用于增殖动脉炎病毒的哺乳动物细胞

摘要

本发明涉及能够增殖动脉炎病毒的哺乳动物细胞，涉及使用动脉炎病毒感染此类细胞，涉及包括此类细胞的细胞培养物，并且涉及在此类细胞中增殖动脉炎病毒的方法。

权利要求

1.能够增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞选自以下的哺乳动物细胞：MA104和Marc145细胞，其特征在于，所述细胞通过包括在合适的启动子控制下编码能够沉默IFN-β编码基因的siRNA的DNA片段而缺乏其IFN-β生产。

2.细胞培养物，其包含根据权利要求1的哺乳动物细胞。

3.根据权利要求2的包含哺乳动物细胞的细胞培养物，其特征在于，所述哺乳动物细胞是由PRRSV感染的。

4.在细胞培养物中增殖PRRSV的方法，其特征在于，所述方法包括在根据权利要求1的哺乳动物细胞中增殖所述病毒的步骤。

说明书

用于增殖动脉炎病毒的哺乳动物细胞

[0001] 本发明涉及能够增殖动脉炎病毒(Artertivirus)的哺乳动物细胞，涉及使用动脉炎病毒感染的此类细胞，涉及包括此类细胞的细胞培养物，并且涉及用于在此类细胞中增殖动脉炎病毒的方法。

[0002] 动脉炎病毒家族包括马动脉炎病毒(EAV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、乳酸脱氢酶增高病毒(LDV)和猴出血热病毒(SHFV)。在这四个病毒物种中，LDV和SHFV只有较小的经济影响，因为它们分别感染小鼠和猴。与之相比，EAV，且特别是PRRSV，对社会造成了相当大的经济负担。

[0003] 马动脉炎病毒导致马的感染，并且因此在马养殖产业中造成复发性问题。因此其对马养殖者造成了显著的经济负担。马动脉炎病毒在所谓的“携带者公马(carrier stallion)”中产生持续的感染，其随后将病毒传播至母马，潜在地导致胎儿的流产。

[0004] 马养殖者小心地监控EAV的出现(特别是在公马中)，并且已经基于活减毒病毒或基于EAV结构亚单位的表达，开发出若干针对所述病毒的疫苗。然而，近期在美国新墨西哥州(2006)和法国(2007)的爆发进一步增加了兽医和马主人对EAV和EAV疫苗的兴趣。

[0005] PRRSV是目前为止经济上最重要的动脉炎病毒，其影响全世界的猪养殖业。感染该病毒导致断奶猪仔至育肥猪的缓慢生长、降低的喂养效率、厌食和发热，妊娠母猪的流产和幼猪的呼吸问题。单在美国，每年与PRRSV感染有关的损失估计在约$5.60亿(2005年)和$6.64亿(2011年)。PRRSV被列为对猪产业的首位健康挑战，与其他疾病，例如，艰难梭菌(Clostridium difficile)、猪流感、链球菌(Streptococcus sp.)、轮状病毒或猪圆环病毒导致的损失时相比，其导致了最大的生产力损失。考虑到2006年PRRSV的高强毒株在东南亚的出现以及亚洲的猪产业是世界最大的事实，可以稳妥地假设世界上在该地区的损失要远远高于在美国报告的那些。

[0006] 尽管针对PRRSV的活减毒疫苗和灭活疫苗均可以获得，因为已证实相关疾病难以控制，PRRSV仍是猪产业的主要威胁。

[0007] 动脉炎病毒家族由具有大小在约13至16kb范围的基因组的正义(+)单链RNA病毒组成。感染时，RNA被翻译为两种复制酶前体多蛋白：pp1a和pp1ab。动脉炎病毒的功能非结构蛋白(nsps)来源于这些多蛋白通过其内在蛋白酶活性的切割。从多蛋白释放后，这些非结构蛋白一同形成复制和转录复合体，其负责病毒基因组的复制和编码结构蛋白的次基因组信使RNA的合成。将原型动脉炎病毒EAV的pp1a和pp1ab多蛋白通过存在于非结构蛋白1 (nsp1)、nsp2和nsp4中的3个内在蛋白酶切割为至少13个非结构蛋白。

