稳定医药组合物转让专利
申请号 : CN201510191893.7
文献号 : CN105030760B
文献日 : 2018-10-02
发明人 : 林欣荣 , 韩鸿志 , 邱紫文 , 邱郁涵
申请人 : 长弘生物科技股份有限公司
摘要 :
一种稳定医药组合物,包含:(a)一介质系统,包含第一成分、第二成分、及第三成分,该第一成分为磷酸盐缓冲液,该第二成分选自以下群组:植物油、动物油、脂肪酸及其组合,且该第三成分选自以下群组:聚乙二醇、二甲亚砜、乙醇、聚丙二醇、聚山梨醇酯、聚氧乙基化蔬菜油、乙酸乙酯、12‑羟基硬酯酸羟乙酯、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯、及其组合;以及(b)亚丁基苯酞(n‑butylidenephthalide,BP)。
权利要求 :
1.一种稳定医药组合物,包含:
(a)一介质系统,包含第一成分、第二成分及第三成分,该第一成分为磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline),该第二成分选自以下群组:植物油、动物油、脂肪酸及其组合,且该第三成分为聚乙二醇与二甲亚砜的组合,其中第一成分与第二成分的体积比为1:2至20:1,且第一成分与第三成分的体积比为1:2至30:1;以及(b)亚丁基苯酞(n-butylidenephthalide,BP)。
2.如权利要求1所述的组合物,其中该植物油选自以下群组:芥花油、椰子油、玉米油、棉籽油、橄榄油、棕榈油、花生油、菜籽油、红花籽油、芝麻油、大豆油、葵花油、杏仁油、腰果油、榛果油、胡桃油、山核桃油、松子油、开心果油、蓖麻油(castor oil)及其组合;且该动物油选自以下群组:鱼油、鱼肝油、猪油、牛油、羊油、鸡油、鸭油及其组合。
3.如权利要求1所述的组合物,其中该第二成分为经修饰的蓖麻油(modified castor oil)。
4.如权利要求3所述的组合物,其中该经修饰的蓖麻油为聚乙氧化蓖麻油
(polyethoxylated castor oil)。
5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物,其中以每毫升(a)介质系统计,(b)亚丁基苯酞的浓度为0.001毫克/毫升至1500毫克/毫升。
说明书 :
稳定医药组合物
技术领域
[0001] 本发明是关于一种含有稳定存在的亚丁基苯酞(n-butylidenephthalide,BP)的稳定医药组合物,尤其关于一种可经由鼻内投药的含有稳定存在的亚丁基苯酞的稳定医药组合物,其有效于治疗恶性脑瘤。
背景技术
[0002] 星状细胞瘤(astrocytoma)、退行性星状细胞瘤(anaplasticastrocytoma)、及多型恶性神经胶质瘤(glioblastomamultiforme,GBM)为常见的成人恶性脑瘤,其中又以多型恶性神经胶质瘤最常见、恶性度最高、侵犯能力最强。
[0003] 恶性脑瘤具有高浸润性及高复发率、高致死率等特性,其治疗至今仍为医学上亟待解决的问题。目前治疗方式包括有外科手术、放射治疗及化学药物治疗等三种。以外科手术切除肿瘤虽可消灭大部分的肿瘤,但会伤害到其他正常脑组织,进而影响病患的行动和语言能力;放射治疗可局部杀死肿瘤,但亦会影响周遭的正常组织细胞;化学药物治疗则常常因血脑障壁(blood brain barrier,BBB)限制、毒性副作用大、或耐药性(drug resistance)等问题,无法获致良好治疗效果。鼻内投药方式为药物治疗中的新兴投药方法,其为非侵入式投药方法,可降低患者感染的风险,且药物经鼻腔吸入后,可经由鼻黏膜快速吸收而产生药效,不会受到肝脏首渡效应(first-pass effect)的代谢排除作用,此外 自鼻粘膜吸收的药物能绕行血脑障壁直达中枢神经系统,因而降低药物全身性毒性,效果优于口服投药或静脉注射投药。
[0004] 亚丁基苯酞(n-butylidenephthalide,BP)为目前治疗恶性肿瘤的潜力新药,其为一种源自当归(Angelica sinensis)萃取物的成分,沸点为139℃至142℃(5毫米汞柱),因此在一般情况下为呈油状液体。目前已知亚丁基苯酞可用于治疗多种恶性肿瘤,包括多型恶性神经胶质瘤及乳腺恶性肿瘤。另有研究显示亚丁基苯酞亦可用于抑制运动神经元的自体吞噬(autophagy),例如US 2014/0045765 A1即揭露亚丁基苯酞及其代谢物可用于抑制运动神经元的自体吞噬,且可用于治疗肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)。
[0005] 然而,亚丁基苯酞虽可提供药效,但其为脂溶性物质而非水溶性物质,因此目前在应用上仍多有限制,包括在口服配方、注射配方及鼻内投药配方应用上的限制、临床应用的限制、以及在使用诸如大鼠等小动物的动物研究上的限制。
[0006] 鉴于此,目前临床上需要一种亚丁基苯酞可稳定存在或溶解于其中的剂型,以提高亚丁基苯酞于生物体的利用率与改善其递送情况,并促进亚丁基苯酞的临床研究。本发明即针对前述需求所为的研发成果,通过一种介质系统以有效稳定亚丁基苯酞,从而更有效应用亚丁基苯酞。
发明内容
[0007] 因此,本发明的一目的,在于提供一种医药组合物,包含:(a)一介质系统,包含第一成分、第二成分、及第三成分,该第一成分为磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline),该第二成分 选自以下群组:植物油、动物油、脂肪酸及其组合,且该第三成分选自以下群组:聚乙二醇、二甲亚砜(DMSO)、乙醇、聚丙二醇、聚山梨醇酯、聚氧乙基化蔬菜油(polyoxyethylated vegetableoil)、乙酸乙酯、12-羟基硬酯酸羟乙酯(2-hydroxyethyl 12-hydroxyoctadecanoate)、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(tocopheryl polyethylene glycol succinate)、及其组合;以及(b)存在于该(a)介质系统中的亚丁基苯酞(n-butylidenephthalide,BP)。
