一种实现活体兔角膜扩张模型的装置及其构建方法

摘要

本发明公开了一种实现活体兔角膜扩张模型的装置及其构建方法，涉及医学动物模型技术领域。本发明中构建兔角膜扩张模型的装置包括去上皮工具、角膜浸泡工具以及麻醉工具等。采用该装置，进行手术操作，如去角膜上皮、不同浓度的胶原酶对角膜进行浸泡处理等，从而实现活体兔角膜的成功构建。本装置中所述的工具和材料来源充足、成本低、涉及到的手术操作构建方法简单；所构造的模型与临床圆锥角膜的病理状态一致，可用于圆锥角膜的机理性研究。

权利要求

1.一种实现兔角膜扩张活体模型的装置，其特征在于，包括：去上皮工具，用于除去兔角膜的上皮；

角膜浸泡工具，用于对除去上皮的兔角膜进行浸泡处理，使兔角膜扩张；

涂膏工具，用于将防感染剂涂抹在浸泡处理后的兔角膜上；

其中，所述的角膜浸泡工具包括：作用于角膜上，用于浸泡角膜的Ⅱ型胶原酶溶液；

用于将所述Ⅱ型胶原酶溶液施用于角膜上的移液器；

由于清除残留的胶原酶溶液的棉签；

用于冲洗角膜的PBS溶液；

用于将PBS溶液对角膜进行冲洗处理的注射器。

2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，还包括麻醉工具，用于除去兔角膜的上皮之前，对兔角膜进行麻醉处理。

3.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述Ⅱ型胶原酶的浓度为3-18mg/ml。

4.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述涂膏工具包括：用于防病原菌侵入浸泡处理后的兔角膜上的防感染处理剂；

用于将所述防 感染处理剂涂抹在兔角膜上的无菌棉签。

5.如权利要求4所述的装置，其特征在于，所述防感染处理剂选自迪可罗眼膏、红霉素眼膏或托百士眼膏中的一种。

6.如权利要求2所述的装置，其特征在于，所述麻醉工具包括：用于麻醉兔角膜，使其失去感知能力的麻醉剂；

用于将麻醉剂注射入兔角膜的注射器。

7.如权利要求6所述的装置，其特征在于，所述麻醉剂选自盐酸奥布卡因滴眼液、奥布卡因凝胶或奥布卡因滴眼液中的一种。

说明书

一种实现活体兔角膜扩张模型的装置及其构建方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医学动物模型技术领域，尤其涉及一种实现活体兔角膜扩张模型的装置及其构建方法。

背景技术

[0002] 圆锥角膜是一种非炎性角膜扩张性疾病，它可导致角膜中央或旁中央进行性变薄膨出、高度散光或角膜瘢痕，严重影响患者视力。圆锥角膜多在青春期发病，据报道该病发病率约为1/2000。临床上圆锥角膜以散发独立病例较为常见，但圆锥角膜可与许多疾病相关，包括某些先天性遗传病如Down综合征、Marfan综合征等和某些结蹄组织异常疾病如Ehlers-Danlos综合征、二尖瓣脱垂等。

[0003] 目前圆锥角膜病因尚不清楚，通常认为圆锥角膜是由环境因素和遗传因素共同作用引起的。在圆锥角膜中可发现许多细胞因子和酶的表达发生改变，有学者认为蛋白水解酶和下调的蛋白酶抑制剂可导致胶原退化，从而引起角膜基质变薄。而胶原酶可以降解天然胶原；因此，局部应用胶原酶建立角膜扩张模型存在一定可行性。圆锥角膜动物模型可模拟临床上圆锥角膜的病理状态，而且活体的模型相对于离体的模型更接近于真实体内情况，对于指导圆锥角膜治疗以及愈后检测及观察有不可比拟的优势，也更加有利于探索圆锥角膜的发病机制，由此建立这种近乎理想的活体圆锥角膜模型显得非常有必要。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是建立一种可靠的角膜扩张模型，为探索圆锥角膜的发病机制提供极大便利。

[0005] 为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种实现兔角膜扩张模型的装置，所述装置密封保存在一个操作箱中或其它可以放置下述工具的容器，用于构建兔角膜扩张模型，所述装置具体包括：