[0008] 动脉炎病毒nsp2在其N-端区域含有木瓜样蛋白酶(PLP)结构域。该蛋白酶通常被称为PLP2，其负责切割nsp2和nsp3之间的连接，并且其催化活性(可能因为该原因)对病毒复制是关键的。

[0009] 对于大多数病毒物种，情况如下：当感染时，病毒核酸的存在引发先天免疫信号级联的激活，导致转录因子诸如NF-κβ和Irf3/Irf7的激活，最终导致编码β干扰素(IFN-β)和其它促炎性细胞因子的基因转录。

[0010] 这个所谓的先天免疫提供了宿主针对病毒非常有用的天然防御。然而，同样的先天免疫对疫苗生产者造成了问题。全病毒疫苗的生产一般通过在体外(例如，在细胞培养物中)增殖(野生型或减毒的)病毒，随后收获子代病毒。作为先天免疫的结果，在体外生产的病毒的量通常相当低：INF-β的诱导导致了其他细胞针对病毒入侵(和随后的复制)的保护。

[0011] 对于数种病毒物种，该问题理论上可以通过减少生产的INF-β的量解决。

[0012] 然而，在动脉炎病毒的情况中，由于以下原因该方法被认为没有效果：已知动脉炎病毒非常有效地逃避了宿主的先天免疫应答。动脉炎病毒的这些强大的免疫调节能力防止了针对野生型PRRSV和针对活减毒PRRSV的有效免疫应答的诱导。因此，可以诱导的免疫水平对针对野外感染的保护是次优的。

[0013] 动脉炎病毒的这种免疫逃避特征的原因是已知的。其由动脉炎病毒的nsp2蛋白质导致，除了在多蛋白加工中的作用外，其还在逃避宿主先天免疫应答中具有非常强的作用。

[0014] 比较序列分析显示该蛋白质的PLP2域展现出与属于去泛素化酶(DUB)的含卵巢肿瘤域(OUT)类型的蛋白质的相似性(Makarova (2000))。自此已经确认动脉炎病毒PLP2确实具有真正的DUB活性并且该活性很可能被用于从先天免疫信号因子移除泛素(也进一步称为Ub)，以抑制抗病毒状态的诱导(Frias-Staheli, N. (2007), Sun, Z. (2010), van Kasteren, P.B. (2012))。除了其DUB活性，还显示动脉炎病毒PLP2将泛素样抗病毒蛋白干扰素刺激基因15  (ISG15)从细胞靶蛋白移除(Frias-Staheli, N. (2007)、Sun, Z. (2012), Arguello, M.D.  (2007))。该活性被称为去ISG化活性(deISGylating activity)。由于泛素和ISG15的密切关系，一般将PLP2域的该作用称为DUB/去ISG化活性。

[0015] 正是该DUB/去ISG化活性，通过抑制抗病毒状态的诱导，允许病毒绕开了宿主的第一防御。

[0016] 可以理解地，动脉炎病毒通过阻断INF-β诱导逃避细胞的先天免疫系统的这种特征具有在体外的结果：预期在易感染细胞(诸如通常用于增殖PRRSV的可商购获得的MA104细胞和Marc145细胞)中的体外增殖不受先天免疫系统的影响：病毒本身已经阻断了INF-β的诱导。

[0017] 因此，在动脉炎病毒的情况中，预期以在体外生产更多病毒为目标，减少此类细胞生产的IFN-β的量的措施，对病毒滴度没有任何影响。如上文所述，动脉炎病毒在本质上阻断宿主细胞中的体外INF-β生产，与在宿主体内生长的情况类似。

[0018] 然而，现在令人惊讶地发现，除了动脉炎病毒本身的阻断效果外，故意阻断细胞中的IFN-β生产，导致在这些细胞中增殖的子代动脉炎病毒量的非常显著增加。甚至常常获得高达6-7倍的病毒滴度的增加。对于上文解释的原因，考虑到已知动脉炎病毒阻断IFN-β生产，这确实是预想不到的。

[0019] 因此，本发明的第一个实施方案涉及能够增殖动脉炎病毒的哺乳动物细胞，其特征在于所述细胞缺乏其IFN-β生产。

[0020] 在细胞中的病毒增殖是包括病毒在细胞中复制的过程，其结果是子代病毒出现。因此能够增殖动脉炎病毒的哺乳动物细胞是能够生产所述动脉炎病毒的子代病毒的细胞。

