰的寡核苷酸探针，探针序列的5′端连接有15个T，与多重PCR扩增产物进行杂交，用于多重PCR扩增过程的质控，其核苷酸序列如序列表的序列22所示。
[0125] 表1检测的突变位点、引物及Tag序列
[0126]
[0127]
[0128] 所有的引物与探针由上海生工公司(Sangon,Shanghai,China)合成与纯化。
[0129] 将探针固定到醛基化修饰的玻片上。所有的Tag探针用基因点样液(Capitalbio，Beijing,China)溶解，终浓度为15μM，每个点重复三次点制到玻片上。图2为通用芯片的点阵排布示意图，其中包括检测VKORC1基因上的1639A>G、1173T>C SNP位点的Tag1至Tag4探针，检测CYP2C9基因上的1075A>C SNP位点的Tag5、Tag6探针，检测CYP4F2基因上的rs2108622C>T SNP位点的Tag7、Tag8探针，检测GGCX基因上的3261G>A SNP位点的Tag9、Tag10探针，检测CYP2C19基因上的681G>A、636G>A、806C>T SNP位点的Tag11至Tag16探针，检测CYP3A4基因上的894C>T SNP位点的Tag17、Tag18探针。图2中，W1W即1639W、代表Tag1探针，W1M即1639M、代表Tag2探针，W2W即1173W、代表Tag3探针，W2M即1173M、代表Tag4探针，W3W即1075W、代表Tag5探针，W3M即1075M、代表Tag6探针，W4W即rs2108622W、代表Tag7探针，W4M即rs2108622M、代表Tag8探针，W5W即3261W、代表Tag9探针，W5M即3261M、代表Tag10探针，C1W即681W、代表Tag11探针，C1M即681M、代表Tag12探针，C2W即636W、代表Tag13探针，C2M即636M、代表Tag14探针，C3W即806W、代表Tag15探针，C3M即806M、代表Tag16探针，C4W即894W、代表Tag17探针，C4M即894M、代表Tag18探针。
[0130] 3、多重不对称基因特异性PCR扩增
[0131] 分别以各个SNP位点多态性样本的全血基因组DNA为模板，进行多重不对称PCR扩增。为防止某些引物间的相互作用，多重PCR在两个离心管中进行。其中，引物1639A>G-WT，1639A>G-MU和1639A>G-C，1173T>C-WT，1173T>C-MU和1173T>C-C，1075A>C-WT，1075A>C-MU和1075A>C-C，rs2108622C>T-WT，rs2108622C>T-MU和rs2108622C>T-C，3261G>A-WT，3261G>A-MU和3261G>A-C在同一离心管中进行PCR扩增，表1中除上述五组引物以外的其它四组引物在另一离心管中进行PCR扩增。
[0132] 多重不对称PCR反应体系的组成如下：反应总体积为25μl,包括0.2mM dNTPs,1×Qiagen PCR buffer,添加MgCl2至2mM,pH8.7,1单位HotStarTaq DNA Polymerase(Qiagen,Hilden,Germany)和100ng基因组DNA，各位点的检测引物，其中共用引物的浓度高于基因特异性引物。25μl扩增体系中，采用不同引物时，各引物的浓度如下：1639A>G-WT0.05μM，1639A>G-MU0.05μM，1639A>G-C0.5μM，1173T>C-WT0.03μM，1173T>C-MU0.02μM，1173T>C-C0.45μM，1075A>C-WT0.06μM，1075A>C-MU0.05μM，1075A>C-C0.6μM，rs2108622C>T-WT0.04μM，rs2108622C>T-MU0.03μM，rs2108622C>T-C0.4μM，3261G>A-WT0.03μM，3261G>A-MU0.045μM，3261G>A-C0.5μM，681G>A-WT0.06μM，681G>A-MU0.06μM，681G>A-C0.8μM，636G>A-WT0.015μM，636G>A-MU0.017μM，636G>A-C0.6μM，806C>T-WT0.06μM，806C>T-MU0.06μM，806C>T-C0.6μM，894C>T-WT0.04μM，894C>T-MU0.045μM，894C>T-C0.45μM。
[0133] PCR扩增的扩增参数为：95℃15min；96℃3min；96℃25s、58℃30s、72℃40s，36cycles；72℃6min；4℃保存。
[0134] 4、通用芯片杂交
[0135] 将两个离心管中的PCR扩增产物分别96℃变性5分钟再冰浴2分钟后混合，取10μlPCR混合物加到20μl杂交缓冲液中(6×SSC,5×Denhardt′s reagent,25％甲酰胺,0.1％SDS,5nM c-PC；c-PC为与通用芯片上的PC互补的序列，5′末端标记有荧光染料TAMRA)，然后从PCR产物与杂交缓冲液的混合物中再取出15μl点样到通用芯片上后在50℃水浴中杂交1小时。
[0136] 取出通用芯片，依次在洗液Ⅰ和洗液Ⅱ中洗涤(在每种洗液中42℃洗2min)，然后将通用芯片稍离心甩干。洗液Ⅰ：0.3×SSC/0.1％SDS。洗液Ⅱ：0.06×SSC。
[0137] 为验证通用芯片的特异性，人工合成5′末端标记有荧光染料TAMRA的与Tag1序列至Tag18序列的反向互补的18种DNA分子(依次命名为cTag1序列至cTag18序列)，用杂交缓冲液溶解至5nM，分别与通用芯片进行杂交，杂交与洗片条件同上。
[0138] 5、数据分析
[0139] 使用LuxScanTM10K激光共聚焦扫描仪及其配套软件(Captialbio,Beijing,China)对通用芯片进行扫描，扫描图见图3。检测条件为：波长555nm，Laser power和photomultiplier tube(PMT)power分别为90和600。
[0140] 图3显示的是用图2所示的通用芯片对心血管病人的临床样品进行实际检测的结果。对于已知的野生型样品(WT)基因组DNA(gDNA WT)来说，依次进行PCR扩增和与通用芯片杂交后，通用芯片上的野生型检测探针全部出现杂交信号，而下边的突变型检测探针均没有杂交信号。对于已知的突变型样品(MU)基因组DNA(gDNA-MU)来说，依次进行PCR扩增和与通用芯片杂交后，通用芯片上的野生型检测探针均没有杂交信号，而下边的突变型检测探针全部出现杂交信号。对于已知的杂合型样品(HE)基因组DNA(gDNA-HE)来说，依次进行PCR扩增和与通用芯片杂交后，通用芯片上的野生型检测探针全部出现杂交信号，下边的突变型检测探针也全部出现杂交信号。gDNA1639A>G MU、gDNA1075A>C MU、gDNA2108622C>T MU、gDNA3261G>A MU和gDNA681G>AMU分别为已知与华法林和氯吡格雷个体化用药有关的SNP多态性位点1639A>G MU、1173T>C MU、1075A>C MU、2108622C>T MU、3261G>A MU和681G>A MU的病例样品的基因组DNA，代表了五种突变情况，杂交图中相应的突变检测探针已经给出了相应的正确检测信号。gDNA1173T>C HE、gDNA636G>A HE、gDNA806C>T HE和gDNA894C>THE分别为已知与华法林和氯吡格雷个体化用药有关的SNP多态性位点1173T>C HE、636G>A HE、806C>T HE和894C>T HE的病例样品的基因组DNA，代表了四种杂合情况，杂交图中相应的野生检测探针及突变检测探针已经给出了相应的正确检测信号。由图3结果可知，所有位点检测结果都正确无误，特异性很好。