[0006] 去上皮工具，用于除去兔角膜的上皮；

[0007] 角膜浸泡工具，用于对除去上皮的兔角膜进行浸泡处理，得到浸泡处理后的兔角膜；

[0008] 涂膏工具，用于将防感染剂涂抹在浸泡处理后的兔角膜上。

[0009] 特别是，所述装置还包括麻醉工具，用于除去兔角膜的上皮之前，对兔角膜进行麻醉处理。

[0010] 其中，所述去上皮工具包括：小圆刀、角膜刮刀。

[0011] 其中，所述的角膜浸泡工具包括：

[0012] 作用于角膜上，用于浸泡角膜的Ⅱ型胶原酶溶液；

[0013] 用于将所述Ⅱ型胶原酶溶液施用于角膜上的移液器；

[0014] 用于冲洗角膜的PBS溶液和用于将PBS溶液对角膜进行冲洗处理的注射器。

[0015] 特别是，所述Ⅱ型胶原酶溶液中Ⅱ型胶原酶的浓度为3-18mg/ml。

[0016] 尤其是，所述Ⅱ型胶原酶溶液中包含质量百分数为10-24％的右旋糖酐。

[0017] 尤其是，所述Ⅱ型胶原酶溶液还包括PBS溶液，溶液pH值为7.4。

[0018] 其中，所述涂膏工具包括：

[0019] 用于防止病原菌侵入浸泡处理后的兔角膜上的防感染处理剂；

[0020] 用于将所述放感染处理剂涂抹在兔角膜上的无菌棉签。

[0021] 特别是，所述防感染处理剂为迪可罗眼膏、红霉素眼膏或者托百士眼膏。

[0022] 特别是，所述用于将所述放感染处理剂涂抹在兔角膜上的无菌棉签，也可以将眼药膏直接用手涂入兔结膜囊内。

[0023] 其中，所述麻醉工具包括：

[0024] 用于麻醉兔角膜，使其失去感知能力的麻醉剂；

[0025] 用于将麻醉剂作用于兔角膜的注射器。

[0026] 特别是，所述麻醉剂为盐酸奥布卡因滴眼液、奥布卡因凝胶或奥布卡因滴眼液。

[0027] 为实现本发明的目的，本发明另一方面提供一种兔角膜扩张模型的构建方法，包括：

[0028] 使用去上皮工具，除去兔角膜的上皮结构，得到除去上皮的兔角膜；

[0029] 使用角膜浸泡工具，对除去上皮的兔角膜进行浸泡处理，使角膜上的胶原发生降解，得到胶原含量降低的兔角膜；

[0030] 利用涂膏工具，将防感染剂涂抹在胶原降解的兔角膜上，得到具有抵抗病原菌侵入的兔角膜；

[0031] 将所述具有抵抗病原菌侵入的兔角膜饲养5-15天，得到兔角膜扩张模型。

[0032] 特别是，所述还包括麻醉工具，用于除去兔角膜的上皮之前，对兔角膜进行麻醉处理。

[0033] 其中，所述去上皮工具是小圆刀、角膜刮刀。

[0034] 其中，所述的角膜浸泡工具包括：

[0035] 作用于角膜上，用于浸泡角膜的Ⅱ型胶原酶溶液；

[0036] 用于将所述Ⅱ型胶原酶溶液施用于角膜上的移液器；

[0037] 用于冲洗角膜的PBS溶液和用于将PBS溶液对角膜进行冲洗处理的注射器。

[0038] 特别是，所述Ⅱ型胶原酶溶液中Ⅱ型胶原酶的浓度为3-18mg/ml。

[0039] 尤其是，所述Ⅱ型胶原酶溶液中包含质量百分数为10-24％的右旋糖酐。

[0040] 尤其是，所述Ⅱ型胶原酶溶液还包括PBS溶液。

[0041] 其中，使用角膜浸泡工具，对除去上皮的兔角膜进行浸泡处理的包括：

[0042] 使用移液器将Ⅱ型胶原酶溶液滴加在角膜表面，进行浸泡处理，使角膜中的胶原发生降解；

[0043] 在所述浸泡处理结束后，使用棉签吸干角膜上的Ⅱ型胶原酶溶液；

[0044] 最后利用注射器将PBS溶液在所述吸干Ⅱ型胶原酶溶液后的角膜表面对角膜进行冲洗，得到去除Ⅱ型胶原酶溶液的角膜。其中，所述浸泡处理时间为20-40min。