[0021] 出于本发明的目的，根据本发明缺乏其INF-β生产的哺乳动物细胞是在刺激INF-β通路后，显示出INF-β增加至由该哺乳动物细胞的野生型形式在相同刺激条件下生产的INF-β的量的一半或小于一半水平的哺乳动物细胞。优选地，根据本发明的哺乳动物细胞显示出增加的INF-β低于相同刺激状况下的由哺乳动物细胞的野生型形式显示的INF-β的量的40%，更优选地低于30%、低于20%、低于10%或甚至低于5% (以该优选顺序)。IFN-β的水平可以通过ELISA的方式确定。

[0022] 在实施例部分，给出了ELISA反应的描述，其可以用于确定在刺激INF-β途径后INF-β蛋白质增加的水平。在实施例中，提供了确定和比较野生型细胞和根据本发明的细胞中INF-β水平的方法。

[0023] 按照描述，所述测试使用可商购获得的抗体用于确定通过细胞生产的IFN-β的量。不言而喻，同样可以使用与IFN-β反应的其他抗体。

[0024] 在根据本发明优选的哺乳动物细胞中，通过将抗INF-β siRNA导入至宿主细胞中，阻断INF-β mRNA至INF-β蛋白质的翻译，达到了预想不到的效果。

[0025] 该方法是基于双链siRNA (以任何形式，例如以短发夹形式的短干扰/抑制RNA)对基因表达的基因沉默效应。这种所谓的RNA干扰(也简称为RNAi)，和siRNA背后的原理和机制是过去十年中很多出版物的主题。RNAi的主要用途仍是，并且已经是在研究中特异性地沉默宿主或宿主细胞的基因，以确定其在宿主中的作用。关于该主题的综述已由Hannon, G.J.在Nature 418: 244-251 (2002)和由Deni, A.M.和Hannon, G.J.在TRENDS in Biochemical Sciences 28: 196-201 (2003)撰写。描述siRNA在基因沉默中的用途的其他文献是Bertrand, J.R.等人，B.B.R.C. 296: 1000-1004 (2002)和Sorensen, D.R.等人，J. Mol. Biol. 327: 761-766(2003)。对siRNA的广泛的综述由Dorsett, Y.和Tuschl, T.发布在Nature Reviews, Drug Discovery 3: 318-329 (2004)。

[0026] 为了在siRNA和来自靶细胞的IFN-β mRNA之间获得最优的碱基配对，在Marc145细胞的情况中，本发明人首先将目前在基因库中可以获得的两种灵长类IFN-β基因的序列进行了比对。作为下一步，基于这些灵长类IFN-β基因中的高度保守区域，开发(RT)-PCR引物。将这些PCR引物用于生产来自Marc145细胞IFN-β mRNA的IFN-β DNA。对由此获得的Marc145-特异的IFN-β DNA测序并且使用序列信息发展用于基因沉默的siRNA。通过这种方法，可以确定siRNA展示了对靶IFN-β mRNA最优的结合(详见实施例部分)。

[0027] 对于基因沉默实验，培养能够增殖动脉炎病毒的哺乳动物细胞(在该情况中为Marc145 细胞)并且使用抗-Marc145 IFN-β siRNA转染，并添加作为IFN-β刺激物的聚(I:C) RNA。在使用siRNA转染后约5-6小时，使用PRRSV感染细胞(详见实施例部分)。从图7中可以看到，可以容易地获得约6-7倍的滴度增加。

[0028] 描述的转染方法非常合适于在小规模体外培养中实现减少IFN-β量的预想不到的效果。然而，作为用于大规模病毒生产而在大规模体外培养中的减小IFN-β量的方法，其不是特别合适的。

[0029] 然而，为了在用于大规模病毒生产的体外培养中获得在细胞中IFN-β量的减少，技术人员可以在很多选项中选择一种，这都是本领域中已知。

[0030] 一个选择是将携带在哺乳动物启动子控制下编码抗-IFN-β siRNA的短DNA片段的质粒导入细胞中。这避免了在每次病毒的体外培养开始时，转染细胞的必要性。