[0008] 本发明的详细技术内容及部分实施态样,将描述于以下内容中,以供本发明所属领域具通常知识者据以明了本发明的特征。
附图说明
[0009] 图1A为根据本发明的一实施态样的医药组合物的倒立式显微镜(IM)图(400倍;比例尺:50微米);
[0010] 图1B为根据本发明的一实施态样的医药组合物之扫描式场发射电子显微镜(FE-SEM)图(10000倍;比例尺:1微米);
[0011] 图1C为根据本发明的一实施态样的医药组合物的穿透式电子显微镜(TEM)图(80000倍;比例尺:200纳米);
[0012] 图2A为根据本发明的不同实施态样的医药组合物及比较医药组合物于4℃低温下长时间储存前的照片;
[0013] 图2B为根据本发明的不同实施态样的医药组合物及比较医药组合物于4℃低温下长时间储存后的照片;
[0014] 图3显示根据本发明的不同实施态样的医药组合物(其中的介质系统组合不同)及比较医药组合物的活性的统计图,其中,纵轴为GBM8401细胞(即,人类恶性肿瘤细胞株)的存活率(以控 制组,即不含亚丁基苯酞的态样为100%计),横轴为活性成分亚丁基苯酞的处理浓度;
[0015] 图4显示储存时间对于根据本发明的医药组合物的活性的影响的统计图,其中,纵轴为GBM8401细胞的存活率(以控制组,即不含亚丁基苯酞之态样为100%计),横轴为亚丁基苯酞的处理浓度;
[0016] 图5为Franz扩散装置示意图;
[0017] 图6显示施以不同投药治疗的大鼠存活率统计图;
[0018] 图7A显示大鼠于种植肿瘤后施以不同治疗,在死亡之日或治疗第37天后的肿瘤生长情形的照片,其中,(A)未经药物处理(大鼠死亡之日所取得)(B)BP原液160毫克/公斤(第37天)(C)BP原液320毫克/公斤(第37天)(D)医药组合物580毫克/公斤(第37天)(E)医药组合物5160毫克/公斤(第37天);
[0019] 图7B显示大鼠于种植肿瘤后施以不同治疗,在治疗第37天后的肿瘤重量统计图;以及
[0020] 图7C显示大鼠于种植肿瘤后施以不同治疗,在治疗第37天后的肿瘤体积统计图。
具体实施方式
[0021] 以下将具体地描述根据本发明的部分具体实施态样;但是,在不背离本发明精神下,本发明尚可以多种不同形式的态样来实践,不应将本发明保护范围解释为限于说明书所陈述者。此外,除非文中有另外说明,于本说明书中(尤其是在后述专利申请范围中)所使用之「一」、「该」及类似用语应理解为包含单数及复数形式;以及在本说明书中「烃基」是指饱和直链或支链烃基,或具有一或多个π键的不饱和直链或支链烃基。
[0022] 对于具有治疗效果的活性成分而言,其一通常应用型态为以液体剂型的方式投药,液体剂型中包含活性成分及介质,活性成分可溶于介质中或稳定存在于介质中。更具体言之,配合不同的投药途径需求(如口服、体细胞导入、或外用),将活性成分溶于介质中(若其可溶)或悬浮于介质中(若其不可溶)而形成一适合投药的溶液、悬浮液或乳化液(emulsion)。此外,就制备含有少量活性成分的固体剂型而言,通常先将活性成分溶解或悬浮于液体介质中,而后再以该溶有或悬浮有活性成分的液体介质进行固体剂型制备,以准确控制最终产物中的活性成分浓度(含量)。
[0023] 本案发明人研究后发现,亚丁基苯酞对于乙醇之溶解度最高,乙醇为其极佳的溶剂。其中,亚丁基苯酞于乙醇中的溶解度超过222毫克/毫升,但于聚乙二醇400、聚乙二醇300或聚丙二醇中的溶解度则仅为约70至120毫克/毫升。然而,有研究显示,婴幼儿因为醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)尚未成熟,并没有办法如成人般有效的代谢乙醇(可参见Zuccotti GV,Fabiano V.Safety issues with ethanol as an excipient in drugs intended for pediatric use.Expert Opin Drug Saf 2011;10(4):499-502,该文献全文并于此处以供参考)。因此,若能以其他溶剂取代乙醇作为亚丁基苯酞的介质,或者可于介质中减少乙醇的用量,则将可大幅提高亚丁基苯酞的应用范围。
[0024] 本发明人进一步研究发现,亚丁基苯酞可稳定存在于一特定介质系统中,即使长时间储存(室温下储存三天;4℃下储存三十天)仍可稳定存在于该介质系统中并保持活性,该介质系统进一步还可以提高亚丁基苯酞于生物体中的利用率,从而在相对低的 亚丁基苯酞用量下提供所欲治疗效果,减缓或免除不必要的副作用。
[0025] 因此,本发明提供一种稳定医药组合物,该医药组合物包含(a)一介质系统以及(b)稳定存在于该(a)介质系统中的亚丁基苯酞。
[0026] 亚丁基苯酞可由商业上购得(例如可购自长弘生物科技股份有限公司,台湾)、化学合成或由天然材料(例如:当归)中萃取分离而得。此外,于使用萃取分离所得的亚丁基苯酞以前,可进一步通过例如骤沸塔层析法(flash column chromatography)、高效液相层析法、或结晶法的纯化方法,以提高亚丁基苯酞的纯度。
[0027] 于本发明医药组合物中,(a)介质系统包含第一成分、第二成分、及第三成分。该第一成分为磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline),该第二成分选自以下群组:植物油、动物油、脂肪酸及其组合,且该第三成分选自以下群组:聚乙二醇、二甲亚砜、乙醇、聚丙二醇、聚山梨醇酯、聚氧乙基化蔬菜油(polyoxyethylated vegetable oil)、乙酸乙酯、12-羟基硬酯酸羟乙酯(2-hydroxyethyl 12-hydroxyoctadecanoate)、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(tocopheryl polyethylene glycol succinate)、及其组合。
