一种橡胶树开花调控蛋白HbTFL1-3及其编码基因与应用

摘要

本发明提供了一种橡胶树开花调控蛋白HbTFL1‑3及其编码基因与应用。所述开花调控蛋白HbTFL1‑3的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，将其编码基因转化植株，可获得开花期延迟的转基因植株。

权利要求

1.一种橡胶树开花调控蛋白HbTFL1-3，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID No.7中的

239bp～757bp所示。

4.一种来自橡胶树的开花调控基因HbTFL1-3，其特征在于，其cDNA序列如SEQ ID No.7所示。

5.根据权利要求4所述的基因HbTFL1-3，其特征在于，其DNA序列如SEQ ID No.8所示。

6.含有权利要求2或3所述编码基因的载体。

7.含有权利要求6所述载体的工程菌。

8.权利要求2或3所述编码基因与权利要求4或5所述基因在延迟植株开花方面的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将权利要求7所述的工程菌侵染植株，获得开花期延迟的转基因植株。

说明书

一种橡胶树开花调控蛋白HbTFL1-3及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种橡胶树开花调控蛋白HbTFL1-3及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] TFL1/CEN-like基因广泛存在于开花植物中，是一类非常重要的开花抑制者。它们通过抑制FT基因的下游花器官决定基因AP1和LFY基因，实现抑制开花的目的。

[0003] 在拟南芥tfl1突变体中，拟南芥营养生长期显著缩短，同时花序从无限花序转变为终端花序。因此证明拟南芥TFL1基因具有同时调控营养生长和花序发育的功能(Bradley D，Ratcliffe O，Vincent C，Carpenter R，Coen E(1997)Inflorescence commitment and architecture in Arabidopsis.Science 275:80–83)。在豌豆中，两个TFL1-like基因被证明调控豌豆两个不同的发育阶段，LF基因调控维持顶端分生组织的不确定性，而DET基因则调控花序分生组织的不确定性。因此，在lf/DET植株中，开花期提前，但是花序的发育没有受到影响；在LF/det植株中，开花期没有受到影响，但花序由无限花序转变为终端花序；在lf/det双突变植株中，表型就像拟南芥tfl1突变体一样，营养生长期和花序发育都受到严重影响(Foucher F，Morin J，Courtiade J，Cadioux S，Ellis N，Banfield M J，Rameau C(2003)DETERMINATE and LATE FLOWERING are two TERMINAL FLOWER1/CENTRORADIALIS homologs that control two distinct phases of flowering initiation and development in pea.Plant Cell 15:2742–2754)。而CEN基因，最早发现于模式植物金鱼草中，它有非常强的组织表达特异性，当花序分生组织形成不久就开始表达，并随着花序的发育而逐渐增强。金鱼草cen突变体植株表现出花序从无限花序转变为终端花序，但营养生长没有受到影响，由此说明CEN在金鱼草中调控着花序发育并维持花序分生组织不确定性(Bradley D，Carpenter R，Copsey L，Vincent C，Rothstein S，Coen E(1996)Control of inflorescence architecture in Antirrhinum.Nature379:791-797.)。而在另一个模式植物烟草中，CET2/CET4却表现出不同的表达模式，Amaya等(1999)研究表明它们只在处于营养生长的侧芽中高表达，当烟草进入开花时期，它们的表达受到NFL基因抑制并逐渐降低。说明CET2/CET4对营养器官发育的维持有非常重要的作用(Amaya I，Ratcliffe OJ，Bradley DJ(1999)Expression of CENTRORADIALIS(CEN)and CEN-like genes in tobacco reveals a conserved mechanism controlling phase change in diverse species.Plant Cell 11:1405–1418)。

[0004] 以上研究结果表明，TFL1/CEN-like基因对植物营养生长和/或生殖发育的调控起着非常重要的作用。巴西橡胶树有着长达5-8年的营养生长期，研究不同TFL1/CEN-like基因在橡胶树中的机理有助于对橡胶树生长期进行有效调控。目前，在巴西橡胶树中，尚未有关TFL1/CEN-like基因的报道。