[0031] 这样的质粒可以是保持存在于细胞的细胞质中并且组成型地生产一定量的siRNA的质粒。优选地，质粒整合至细胞基因组中。此类质粒是本领域熟知的。携带这样质粒的细胞缺乏其IFN-β生产，但是它们不需要在选择压力下培养，如将是如果质粒没有整合至基因组的情况那样。

[0032] 通过开发能够沉默参与IFN-β途径中的一种其他基因的siRNA，同样可能获得缺乏其IFN-β生产的根据本发明的细胞。

[0033] 已知干扰素途径是通过单链RNA病毒进入细胞(在该情况中)引发的事件级联。病毒通过内吞作用进入细胞的内体，在此其引发Toll-样受体TLR7。激活的TLR7招募衔接子MyD88，其转而招募IRAK-4和IRAK-1。该复合体充当引发尤其是Irf3/Irf7途径的组分的支架。其最终导致编码IFN-β的基因转录。

[0034] 整体级联已熟知多年，并且所涉及的蛋白质是已知的。对IFN-β途径广泛的综述是例如，由Taro Kawai和Shizuo Akira在Nature Immunology 7: 131-137 (2006)、由Akinori Takaoka和Hideyuki Yanai在Cellular Microbiology 8: 907-922 (2006)、由Osamu Takeuchi和Shizuo Akira在Immunological Reviews 220: 214-224 (2007)和最广泛地由Randall, R.E.和Goodbourn, S., 在Journal of General Virology 89: 11-47 (2008)中撰写的。

[0035] 一旦IFN-β的量形成，其通过细胞排出。排出的IFN-β随后结合至从细胞膜突出的IFN-α/β受体。该结合在最初生产IFN-β的细胞(例如作为病毒感染的结果)和周围细胞中均诱导IFN-β生产的进一步增加，并且还诱导IFN-α。

[0036] 因此，IFN-α/β受体被认为是干扰素-β途径的一部分。IFN-α/β受体进一步的任务是诱导所谓的JAK/STAT途径，其最终干扰子代病毒的形成。

[0037] 因为IFN-α/β受体是干扰素-β途径的一部分，IFN-α/β受体同样是siRNA靶向的合适目标。受体的下调尤其由Kai-xin Zhang等人描述在International Journal of Cancer 127: 830-838 (2010)中。IFN-α/β受体的背景信息尤其可见于Platanias, L.C. (Nature Reviews Immunology 5: 375-386 (2005)；Randall, R.E.和Goodbourn, S. (参见前文)和Akinori Takaoka和Hideyuki Yanai (参见前文)的综述文献中。

[0038] 因此，这种实施方案的优选形式涉及根据本发明的哺乳动物细胞，其特征在于所述细胞包括在合适启动子控制下编码siRNA的DNA片段，其能够沉默IFN-β途径的一个基因。

[0039] 获得根据本发明以缺乏其IFN-β生产的哺乳动物细胞的同样引人注意的方法是在参与IFN-β途径的基因中导入突变。此类突变可以是插入、缺失或置换突变，当然前提是所述突变导致根据本发明的细胞缺乏其IFN-β生产，如上文所定义。最有效率的方法是不仅在此类基因中制造突变，而简单地删除参与IFN-β途径的一个基因。

[0040] 如果选择上文提及的基因进行沉默和/或突变，应当小心避免级联的可选子路径接替了被阻断的子路径。仅作为实例，如果将IRF7突变，优选也应将NF-κB的一个或多个基因突变。(对该途径的完整概述，尤其参见Randall, R.E.和Goodbourn, S., Journal of General Virology 89: 11-47 (2008)，如上文所述)。

[0041] 当然，非常吸引人并且因此优选进行突变的基因是编码IFN-β本身的基因。这尤其可以通过突变基因自身完成，但是也可以通过例如突变IFN-β启动子或启动子区域的元件诸如PRD IV、PRD I/III或PRD II完成。