[0028] 作为(a)介质系统的第一成分,磷酸盐缓冲液对细胞而言是等压的且无毒的。可于本发明医药组合物中采用任何合宜的磷酸盐缓冲液,其实例包括NaCl(137mM)与KCl(2.7mM)的组合的水溶液及Na2HPO4(10mM)、KH2PO4(1.8mM)、NaCl(137mM) 与KCl(2.7mM)的组合的水溶液,但不限于此。
[0029] 作为(a)介质系统的第二成分,植物油的实例例如选自以下群组之一或多者:芥花油、椰子油、玉米油、棉籽油、橄榄油、棕榈油、花生油、菜籽油、红花籽油、芝麻油、大豆油、葵花油、杏仁油、腰果油、榛果油、胡桃油、山核桃油、松子油、开心果油及蓖麻油(castor oil);动物油的实例例如选自以下群组之一或多者:鱼油、鱼肝油、猪油、牛油、羊油、鸡油、及鸭油;而脂肪酸可为饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸(如顺式不饱和脂肪酸、单元不饱和脂肪酸、多元不饱和脂肪酸、反式不饱和脂肪酸等)。于本发明的部分实施态样中采用经修饰的蓖麻油作为第二成分,经修饰的蓖麻油的实例包括聚乙氧化蓖麻油(polyethoxylated castor oil)及氢化乙氧化蓖麻油,但不限于此。聚乙氧化蓖麻油亦称为甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯(glycerol polyethyleneglycol ricinoleate),例如是商购可得的EL(旧名为 EL;BASF公司)。 EL是一种非
离子型助溶剂及乳化剂,可通过反应氧化乙烯与蓖麻油而得。氢化乙氧化蓖麻油可通过反应氧化乙烯与氢化蓖麻油而得。氢化乙氧化蓖麻油的实例包括,聚氧乙烯氢化蓖麻油40(polyoxyl 40 hydrogenated castor oil)及聚氧乙烯氢化蓖麻油60(polyoxyl 60 hydrogenated castor oil),但不限于此。前者例如是 RH 40(HLB=14-16;
BASF公司),后者例如是 RH 60(HLB=15-17;BASF公司)。
离子型助溶剂及乳化剂,可通过反应氧化乙烯与蓖麻油而得。氢化乙氧化蓖麻油可通过反应氧化乙烯与氢化蓖麻油而得。氢化乙氧化蓖麻油的实例包括,聚氧乙烯氢化蓖麻油40(polyoxyl 40 hydrogenated castor oil)及聚氧乙烯氢化蓖麻油60(polyoxyl 60 hydrogenated castor oil),但不限于此。前者例如是 RH 40(HLB=14-16;
BASF公司),后者例如是 RH 60(HLB=15-17;BASF公司)。
[0030] 作为(a)介质系统的第三成分,聚山梨醇酯在市面上以「Tween」的名称销售,其实例包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯85等;聚氧乙基化蔬菜油在市面上以「Emulphor」 的名称销售;12-羟基硬酯酸羟乙酯在市面上的商品包括例如BASF公司的HS 15(亦即 HS 15);而维生素E聚乙二醇琥珀酸酯的实例则例如是D-α-维生素E聚乙二醇琥珀酸酯1000(D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate;HLB=13.2)。然而,适用为本发明医药组合物的(a)介质系统的第三成分,并不限于以上所举实例。
[0031] 于本发明的部分实施态样中,(a)介质系统由磷酸盐缓冲液(第一成分)、聚乙氧化蓖麻油(第二成分)及选自以下群组的成分(第三成分)所组成的混合物:聚乙二醇、二甲亚砜、乙醇、聚丙二醇、及其组合。其中,特别在第三成分选自聚乙二醇、二甲亚砜、及乙醇时,可对亚丁基苯酞提供较佳的稳定效果,所提供的医药组合物于长时间储存仍可维持不分层且亚丁基苯酞仍可保持活性。尤其,在第三成分为聚乙二醇与二甲亚砜的组合或聚乙二醇与乙醇之组合的情况下,可进一步提高本发明医药组合物的亚丁基苯酞的药效,其中又以第三成分为聚乙二醇与二甲亚砜的组合时最佳。因此,于本发明医药组合物的(a)介质系统中,第三成分较佳选自以下群组:聚乙二醇、二甲亚砜、乙醇、及其组合,更佳为聚乙二醇与二甲亚砜的组合或聚乙二醇与乙醇的组合,尤佳为聚乙二醇与二甲亚砜的组合。
[0032] 于本发明医药组合物中,作为组成(b)的亚丁基苯酞的浓度原则上并无特殊限制,只要可以稳定存在于(a)介质系统中即可。因此,当亚丁基苯酞溶解于(a)介质系统中,则亚丁基苯酞的含量以不高于其在(a)介质系统中的溶解度为原则;而当亚丁基苯酞分悬浮于(a)介质系统中,则亚丁基苯酞的含量以不产生分层 的用量为原则。在此原则下,于本发明的部分实施态样中,以每毫升(a)介质系统计,亚丁基苯酞的浓度为0.001毫克/毫升至1500毫克/毫升。
[0033] 举例言之,如后附实施例所示,当使用磷酸盐缓冲液([Na2HPO4]=10mM;[KH2PO4]=1.8mM;[NaCl]=137mM与[KCl]=2.7mM)为第一成分、聚乙氧化蓖麻油为第二成分、以及聚乙二醇或聚乙二醇与二甲亚砜或乙醇的组合为第三成分,提供(a)介质系统时(参照实施例1、5及6),作为组成(b)之亚丁基苯酞的用量在达到1,000毫克/毫升介质系统时仍可稳定存在于其中,故可确定在所提供的医药组合物中,亚丁基苯酞的含量至少可达1,000毫克/毫升介质系统。又例如,当使用磷酸盐缓冲液([Na2HPO4]=10mM;[KH2PO4]=1.8mM;[NaCl]=137mM与[KCl]=2.7mM)为第一成分、聚乙氧化蓖麻油为第二成分、以及乙醇与丙二醇的组合为第三成分提供(a)介质系统时,作为组成(b)的亚丁基苯酞的用量在达到208毫克/毫升介质系统时仍可稳定存在于其中,故可确定在所提供的医药组合物中,亚丁基苯酞的含量至少可达208毫克/毫升介质系统。