[0045] 优选地，所述浸泡处理时间为30min。

[0046] 其中，所述涂膏工具包括：

[0047] 用于防止病原菌侵入浸泡处理后的兔角膜上的防感染处理剂；

[0048] 用于将所述放感染处理剂涂抹在兔角膜上的无菌棉签。

[0049] 特别是，所述防感染处理剂为迪可罗眼膏、红霉素眼膏或者托百士眼膏。

[0050] 特别是，所述用于将所述放感染处理剂涂抹在兔角膜上的无菌棉签，也可以将眼药膏直接用手涂入兔结膜囊内。

[0051] 其中，所述麻醉工具包括：

[0052] 用于麻醉兔角膜，使其失去感知能力的麻醉剂；

[0053] 用于将麻醉剂作用于兔角膜的注射器。

[0054] 特别是，所述麻醉剂为盐酸奥布卡因滴眼液、奥布卡因凝胶或奥布卡因滴眼液。

[0055] 本发明的优点在于：

[0056] 1、本发明提供的实现兔角膜扩张模型的装置仅包括麻醉工具、去皮工具、角膜浸泡工具和涂膏工具就可以建立兔角膜扩张模型，所述工具都是市售产品，成本低，容易获得。

[0057] 2、使用本发明提供的兔角膜扩张模型的工具构建兔角膜扩张方法简单，仅需对兔角膜进行麻醉、去上皮、浸泡角膜、涂抹眼膏即可完成构建过程，不需要投入人员培训费用，因此该方法成本低，操作人员没有特别要求。

[0058] 3、使用本发明提供的装置构建的兔角膜扩增模型的曲率增加与中央厚度减少与临床圆锥角膜的病理状态所呈现的曲率增加、中央厚度减少是一致的，可用于圆锥角膜曲率变化机理性研究。

[0059] 4、相对于现有技术使用的人角膜建立的角膜扩张模型，本发明提供的兔角膜扩张模型的角膜来源于兔子，因此成本低，容易获得。

具体实施方式

[0060] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0061] 实验经北京大学第一医院医学伦理委员会批准，遵循ARVO关于动物实验的声明。

[0062] 材料：

[0063] 新西兰白兔：北京大学第一医院实验动物中心提供，健康状况良好，雌性成年体重2.0-3.0kg，眼部检查未见异常，30只。

[0064] Ⅱ型胶原酶(美国Worthington公司)

[0065] 右旋糖苷(美国Adamas公司)

[0066] 手持电子角膜曲率计(天津市索维电子技术有限公司)

[0067] 手持角膜超声测厚仪(美国Accutome公司)

[0068] 回弹式眼压计(芬兰iCare公司)

[0069] 实施例1

[0070] 1、II型胶原酶溶液的配制

[0071] 1.1PBS溶液的配制

[0072] 将0.27g的磷酸二氢钾(KH2PO4)、1.42g的磷酸氢二钠(Na2HPO4)、8g的氯化钠(NaCl)、0.2g的氯化钾(KCl)用800mL的去离子水充分搅拌溶解，定容到1L，并使用浓盐酸调pH至7.4，得到PBS溶液。

[0073] 1.2II型胶原酶溶液的配制

[0074] 将15mg右旋糖酐粉末和0.3g II型胶原酶粉末溶解于100ml的PBS缓冲液中，轻轻涡旋振荡，使其充分溶解，然后用低蛋白结合的0.22um的滤膜过滤除菌，分装成小份量，-20℃保存避光冻存。