[0042] 因此，这种实施方案的同样优选的形式涉及根据本发明的哺乳动物细胞，其特征在于所述细胞具有在IFN-β途径的基因中的突变。

[0043] IFN-β途径中适合作为基因沉默靶和作为突变靶的基因尤其是编码IFN-β、IFN-α/β受体、MyD88、IRAK-4、IRAK-1、TRAF3的基因、编码IKK-α亚基的基因和编码IRF7的基因。

[0044] 因此，本发明的任一优选形式的更优选形式涉及根据本发明的哺乳动物细胞，其特征在于所述基因选自由以下组成的基因组：编码IFN-β、IFN-α/β受体、MyD88、IRAK-4、IRAK-1、TRAF3的基因，编码IKK-α亚基的基因和编码IRF7的基因。

[0045] 期望突变上文提及的任何基因的技术人员具有可获得的数种用于特异性基因突变的有力工具，诸如，例如锌指核酸酶(ZNF's)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN's)。

[0046] 这些工具是选择用于任何基因的特异性突变的工具。基本上，两种工具均依赖于其包含二聚DNA酶FokI的事实，其能够在DNA的任何位置产生双链断裂，以及两个高度特异的和研究员设计的DNA结合域。TALEN's和ZFN's两者均允许高度特异的基因靶向和基因突变。

[0047] 这些工具及其使用已得到广泛地描述，用于突变尤其在细胞、多能细胞和胚胎中的基因。在此给出数个出版物的实例：DeFrancesco, L., Nature Biotechnology 29, 681-684 (2011)；Cost, G.等人，Nature Biotechnology 29, 695-696 (2011)；Yeh, J-R.等人，Nature Biotechnology  29,  697-698  (2011)；Zhang, B.等人，Nature Biotechnology 29, 699-700 (2011)；Jaenisch, R.等人，Nature Biotechnology 29, 
731-734 (2011)；Miller, J.等人，Nature Biotechnology 29, 143-148 (2011)和Zhang, F.等人，Nature Biotechnology 29, 149-153 (2011)。Hauschild-Quintern, J等人关于ZFN的综述的电子版可以在Cellular and Molecular Life Sciences, Springer Basel 
2012 10.1007/s00018-012-1204-1中获得。

[0048] 目前也可以根据要求商购获得通过使用这两种技术中一种，将其中一个或多个特异基因突变的细胞。

[0049] 因此，想要避免对来自INF-β途径的基因进行突变的全部工作的技术人员可以例如从法国巴黎Cellectis bioresearch, 8 rue de la Croix Jarry, 75013或美国Cellectis bioresearch Inc., One Broadway, Cambridge, MA 02142，订购其中已根据要求使用TALEN's突变期望的基因的细胞。

[0050] 已经例如使用ZFN's突变了期望的基因的细胞可以根据要求从美国Sigma-Aldrich Corporation, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103商购获得。

[0051] 上文描述的方法全部同样可用于增加细胞培养物中的马动脉炎病毒(EAV)的产量。这种病毒通常在幼仓鼠肾BHK21细胞和兔肾RK13细胞中生长。RK13细胞的IFN-β mRNA序列由NCBI编号XM_002707968.1  (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/XM_002707968.1)给出。因此，例如可以直接基于该序列设计用于在RK13细胞中基因沉默的siRNA。同样地，可以基于该序列直接设计用于在TALEN's或ZFN's中使用的高特异的和研究员设计的DNA结合域。

[0052] 因此，在该实施方案的甚至更优选的形式中，根据本发明的哺乳动物细胞是能够增殖PRRSV或EAV的哺乳动物细胞。

[0053] 在该实施方案的仍甚至更优选的形式中，根据本发明的哺乳动物细胞是选自以下组成的哺乳动物细胞的组：BHK21、RK13、MA104或Marc145。

[0054] 本发明的另一个实施方案涉及用于在细胞培养物中增殖动脉炎病毒的方法，其中所述方法包括在根据本发明的哺乳动物细胞中增殖所述动脉炎病毒的步骤。

[0055] 本发明的再另一个实施方案涉及根据本发明的哺乳动物细胞，其特征在于所述哺乳动物细胞是由动脉炎病毒感染的。

[0056] 本发明的仍另一个实施方案涉及包括根据本发明的哺乳动物细胞的细胞培养物。

[0057] 该实施方案的优选形式涉及包括根据本发明的哺乳动物细胞的细胞培养物，其特征在于所述哺乳动物细胞是由动脉炎病毒感染的。

[0058] 附图说明：

[0059] 图1：猕猴(Macaca mulatta)和人(Homo sapiens)干扰素-β序列的比对。

[0060] 图2：在T=在转染后24小时，使用聚(I:C)转染后的IFN-β表达。泳道2、3、7和8显示了未转染的细胞，泳道4、5、9和10显示了在聚(I:C)诱导的情况下的效果，泳道6和11是阴性对照。