[0034] 于本发明医药组合物的(a)介质系统中,本领域技艺人士于观得本案说明书揭露内容后,可视所选用的第一成分、第二成分、及第三成分而调整其等的用量比例。举例言之,第一成分与第二成分的体积比可为1:2至20:1,例如1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、8:1、10:1、13:1、15:1、17:1、20:1等;而第一成分与第三成分的体积比可为1:2至30:1,例如1:1、2:1、3:1、
4:1、5:1、8:1、10:1、13:1、15:1、17:1、20:1、25:1、30:1等。另外, 在第三成分为多种成分的混合物的情况中,混合物中各构成成分的比例可由使用者(如视各成分的性质)作选择。以采用乙醇与聚乙二醇的混合物作为第三成分为例,由于乙醇与聚乙二醇以任何比例均可均匀混合,故其混合比例并无特殊限制,可采用乙醇:聚乙二醇之体积比为例如10:1至1:100,较佳6:1至1:50,更佳1:1至1:10以混合二者。
4:1、5:1、8:1、10:1、13:1、15:1、17:1、20:1、25:1、30:1等。另外, 在第三成分为多种成分的混合物的情况中,混合物中各构成成分的比例可由使用者(如视各成分的性质)作选择。以采用乙醇与聚乙二醇的混合物作为第三成分为例,由于乙醇与聚乙二醇以任何比例均可均匀混合,故其混合比例并无特殊限制,可采用乙醇:聚乙二醇之体积比为例如10:1至1:100,较佳6:1至1:50,更佳1:1至1:10以混合二者。
[0035] 举例言之,当以磷酸盐缓冲液([Na2HPO4]=10mM;[KH2PO4]=1.8mM;[NaCl]=137mM与[KCl]=2.7mM)为第一成分、聚乙氧化蓖麻油为第二成分、聚乙二醇为第三成分,则磷酸盐缓冲液与聚乙氧化蓖麻油脂体积比可为3:0.5~5(例如:3:1),磷酸盐缓冲液与聚乙二醇的体积比可为3:0.5~5(例如:3:1)。又例如,当以该磷酸盐缓冲液为第一成分、聚乙氧化蓖麻油为第二成分、聚乙二醇与二甲亚砜的组合为第三成分,则磷酸盐缓冲液与聚乙氧化蓖麻油的体积比可为1~10:1(例如:5:1),磷酸盐缓冲液与聚乙二醇与二甲亚砜之组合的体积比可为1~5:1(例如:3:1),而聚乙二醇与二甲亚砜的比可为1~2:1~2(例如1:1)。
[0036] 于本发明的医药组合物中,组成(b)亚丁基苯酞溶于介质系统当中,或稳定存在于介质系统中,因此使得组合物可形成一适合于亚丁基苯酞的输送或投药的溶液、乳化液或悬浮液,例如使得医药组合物可通过口服、注射及/或鼻内投药的方式投药予需要的对象。
[0037] 此外,由于亚丁基苯酞溶于或稳定存在于介质系统中,本发明医药组合物可促进使用诸如重量仅25克的小鼠或大鼠等小动物的动物研究。举例言之,在使用25克的小鼠作为动物模式研究亚 丁基苯酞的功效的实验中,一般需使用2至3微升(μL)的极微量的亚丁基苯酞,然而由于此量太过于微小,因此计量上相当困难。在此情况下,若使用本发明的医药组合物,则由于亚丁基苯酞稳定存在于介质中而为介质所稀释,故可将少量的活性成分亚丁基苯酞与大量的介质系统混合,以较大体积的本发明医药组合物来提供所欲的极微量亚丁基苯酞,如此,计量上将相对容易且精确。因此,本发明的医药组合物也可用于活性成分的固体剂型的制备,能准确控制最终产品中的活性成分浓度。
[0038] 本发明医药组合物可通过简单混合(a)介质系统与(b)亚丁基苯酞的方式进行制备。在(b)亚丁基苯酞可溶于(a)介质系统的情况中,可直接将亚丁基苯酞添加至介质系统当中,使其溶解于其中;而在(b)亚丁基苯酞不可溶于(a)介质系统的情况中,则可在将亚丁基苯酞添加至介质系统中后施以一物理力(如振荡)以促进其混合,以提供亚丁基苯酞以微米微滴或纳米微滴的形式存在于其中的一稳定乳化液或悬浮液。
[0039] 本发明医药组合物可视需要包含其他添加剂,只要这些添加剂或其他活性成分不会不利的影响(b)亚丁基苯酞的功效及其于(a)介质系统中的稳定性及/或溶解度。举例言之,可添加合宜用量的保存剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂等,以进一步提高所制得医药组合物的储存性;亦可于医药组合物中添加一或多种其他活性成分,例如抗氧化剂(如维他命E、维他命C、二丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)、丁基羟基甲氧苯(butylated hydroxyanisole,BHA))、化学药剂、免疫调节剂(immune modulators)等,以进一步加强所制得医药组合物的功 效或增加其运用灵活性。
[0040] 兹以下列实施例进一步例示说明本发明。其中,所添加的亚丁基苯酞以体积计,但以密度为1克/毫升进行换算,得到对应的重量。以下等实施例仅提供作为说明,而非用以限制本发明的保护范围,本发明保护范围如所附申请专利权利要求所示。
[0041] 实施例
[0042] 1.室温稳定性测试
[0043] 1.1测试方法
[0044] 将医药组合物置于室温下一指定时间(三天或七天),观察其外观是否出现分层,未出现分层者记录为「V」,分层者记录为「X」,以区分外观稳定性优劣;以及,以如下条件利用液相层析质谱仪通过相对滞留时间(relative retention time,RRT)量测医药组合物中的不纯物含量。
[0045]
[0046] 1.2医药组合物的制备
[0047] 实施例1
[0048] 以表1所示比例,将50微升亚丁基苯酞(BP)(长弘生物科技股份有限公司;批号:F212TR12001)、10微升聚乙二醇(PEG)(SIGMA公司;批号:MKBG2152V;CAS号:25322-68-3)与
10微升聚乙氧化蓖麻油( EL,下称『K-EL』;SIGMA公司; 批号:BCBC54780;
CAS号:61791-12-6)混合,而后将30微升磷酸盐缓冲液(下称『PBS』;[Na2HPO4]=10mM;
[KH2PO4]=1.8mM;[NaCl]=137mM与[KCl]=2.7mM)滴加至所得混合物中,并快速振荡混合均匀成乳化液,制得医药组合物1。