发明内容

[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种橡胶树开花调控蛋白HbTFL1-3及其编码基因与应用。

[0006] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种橡胶树开花调控蛋白HbTFL1-3，其氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。

[0007] 本发明还提供了所述蛋白的编码基因。

[0008] 进一步地，其核苷酸序列为SEQ ID No.7中的239bp～757bp所示。

[0009] 本发明还提供了一种来自橡胶树的开花调控基因HbTFL1-3，其cDNA序列如SEQ ID No.7所示。

[0010] 进一步地，其DNA序列如SEQ ID No.8所示。

[0011] 本发明还提供了含有前述编码基因的载体。

[0012] 本发明还提供了含有前述载体的工程菌。

[0013] 本发明进一步提供了前述编码基因与前述基因在延迟植株开花方面的应用。

[0014] 进一步地，所述应用为将所述工程菌侵染植株，获得开花期延迟的转基因植株。

[0015] 主要特征表现在轮座叶和主枝节点数明显增多，花器官出现缺失，导致角果异常，结实率降低。最严重的可引起转基因植株出现不开花表型。

[0016] 本发明的有益效果在于：

[0017] 本发明首次公开了5个开花调控基因，即TFL1/CEN-like同源基因，它们在橡胶树营养器官中有着不同的表达模式：

[0018] 1)对于TFL1-like同源基因来说，HbTFL1-1主要在根和稳定叶中表达，HbTFL1-2主要在根中特异表达，而HbTFL1-3则在茎和顶端分生组织中表达。另外它们有一个共同的表达特点，就是在开花期(每年的3月份)，3个基因在处于生殖生长阶段植株中的各自的营养器官中的表达明显低于处于童期营养生长的植株。在花序发育过程中，3个基因的表达都随着花序的发育而逐渐升高，但在开花的雄花和雌花中却表现着不同的相对表达量，其中，HbTFL1-1在雄花和雌花中表达差不多，HbTFL1-2在雌花中表达明显高于在雄花中的表达；而HbTFL1-3则在雄花中的表达非常显著的高于雌花中的表达。

[0019] 2)对于CEN-like同源基因来说，它们在橡胶树营养器官中有着类似的表达模式，但不完全相同。在3个月大小苗中二者主要在根、茎和芽中表达。在生长发育过程中，二者表现出的表达趋势分为三种。第一，在根中，二者都随着年龄增加表达逐渐降低，在2年树中降低为零。第二，在茎中，二者表现出先升高后降低的趋势；在芽中，HbCEN1表现出先升高后降低的表达趋势，而HbCEN2则表现出随着年龄增加逐渐降低的趋势。在花序发育过程中，二者表现出相似的表达模式，即随着花序的发育它们的表达逐渐降低，尤其是HbCEN1，表达趋势非常明显。

[0020] 另外，分别将5个基因分别转入野生型拟南芥中，转基因植株比野生型植株在营养生长期和花期都有明显的延长。主要特征表现为轮座叶和主枝节点数明显增多，花器官出现缺失，导致角果异常，结实率降低。最严重的可引起转基因植株出现不开花表型。再将5个基因分别转入转入tfl1-1突变体中，结果，5个基因皆能有效地将tfl1-1突变表型恢复为野生型表型，有些还出现了严重的延迟营养生长期和花期的表型，更有甚者出现了不开花现象。

[0021] 因此，这5个基因可作为巴西橡胶树开花调控的重要候选基因，通过对巴西橡胶树的遗传转化有望实现对巴西橡胶树花期调控。同样，也可在其他农作物中应用，解决近缘种或者不同品种杂交时花期不育带来的一系列问题，另外也可对生育期进行调控。