[0061] 图3：使用聚(I:C)转染后持续的IFN-β mRNA表达。+和-指示了细胞处理，正如对图2所使用的。

[0062] 图4：IFN-β ELISA。图4A显示了IFN-β ELISA的标准曲线，并且图4B显示了在数个时刻在培养基中测量的IFN-β蛋白质的实际水平。

[0063] 图5：IFN-β mRNA的敲减。+和-指示了细胞处理，正如对图2所使用的。

[0064] 图6：IFN-β蛋白质表达的敲减。图6A显示了IFN-β ELISA的标准曲线，并且图6B显示了在数个时刻在培养基中测量的IFN-β蛋白质的实际水平。

[0065] 图7：PRRSV滴定。实施例

[0066] 实施例1

[0067] IFN-β RT-PCR的开发和siRNA的导出。

[0068] 设计PCR引物，使其能够特异扩增MARC-145细胞的IFN-β mRNA的部分。产生NM_002176.2 (人干扰素β1 mRNA)和NM_001135795.1 (猕猴干扰素β1 mRNA)的比对。将引物设计为与IFN-β mRNA序列的保守区域互补(图1，表1)。使用标准方法执行PCR。作为RT-PCR程序的对照，在实验中总是包括对GAPDH的PCR。GAPDH引物序列显示在表1中。用于两种引物的退火温度均设定为55ºC。

[0069] 将PCR样品在琼脂糖凝胶上进行电泳。将PCR产物从琼脂糖切出，使用QIAquick凝胶回收试剂盒(Qiagen)纯化并且测序。通过将获得的MARC-145 IFN-β mRNA核苷酸序列引入到BLOCK-iT™ RNAi设计器(Life Technologies)，导出Custom Stealth™ siRNAs (Invitrogen) (表2)。在全部siRNA实验中使用阴性对照siRNA  (中等GC含量，Life Technologies)。

[0070]

[0071] 表1：IFN-β和GAPDH引物序列

[0072]

[0073] 表2：抗Marc145 IFN-ß siRNA混合物。

[0074] MARC-145细胞中IFN-β表达的诱导和检测

[0075] 将MARC-145细胞在添加5% FCS的培养基6/B8修饰的培养基中，在37℃和5% CO2下增殖。

[0076] 为诱导干扰素应答，使用聚(I:C)转染MARC-145细胞。将细胞接种于6-孔培养平板中并且根据生产商说明书，在90-95%汇合时使用1.25-2.5 μg聚(I:C)和5.0 μl Lipofectamine 2000 (Invitrogen)转染。

[0077] 转染后，使用PBS洗涤细胞并且将其在补充1% β-巯基乙醇的360 μl缓冲液RLT (RNeasy Mini Kit, Qiagen)中裂解。收集细胞裂解物并且使其5次通过21号针而均质化。根据生产商的说明书，使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)分离RNA，其包括柱上DNA酶消化。在将RNA洗脱到50 μl H2O中。将洗脱的RNA在65℃孵育10分钟，并且在冰上孵育至少2分钟。使用29 μl RNA溶液，使用即用型You-Prime第一链珠子(GE Healthcare)和200 ng 随机引物(Invitrogen)，在33 μl的总体积中执行RT反应。将反应混合物在室温孵育1分钟，随后在37℃孵育1小时。最后，执行IFN-β和GAPDH的PCR (如上文描述的)并且将PCR样品在琼脂糖凝胶上进行电泳。

[0078] 此外，在转染后收集细胞培养基并且根据生产商的说明书，使用VeriKine-HS人IFN-β血清ELISA试剂盒(PBL InterferonSource)确定IFN-β的量。