10微升聚乙氧化蓖麻油( EL,下称『K-EL』;SIGMA公司; 批号:BCBC54780;
CAS号:61791-12-6)混合,而后将30微升磷酸盐缓冲液(下称『PBS』;[Na2HPO4]=10mM;
[KH2PO4]=1.8mM;[NaCl]=137mM与[KCl]=2.7mM)滴加至所得混合物中,并快速振荡混合均匀成乳化液,制得医药组合物1。
[0049] 实施例2
[0050] 以与实施例1相同的方式制备医药组合物2的乳化液,但是改变各成分之用量比例,如表1所示。
[0051] 实施例3
[0052] 以与实施例1相同的方式制备医药组合物3的乳化液,但是改以二甲亚砜(DMSO)作为第三成分,并改变各成分的用量比例,如表1所示。
[0053] 实施例4
[0054] 以与实施例1相同的方式制备医药组合物4的乳化液,但是改变各成分的用量比例,如表1所示。
[0055] 实施例5
[0056] 与实施例1相同的方式制备医药组合物5的乳化液,但是改以PEG与DMSO的组合作为第三成分,并改变各成分的用量比例,如表1所示。
[0057] 实施例6
[0058] 以与实施例1相同的方式制备医药组合物6的乳化液,但是改以PEG与乙醇之组合作为第三成分,并改变各成分的用量比例,如表1所示。
[0059] 比较例1
[0060] 以与实施例1相同的方式制备比较医药组合物1的乳化液,但 是不添加第二成分(K-EL)并改以PEG与 HS 15(下称『HS 15』;BASF公司;批号:14225516K0;CAS号:61909-81-7)的组合作为第三成分,如表1所示。
[0061] 表1:不同医药组合物的组成体积百分比
[0062]
[0063] 1.3稳定性测试结果
[0064] 以第1.1点所载方法观察医药组合物1至6及比较医药组合物1乳化液的外观并量测不纯物含量,以评估组合物的稳定性,结果记录于下表2(乳化液外观)及表3-1至3-7与表4,其中表2显示乳化液外观,表3-1至3-7分别显示医药组合物1至6及比较医药组合物1中的不纯物浓度(体积百分比)随储存时间的变化情形,表4则为由此计算而得的各组合物的亚丁基苯酞浓度维持率(体积百分比)变化情形。
[0065] 表2:室温下储存前后的外观
[0066]医药组合物 1 2 3 4 5 6 比较1
配置完成时 V V V V V V V
室温储存3天后 V V V V V V X
室温储存7天后 X V V V X X X
配置完成时 V V V V V V V
室温储存3天后 V V V V V V X
室温储存7天后 X V V V X X X
[0067] 表3-1:医药组合物1的不纯物浓度(体积百分比)变化情形
[0068]RRT RRT 0.7 RRT 0.86 RRT 0.89 RRT 0.9 总合
[0069]配置完成时 0.32 ND ND ND 0.32
室温储存3天后 0.36 ND ND 0.3 0.66
室温储存7天后 0.43 0.25 0.08 0.84 1.60
室温储存3天后 0.36 ND ND 0.3 0.66
室温储存7天后 0.43 0.25 0.08 0.84 1.60
[0070] *ND代表仪器未检出。
[0071] 表3-2:医药组合物2的不纯物浓度(体积百分比)变化情形
[0072]RRT RRT 0.7 RRT 0.86 RRT 0.89 RRT 0.9 总合
配置完成时 0.25 ND ND <0.05 0.25
室温储存3天后 0.73 ND ND 1.24 1.97
室温储存7天后 0.43 0.23 0.10 0.71 1.47
配置完成时 0.25 ND ND <0.05 0.25
室温储存3天后 0.73 ND ND 1.24 1.97
室温储存7天后 0.43 0.23 0.10 0.71 1.47
[0073] 表3-3:医药组合物3的不纯物浓度(体积百分比)变化情形
[0074]RRT RRT 0.7 RRT 0.8 RRT 0.86 总合
配置完成时 0.11 <0.05 <0.05 0.11
室温储存3天后 0.20 0.12 <0.05 0.32
室温储存7天后 0.42 0.15 0.11 0.68
配置完成时 0.11 <0.05 <0.05 0.11
室温储存3天后 0.20 0.12 <0.05 0.32
室温储存7天后 0.42 0.15 0.11 0.68
[0075] 表3-4:医药组合物4的不纯物浓度(体积百分比)变化情形
[0076]RRT RRT 0.7 RRT 0.8 RRT 0.86 总合
配置完成时 0.09 ND <0.05 0.09
室温储存3天后 0.11 0.11 <0.05 0.22
室温储存7天后 0.19 0.16 0.07 0.42
配置完成时 0.09 ND <0.05 0.09
室温储存3天后 0.11 0.11 <0.05 0.22
室温储存7天后 0.19 0.16 0.07 0.42
[0077] 表3-5:医药组合物5的不纯物浓度(体积百分比)变化情形
[0078]RRT RRT 0.7 RRT 0.86 RRT 0.89 RRT 0.9 总合
配置完成时 0.04 0.01 0.07 0.02 0.14
室温储存3天后 0.02 0.33 0.02 0.03 0.40
室温储存7天后 0.02 0.67 ND 0.02 0.71
配置完成时 0.04 0.01 0.07 0.02 0.14
室温储存3天后 0.02 0.33 0.02 0.03 0.40
室温储存7天后 0.02 0.67 ND 0.02 0.71
[0079] 表3-6:医药组合物6的不纯物浓度(体积百分比)变化情形
[0080]
[0081]
[0082] 表3-7:比较医药组合物1的不纯物浓度(体积百分比)变化情形
[0083]RRT RRT 0.7 RRT 0.86 RRT 0.9 总合
配置完成时 0.28 ND ND 0.28
室温储存3天后 0.26 ND 0.2 0.46