[0075] 2、活体圆锥角膜模型的建立

[0076] 术前对10只实验兔进行常规裂隙灯、直接眼底线、角膜曲率、中央角膜厚度等检查，排除眼前节病变，10只新西兰白兔采用右眼为实验眼和左眼为对照眼。将实验兔固定于试验操作台上，将5％戊巴比妥钠注射液以0.5ml/Kg行实验兔耳缘静脉缓慢推注将兔麻醉，盐酸奥卡因滴眼液滴3滴，使兔角膜表面浸润麻醉；采用手持角膜曲率计和手持角膜超声测厚仪观测右眼角膜曲率Ki(i＝1、2…10)、左眼角膜曲率K’i(i＝1、2…10)及角膜中央厚度(CCT)Hi(i＝1、2…10)；随后使用小圆刀片和角膜刮刀去除角膜中心直径8mm的角膜上皮)，采用移液器将步骤1配置的3mg/ml的胶原酶溶液滴入右眼，滴入量为200ul，浸泡右眼角膜30min，同时左眼角膜使用含有15％右旋糖苷的PBS溶液浸泡30min。随后采用棉签吸干溶液，PBS溶液冲洗多次洗净残留溶液，在手术眼部涂抹迪可罗眼膏预防感染，在处理15天后观察双眼角膜的角膜曲率Kj(j＝1、2…10)及角膜中央厚度(CCT)Hj(j＝1、2…10)。

[0077] 3、结果分析

[0078] 采用SPSS17.0统计学软件对处理前与处理15天后的双眼角膜平均曲率[0079] (Km＝1/10(K1+K2+…K10)，K’m＝1/10(K’1+K’2+…+K’10))、角膜中央厚度(CCT)(Hm＝1/10(H1+H2+…H10)，H’m＝1/10(H’1+H’2+…H’10))进行分析，所有数据结果以均数±标准差表示，实验数据结果见表1和表2。每只兔子的左右眼的角膜平均曲率及角膜中央厚度改变值分别进行配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

[0080] 实施例2

[0081] 1、II型胶原酶溶液的配制

[0082] 1.1PBS溶液的配制

[0083] 将0.27g的磷酸二氢钾(KH2PO4)、1.42g的磷酸氢二钠(Na2HPO4)、8g的氯化钠(NaCl)、0.2g的氯化钾(KCl)用800mL的去离子水充分搅拌溶解，定容到1L，并使用浓盐酸调pH至7.4，得到PBS溶液。

[0084] 1.2II型胶原酶溶液的配制

[0085] 将24mg右旋糖酐粉末和1.8g II型胶原酶粉末溶解于100ml的PBS缓冲液中，轻轻涡旋振荡，使其充分溶解，然后用低蛋白结合的0.22um的滤膜过滤除菌，分装成小份量，-20℃保存避光冻存。

[0086] 2、活体圆锥角膜模型的建立

[0087] 术前对10只实验兔进行常规裂隙灯、直接眼底线、角膜曲率、中央角膜厚度等检查，排除眼前节病变，10只新西兰白兔采用右眼为实验眼和左眼为对照眼。将实验兔固定于试验操作台上，将5％戊巴比妥钠注射液以0.5ml/Kg行实验兔耳缘静脉缓慢推注将兔麻醉，盐酸奥卡因滴眼液滴3滴，使角膜表面浸润麻醉；采用手持角膜曲率计和手持角膜超声测厚仪观测右眼角膜曲率Ki(i＝1、2…10)、左眼角膜曲率K’i(i＝1、2…10)及角膜中央厚度(CCT)Hi(i＝1、2…10)。采用小圆刀片和角膜刮刀去刮除角膜中心直径8mm的角膜上皮，采用移液器将步骤1配置的18mg/ml的胶原酶溶液滴入右眼，滴入量为200ul，浸泡右眼角膜20min，同时左眼角膜使用含有24％右旋糖苷的PBS溶液浸泡20min。随后采用棉签吸干溶液，PBS溶液冲洗多次洗净残留溶液，在手术眼部涂抹迪可罗眼膏预防感染，在处理5天后观察双眼角膜的角膜曲率Kj(j＝1、2…10)及角膜中央厚度(CCT)Hj(j＝1、2…10)。

[0088] 3、结果分析

[0089] 采用SPSS17.0统计学软件对处理前与处理5天后的双眼角膜平均曲率[0090] (Km＝1/10(K1+K2+…K10)，K’m＝1/10(K’1+K’2+…+K’10))、角膜中央厚度(CCT)(Hm＝1/10(H1+H2+…H10)，H’m＝1/10(H’1+H’2+…H’10))进行分析，所有数据结果以均数±标准差表示，实验数据结果见表1和表2。每只兔子的左右眼的角膜平均曲率及角膜中央厚度改变值分别进行配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