[0079] 确认siRNA活性

[0080] 通过使用5.0 μl Lipofectamine 2000，用1.25 μg聚(I:C)与100 pmol抗Marc145 IFN-βsiRNA混合物(或100 pmol中等GC含量阴性对照siRNA)组合，共转染30-50%汇合的MARC-145细胞，随后进行RT-PCR和ELISA (如上文描述的)，来确认抗IFN-β siRNA的活性。

[0081] 阻断IFN-β表达和PRRSV病毒滴定

[0082] 使用siRNA转染前一天，将细胞以1 × 103个细胞/cm2的密度接种于6-孔培养平板上。在即将转染前，使用0.01M PBS洗涤细胞一次。根据生产商的说明书，每孔使用2.5 µl Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，将100 pmol阴性对照siRNAs (中等GC含量，Life Technologies)或100 pmol抗Marc145 IFN-β siRNA混合物(表1)转染至细胞中。在每孔1.0 ml培养基中，以0.1的MOI感染PRRSV之前，将转染的细胞在37℃和5% CO2孵育4至5小时。在37℃和5% CO2下孵育1小时后，移除上清液。使用0.01M PBS将细胞洗涤一次，并且将新鲜的培养基放置在细胞上，随后在37℃和5% CO2下孵育至收获培养基(达到感染后72小时)。根据生产商的说明书，使用VeriKine-HS人IFN-β血清ELISA试剂盒(PBL InterferonSource)确定培养基中IFN-β的量。

[0083] 通过在含有单层细胞的96孔微量滴定板中制备培养基样品的10倍系列稀释物执行PRRSV滴定。在37℃和5% CO2下孵育7天后，筛选存在CPE的孔。根据Spearman-Kärber方法计算病毒滴度，并且表示为log10 TCID50/ml。

[0084] 结果

[0085] IFN-β在MARC-145细胞中的表达

[0086] 为研究MARC-145细胞是否能够表达IFN-β，使用聚(I:C)转染细胞。在转染后数个时间点收获细胞和培养基。通过RT-PCR确定IFN-β mRNA表达(图2和3)并且基于标准曲线，使用ELISA定量培养基样品中的IFN-β蛋白质的表达水平(图4a和b)。

[0087] 如图2中所示，使用聚(I:C)的MARC-145转染造成了IFN-β mRNA表达的明显诱导。图3显示IFN-β mRNA表达的诱导持续了至少30小时。

[0088] 转染细胞的培养基含有提升的IFN-β蛋白质水平。与IFN-β mRNA相似，增加的IFN-β蛋白质表达可以检测至少30小时(图4b)。

[0089] 抗IFN-β siRNA在MARC-145细胞中的活性

[0090] 通过使用聚(I:C)和抗Marc145 IFN-β siRNA混合物或中等GC含量阴性对照siRNA的组合转染MARC-145细胞，以确认抗IFN-β siRNA的活性。分别通过RT-PCR和ELISA确认IFN-β mRNA和蛋白质的表达。使用抗Marc145 IFN-β siRNA混合物转染细胞明显地导致了IFN-β mRNA (图5)和蛋白质表达(图6)的敲减。IFN-β ELISA证明使用聚(I:C)和抗Marc145 IFN-β siRNA混合物两者转染细胞事实上完全消除了IFN-β蛋白质表达的诱导。由聚(I:C)转染导致的IFN-β蛋白质表达刺激，以及通过使用抗Marc145 IFN-β siRNA对这种效果的抑制，都维持了至少72小时(图6)。

[0091] 在IFN-β敲减后MARC-145细胞中增加的PRRSV复制

[0092] 通过使用抗Marc145 IFN-β siRNA混合物或中等GC含量阴性对照siRNA转染MARC-145细胞，随后使用PRRSV感染这些细胞，以研究IFN-β敲减对PRRSV复制的影响。在转染后的数个时间点收获细胞培养基。通过滴定确定病毒复制的水平。如图7和表3中所示，在使用siRNA抑制IFN-β表达的细胞中，PRRSV的复制是最有效率的。在将生长在由抗IFN-β siRNA转染的细胞中的病毒滴度与阴性对照siRNA相比时，滴度增加的差异达到0.7 Log10 (表3)。

[0093]

[0094] 表3：PRRSV滴定