室温储存7天后 0.32 0.21 0.36 0.89
配置完成时 0.28 ND ND 0.28
室温储存3天后 0.26 ND 0.2 0.46
室温储存7天后 0.32 0.21 0.36 0.89
[0084] 表4:活性成分(亚丁基苯酞)浓度维持率(体积百分比)变化情形
[0085]医药组合物 1 2 3 4 5 6 比较1
配置完成时 99.68 99.75 99.89 99.91 99.22 99.25 99.72
室温储存3天后 99.34 98.03 99.68 99.78 98.73 98.77 99.54
室温储存7天后 98.40 98.53 99.32 99.58 98.30 98.48 99.11
配置完成时 99.68 99.75 99.89 99.91 99.22 99.25 99.72
室温储存3天后 99.34 98.03 99.68 99.78 98.73 98.77 99.54
室温储存7天后 98.40 98.53 99.32 99.58 98.30 98.48 99.11
[0086] 由表2可知,本发明医药组合物在外观上可于室温下保持长达3天仍不会发生分层,尤其在部分态样中(实施例2至4)甚至可于室温下保存7天而不发生分层;而由表4可知,本发明医药组合物即使经长时间储存,亚丁基苯酞浓度的变化极小,维持率非常优异。
[0087] 上述结果显示,于本发明医药组合物具有优异的稳定性,活性成分可稳定存在于介质系统当中。其中,以每毫升介质系统计,医药组合物1、5及6中的活性成分亚丁基苯酞之浓度相当于约1,000毫克/毫升介质系统。
[0088] 2.医药组合物物理性质分析
[0089] 2.1分析方法
[0090] 2.1.1粒径、导电度及界面电位分析
[0091] 将医药组合物乳化液配制成浓度200微克/毫升作为样品,再以高浓度纳米粒径及界面电位分析仪(Malvern Nano-ZS ZEN-3600)分析样品的导电度、界面电位及所含乳化微粒的平均粒径大小。
[0092] 2.1.2黏度分析
[0093] 采用40毫米4度的角锥-平板模具,取约1毫升的样品置入平行板间,使用TA仪器公司之AR2000ex系统(应力控制)的流变仪分析样品的粘度随应变率的变化关系与流变特性,以判断样品系牛顿流体(粘度不会随着剪应变率的增加而增加或减少)或非牛顿流体(粘度随着剪应变率的增加而增加或减少)。
[0094] 2.1.3显微结构分析
[0095] 以经纯水稀释500倍的医药组合物作为样品,分别以倒立式显微镜(IM)、扫描式场发射电子显微镜(FE-SEM)及穿透式电子显微镜(TEM)观察其显微结构。
[0096] 2.2医药组合物的制备
[0097] 实施例7至11
[0098] 以与实施例1相同的方式制备医药组合物7至11,但是调整介质系统及活性成分的组成如表5所示。其中以每毫升介质系统计,医药组合物7至11中活性成分亚丁基苯酞的浓度分别约为105毫克/毫升介质系统(医药组合物7)、156毫克/毫升介质系统(医药组合物8)、208毫克/毫升介质系统(医药组合物9)、163毫克/毫升介质系统(医药组合物10)及111毫克/毫升介质系统(医药组合物11)。
[0099] 表5:不同医药组合物的组成体积百分比
[0100]
[0101]
[0102] 2.3分析结果
[0103] 2.3.1粒径、界面电位及导电度分析结果
[0104] 以第2.1.1点所载方法分析亚丁基苯酞原液(BP原液)、医药组合物1及5至11与比较医药组合物1的导电度、界面电位及所含乳化微粒之平均粒径大小,并将结果记录于下表6。如表6所示,本发明医药组合物中所含之亚丁基苯酞微粒系尺寸介于29.89纳米至1.22微米之间的细小微粒,且界面电位介于-6.80至-1.55毫伏(mV)之间,导电度介于12.1至14.93毫西门子/公分(mS/cm),此显示其为水包油(O/W)型式的乳化液。表6
[0105]配方 尺寸(纳米) 界面电位(毫伏) 导电度(毫西门子/公分)
BP原液 - 0.38 0.02
医药组合物1 1223.21 -4.41 12.5
医药组合物5 518.70 -5.65 12.7
BP原液 - 0.38 0.02
医药组合物1 1223.21 -4.41 12.5
医药组合物5 518.70 -5.65 12.7
[0106]医药组合物6 320.75 -6.60 12.7
医药组合物7 80.05 -3.65 14.1
医药组合物8 112.78 -2.41 12.3
医药组合物9 29.89 -2.52 12.1
医药组合物10 143.79 -1.55 12.7
医药组合物11 96.28 -2.02 12.7
比较医药组合物1 318.31 -6.80 12.6
医药组合物7 80.05 -3.65 14.1
医药组合物8 112.78 -2.41 12.3
医药组合物9 29.89 -2.52 12.1
医药组合物10 143.79 -1.55 12.7
医药组合物11 96.28 -2.02 12.7
比较医药组合物1 318.31 -6.80 12.6
[0107] 2.3.2粘度分析结果
[0108] 以第2.1.2点所载方法分析亚丁基苯酞原液、医药组合物1及5至11与比较医药组合物1的粘度,并计算其平均黏度,结果记录于下表7。如表7所示,亚丁基苯酞原液及医药组合物的粘度均呈现粘度随着剪应变率的增加而减少的现象,因此均属非牛顿流体中的剪切变稀流体(shear thinning liquid);此外,各医药组合物的粘度介于0.62×10-2至10.89×10-2帕·秒(Pa.s)之间。
[0109] 表7
[0110]配方 平均黏度(×10-2帕·秒)±标准差(SD)
BP原液 1.57±0.01
医药组合物1 10.89±0.59
医药组合物5 6.96+0.69
医药组合物6 4.56±0.37
医药组合物7 0.99±0.02
医药组合物8 8.69±0.13
医药组合物9 9.58±0.23
BP原液 1.57±0.01
医药组合物1 10.89±0.59
医药组合物5 6.96+0.69