[0091] 实施例3

[0092] 1、II型胶原酶溶液的配制

[0093] 1.1PBS溶液的配制

[0094] 将0.27g的磷酸二氢钾(KH2PO4)、1.42g的磷酸氢二钠(Na2HPO4)、8g的氯化钠(NaCl)、0.2g的氯化钾(KCl)用800mL的去离子水充分搅拌溶解，定容到1L，并使用浓盐酸调pH至7.4，得到PBS溶液。

[0095] 1.2II型胶原酶溶液的配制

[0096] 将10mg右旋糖酐粉末和1.0g II型胶原酶粉末溶解于100ml的PBS缓冲液中，轻轻涡旋振荡，使其充分溶解，然后用低蛋白结合的0.22um的滤膜过滤除菌，分装成小份量，-20℃保存避光冻存。

[0097] 2、活体圆锥角膜模型的建立

[0098] 术前对10只实验兔进行常规裂隙灯、直接眼底线、角膜曲率、中央角膜厚度等检查，排除眼前节病变，10只新西兰白兔采用右眼为实验眼和左眼为对照眼。将实验兔固定于试验操作台上，将5％戊巴比妥钠注射液以0.5ml/Kg行实验兔耳缘静脉缓慢推注将兔麻醉，盐酸奥卡因滴眼液滴3滴，使角膜表面浸润麻醉；采用手持角膜曲率计和手持角膜超声测厚仪观测右眼角膜曲率Ki(i＝1、2…10)、左眼角膜曲率K’i(i＝1、2…10)及角膜中央厚度(CCT)Hi(i＝1、2…10)。采用小圆刀片和角膜刮刀去刮除角膜中心直径8mm的角膜上皮，采用移液器将步骤1配置的10mg/ml的胶原酶溶液滴入右眼，滴入量为200ul，浸泡右眼角膜40min，同时左眼角膜使用含有10％右旋糖苷的PBS溶液浸泡40min。随后采用棉签吸干溶液，PBS溶液冲洗多次洗净残留溶液，在手术眼部涂抹迪可罗眼膏预防感染，在处理10天后观察双眼角膜的角膜曲率Kj(j＝1、2…10)及角膜中央厚度(CCT)Hj(j＝1、2…10)。

[0099] 3、结果分析

[0100] 采用SPSS17.0统计学软件对处理前与处理10天后的双眼角膜平均曲率[0101] (Km＝1/10(K1+K2+…K10)，K’m＝1/10(K’1+K’2+…+K’10))、角膜中央厚度(CCT)(Hm＝1/10(H1+H2+…H10)，H’m＝1/10(H’1+H’2+…H’10))进行分析，所有数据结果以均数±标准差表示，实验数据结果见表1和表2。每只兔子的左右眼的角膜平均曲率及角膜中央厚度改变值分别进行配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

[0102] 表1 实验前后角膜平均曲率数据统计与分析结果

[0103]

[0104] 根据表1，以上不同实施例中右眼实验前后的角膜平均曲率都明显高于处理前的角膜平均率，而且P值均小于0.01，而左眼对照组实验前后的角膜平均曲率差异不明显，计算得到的P值无统计学意义，证明经过各个实施例处理方案实验前后的角膜平均曲率均具有显著性差异，左眼对照组角膜平均曲率在实验前后无差异。

[0105] 表2 实验前后角膜平均中央厚度数据统计与分析结果

[0106]

[0107] 根据表2，以上不同实施例中右眼实验前后的角膜中央厚度都明显低于处理前的角膜平均率，而且P值均小于0.01，而左眼对照组实验前后的角膜中央厚度差异不明显，分析计算得到的P值远大于0.05，无统计学意义，证明经过各个实施例处理方案实验前后的角膜中央厚度均具有显著性差异，左眼对照组角膜中央厚度在实验前后无差异。

[0108] 通过以上不同实施例中不同浓度的II型胶原酶处理并在不同处理时间下检测角膜曲率数据与角膜中央厚度差值数据(CCT)，进一步分析结果，证明在实验前后活体的兔角膜的平均曲率显著增加，并且角膜的中央厚度也显著减少，这与临床圆锥角膜的病理状态所呈现的曲率增加、中央厚度减少是一致的。由此，可得出该模型可作为有效可靠的活体角膜扩张模型，可用来研究圆锥角膜发病机制和探索安全有效的治疗方法。此外，本装置中所述的工具和材料来源充足、成本低、涉及到的手术操作构建方法简单，更加有利于临床上的广泛推广应用。