医药组合物6 4.56±0.37
医药组合物7 0.99±0.02
医药组合物8 8.69±0.13
医药组合物9 9.58±0.23
[0111]医药组合物10 1.99±0.06
医药组合物11 0.62±0.02
比较医药组合物1 4.49±0.30
医药组合物11 0.62±0.02
比较医药组合物1 4.49±0.30
[0112] 2.3.3显微结构分析结果
[0113] 以第2.1.3点所载方法分析医药组合物5之显微结构,结果如图1A、图1B及图1C所示,其中图1A为医药组合物5的IM图(400倍;比例尺:50微米),图1B为医药组合物5的FE-SEM图(10,000倍;比例尺:1微米),且图1C为医药组合物5的TEM图(80,000倍;比例尺:200纳米)。由图1A至图1C的结果可知,于本发明医药组合物中,活性成分(亚丁基苯酞)的颗粒尺寸为纳米级至微米级的微粒,且具有大致为球形的型态。
[0114] 3.医药组合物的体外试验
[0115] 3.1分析对象
[0116] 实验组:医药组合物1、医药组合物5及医药组合物6
[0117] 控制组:比较医药组合物1
[0118] 3.2分析方法
[0119] 3.2.1低温稳定性测试
[0120] 将医药组合物置于4℃冰箱储存30天后,拍照并观察是否出现分层,并与刚制备完成时的医药组合物作外观比较。
[0121] 3.2.2毒杀试验(IC50值)
[0122] 将GBM 8401细胞(即,人类恶性脑瘤细胞株)以每孔6×103的细胞数目培养在96孔培养盘中,接着以亚丁基苯酞原液或不同医药组合物进行处理,历时24小时。其中,活性成分亚丁基苯酞的处理浓度分别为0微克/毫升(控制组)、12.5微克/毫升、25 微克/毫升、50微克/毫升、100微克/毫升及200微克/毫升。随后以MTT(3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)细胞存活测试方法分析各医药组合物对于GBM 8401细胞的存活的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50),以评估毒杀效果。
[0123] 3.2.3毒杀效果稳定度试验
[0124] 将医药组合物5分批分别于4℃下储存0、7、14、30或60天。将GBM 8401细胞以每孔6×103的细胞数目培养在96孔培养盘中,并以经储存不同时间的医药组合物5进行处理,历时24小时,随后以MTT细胞存活测试方法分析该经不同天数储存的医药组合物5对于GBM 8401细胞的存活的半抑制浓度(IC50),以评估储存时间对于医药组合物的毒杀效果的影响。
其中,活性成分亚丁基苯酞的处理浓度分别为0微克/毫升(控制组)、12.5微克/毫升、25微克/毫升、50微克/毫升、100微克/毫升及200微克/毫升。
其中,活性成分亚丁基苯酞的处理浓度分别为0微克/毫升(控制组)、12.5微克/毫升、25微克/毫升、50微克/毫升、100微克/毫升及200微克/毫升。
[0125] 3.2.4体外人工纤维膜穿透试验
[0126] 利用如图5所示的Franz扩散装置(三美玻璃仪器行)估计亚丁基苯酞原液及不同医药组合物穿透人工纤维膜的能力,以模拟其穿透鼻腔粘膜的情形,其中,此装置之扩散表面积大约有4.5平方公分,且接受池的容量约23毫升。
[0127] 具体试验方法包括:(i)将人工纤维膜裁切成适当大小,并置于Hepes(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid)缓冲液(118mM NaCl+1.2mM MgSO4+4.8mM KCl+5.5mM D-葡萄糖+2.5mM CaCl2+20mM Hepes)中浸泡10分钟;(ii) 于供给池中加入2毫升的亚丁基苯酞原液或浓度为3毫克/毫升的医药组合物;(iii)于接受池中加入Hepes缓冲液,并采用磁力搅拌(转速:300rpm)方式搅拌之;(iv)在温度37℃下进行试验,并每间隔1小时由接受池的取样管取样1毫升,同时补回已加温的Hepes缓冲液1毫升;(v)以分光光度计测量取样所得的溶液于310纳米波长下的吸收光谱,并计算亚丁基苯酞的浓度,共测量10小时;以及(vi)分别利用以下公式1及2计算求得有效穿透值(Permeability coefficient,Peff)与流量(Flux,J)。
[0128] Karasulu et al.,2008)公式1
[0129] 公式2
[0130] V:接受池的容量(毫升)
[0131] C0:初始供给的药物浓度(微克/毫升)
[0132] Peff:有效穿透率(公分/秒)
[0133] J:流量(微克/平方公分·秒)
[0134] A:扩散表面积(平方公分)
[0135] 稳定状态下,浓度随时间的变化(微克/毫升秒)
[0136] 3.2.5体外人体细胞株穿透试验
[0137] 将RPMI 2650细胞(即,人类鼻中膈鳞状细胞株)接种于涂布有胶原蛋白之孔径为0.4微米的细胞隔膜盘(cell insert)中,并培养2天,使细胞在细胞隔膜上形成细胞单层膜(monolayer)。接着,将细胞隔膜盘转移到已加入1.5毫升Hepes缓冲液的12孔盘中,再于细胞隔膜盘中加入0.5毫升的含亚丁基苯酞原液或医药组合物的Hepes缓冲液。然后,将12孔盘置于37℃、5%CO2的 培养箱中培养,每间隔1小时,分别收集12孔盘内的缓冲液,并以分光光度计测量其于310纳米波长下的吸收光谱,计算亚丁基苯酞或医药组合物浓度,共测量
6小时,并利用前述公式1及公式2,计算求得有效穿透(Peff)与流量(J)。
6小时,并利用前述公式1及公式2,计算求得有效穿透(Peff)与流量(J)。
[0138] 3.3试验结果
[0139] 3.3.1低温稳定性测试结果
[0140] 以第3.2.1点所载方法测试医药组合物1、比较医药组合物1、医药组合物5及医药组合物6于低温下的稳定性,结果如图2A及图2B所示,其中图2A及图2B分别为储存前及储存后的照片。由图2A及图2B可知,本发明医药组合物(医药组合物1、5及6)在4℃低温下长时间储存(长达30天)前后外观不会有显著变化且不会分层,而非本发明医药组合物(比较医药组合物1)在4℃低温下储存后则有明显分层的现象。前述结果显示,本发明医药组合物的稳定性优异。
[0141] 3.3.2毒杀试验结果:以第3.2.2点所载方法对亚丁基苯酞原液、医药组合物1、比较医药组合物1、医药组合物5及医药组合物6进行毒杀试验,结果如图3及表8所示。由图3可知,相较于控制组,GBM 8401细胞的存活率系随着活性成分亚丁基苯酞的剂量提高而下降,且各医药组合物中,以医药组合物5的毒杀效果最好,其抑制GBM 8401细胞的存活的IC50为28.20微克/毫升。
[0142] 表8
[0143]配方 IC50(微克/毫升)±SD
BP原液 85.32±1.70
医药组合物1 95.29±6.73
BP原液 85.32±1.70
医药组合物1 95.29±6.73
[0144]医药组合物5 28.10±2.71
医药组合物6 81.97±5.87
比较医药组合物1 62.34±6.36
医药组合物6 81.97±5.87
比较医药组合物1 62.34±6.36
[0145] 3.3.3毒杀效果稳定度试验结果
[0146] 以第3.2.3点所载方法对医药组合物5进行毒杀效果稳定度试验,结果如图4所示。由图4可知,相较于控制组,不论医药组合物5的储存时间如何,经处理后的各组GBM 8401细胞的存活率仍保持着随着活性成分亚丁基苯酞的剂量提高而下降的规律。前述结果显示,医药组合物5对恶性脑瘤细胞的毒杀效果并不会受到储存时间的影响,为一稳定的配方。
[0147] 3.3.4体外人工纤维膜穿透试验结果
[0148] 以第3.2.4点所载方法对亚丁基苯酞原液、医药组合物1、比较医药组合物1、医药组合物5及医药组合物6进行体外人工纤维膜穿透试验,结果记录于下表9。由表9可知,医药组合物5和医药组合物6的有效穿透率(Peff)最高,而亚丁基苯酞原液的有效穿透率最低。前述结果显示,相较于亚丁基苯酞原液,本发明医药组合物的穿透能力明显较佳,其中又以医药组合物5和医药组合物6的穿透能力为最佳。
[0149] 表9
[0150]
[0151]
[0152] 3.3.5体外人体细胞株穿透试验结果
[0153] 以第3.2.5点所载方法对亚丁基苯酞原液、医药组合物1、比较医药组合物1、医药组合物5及医药组合物6进行体外人体细胞株穿透试验,结果记录于下表10。由表10可知,医药组合物6的有效穿透率(Peff)最高,而亚丁基苯酞原液的有效穿透率最低。前述结果显示,相较于亚丁基苯酞原液,本发明医药组合物穿透细胞的能力明显较佳,其中又以医药组合物5及6的穿透细胞的能力为佳。
[0154] 表10
[0155]
[0156] 4.医药组合物的动物实验
[0157] 4.1实验方法
[0158] 于大鼠颅内植入9L(即,大鼠恶性脑瘤细胞株)肿瘤组织,待颅内生成肿瘤后再进行药物治疗试验。试验方法包括:(i)利用400毫克/公斤体重的水合氯醛(chloral hydrate)(Sigma-Aldrich公司)麻醉大鼠,待其昏迷后,将大鼠头部毛发剃除,并将大鼠保持固定于鼠脑定位仪(Lab StandardTMStereotaxic Instrument)上;(ii)以大剪将头皮剪开以露出头盖骨,以脑部囱门(bregma)为中心,向右3毫米,向下5毫 米,到定位钻孔处,利用钻孔器将头盖骨磨出5毫米直径的空洞;(iii)用镊子夹取预先准备好的9L肿瘤组织(1×1×1立方毫米)并植入脑内3毫米深处,静置1分钟待血液凝固后取出镍子,并于空洞处涂上骨腊,最后将大鼠头皮缝合,并给予抗生素;(iv)待植入肿瘤组织后第7天,随机分组如下表
11,并利用微量吸管吸取药物(亚丁基苯酞原液或医药组合物5)滴进大鼠鼻腔中,进行鼻内投药治疗,连续投药30天,并于期间记录大鼠体重及死亡只数;以及(v)取下肿瘤,利用电子式游标卡尺来测量肿瘤的长和宽,并且用下列公式3计算肿瘤之总体积,同时测量肿瘤重量,将测得之数值绘制成长条图与曲线图,以判断治疗成效。
11,并利用微量吸管吸取药物(亚丁基苯酞原液或医药组合物5)滴进大鼠鼻腔中,进行鼻内投药治疗,连续投药30天,并于期间记录大鼠体重及死亡只数;以及(v)取下肿瘤,利用电子式游标卡尺来测量肿瘤的长和宽,并且用下列公式3计算肿瘤之总体积,同时测量肿瘤重量,将测得之数值绘制成长条图与曲线图,以判断治疗成效。
[0159] 表11
[0160]
[0161] 「* n」为各组大鼠只数
[0162] 公式3
[0163] 4.2动物实验结果
[0164] 以第4.1点所载方法进行动物实验,实验结果如图6及图7A至7C所示。由图6及图7A至7C可知,相较于控制组,亚丁基苯酞原液(160毫克/公斤)及亚丁基苯酞原液(320毫克/公斤)皆具有抑制肿瘤生长的效果。前述结果显示,经由鼻内投予BP原液,确实可提供治疗恶性肿瘤的效果。
[0165] 由图6及图7A至7C亦可知,经鼻内投予亚丁基苯酞原液(160毫克/公斤)与医药组合物5(80毫克/公斤)30天后,该二组大鼠具有明显提升且相似的存活率、以及明显下降且相似的肿瘤体积及肿瘤重量。此结果显示,本发明医药组合物中的亚丁基苯酞的有效剂量,只需要亚丁基苯酞原液的有效剂量的一半,即可达到相同的治疗效果。
[0166] 由图7B、7C可知,投予医药组合物5(160毫克/公斤)30天后,该组肿瘤重量可减少约92%(图7B),而肿瘤体积可减少约94%(图7C)。前述结果显示,本发明医药组合物5(160毫克/公斤)具有优异的治疗恶性肿瘤的效果。
[0167] 以上体外及动物实验结果皆显示,将亚丁基苯酞制成如本发明的医药组合物,可提高鼻内投药后活性成分穿透鼻腔粘膜的效率,加乘其治疗效果,尤其是治疗恶性脑瘤的功效。
[0168] 上述实施例仅用以例示说明本发明的原理及功效,而非用于限制本发明。任何熟于此项技艺之人士均可在不违背本发明的技术原理及精神的情况下,对上述实施例进行修改及变化。因此,本发明的权利保护范围应如所附申请专利权利要求所界定。