附图说明

[0022] 图1为3个TFL1-like基因组织特异性表达和时空表达分析。其中A为HbTFL1-1基因时空表达模式分析；B为HbTFL1-2基因时空表达模式分析；C为HbTFL1-3基因时空表达模式分析。

[0023] 图2为2个CEN-like基因组织特异性表达和时空表达分析。其中A为HbCEN1基因时空表达模式分析；B为HbCEN2基因时空表达模式分析。

[0024] 图3为3个TFL1-like基因在花序5个不同发育阶段的表达分析。I，第一发育阶段的花序；II，第二发育阶段的花序；III，第三发育阶段的花序；IV，第四发育阶段的花序；V，第五发育阶段的花序；A为HbTFL1-1基因表达分析；B为HbTFL1-2基因表达分析；C为HbTFL1-3基因表达分析。

[0025] 图4为2个CEN-like基因在花序5个不同发育阶段的表达分析。I，第一发育阶段的花序；II，第二发育阶段的花序；III，第三发育阶段的花序；IV，第四发育阶段的花序；V，第五发育阶段的花序；A为HbCEN1基因表达分析；B为HbCEN2基因表达分析。

[0026] 图5为野生型拟南芥分别与转3个TFL1-like基因植株开花表型比较。其中A为野生型拟南芥与其转HbTFL1-1基因开花表型比较；B为野生型拟南芥与其转HbTFL1-2基因植株开花表型比较；C为野生型拟南芥与其转HbTFL1-3基因植株开花表型比较。

[0027] 图6为野生型拟南芥分别与转2个CEN-like基因植株开花表型比较。其中A为野生型拟南芥与其转HbCEN1基因开花表型比较；B为野生型拟南芥与其转HbCEN2基因植株开花表型比较。

[0028] 图7为拟南芥tfl1-1突变体转化3个TFL1-like基因的恢复验证实验。

[0029] 图8为拟南芥tfl1-1突变体转化2个CEN-like基因的恢复验证实验。

具体实施方式

[0030] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0031] 实施例1 巴西橡胶树5个目标基因的获得

[0032] 根据中国热带农业科学院橡胶研究所的橡胶树基因组数据库和叶片转录组数据库，通过同源比对的方式获得的contig，然后进行拼接，再通过NCBI在线软件预测开放阅读并设计特异引物获得包含有完整开放阅读框的DNA序列和cDNA序列。

[0033] 具体方法如下：

[0034] 5个基因开放阅读框的获得

[0035] 5个基因特异引物如下：

[0036] HbTFL1-1OF(EcoRI):G ATGTCAAGGATCATGGAGCC

[0037] HbTFL1-1OR(XbaI):GC TCATCTTCTTCTTGCAGCAGTTT

[0038] HbTFL1-2OF(EcoRI):G ATGGCAAGAATAATAGAACCTCT

[0039] HbTFL1-2OR(XbaI):GC TTAGCGCCTTCTTGCAGCAGTT

[0040] HbTFL1-3OF(EcoRI):G ATGGCAAGAATAATAGAACCTCT

[0041] HbTFL1-3OR(XbaI):GC TTAGCGTCTTCTTGCAGCAGTT

[0042] HbCEN1OF(EcoRI):G ATGGCGAAGACAACAGATCCTC

[0043] HbCEN1OR(XbaI):GC TCAGCGCCTCCTTGCAGC

[0044] HbCEN2OF(EcoRI):G ATGGCCAAGACTTCAGACCCTC

[0045] HbCEN2OR(XbaI):GC TCAGCGTCTCCTTGCTGCT

[0046] 分别以HbTFL1-1OF(EcoRI)和HbTFL1-1OR(XbaI)，HbTFL1-2OF(EcoRI)和HbTFL1-2OR(XbaI)，HbTFL1-3OF(EcoRI)和HbTFL1-3OR(XbaI)，HbCEN1OF(EcoRI)和HbCEN1OR(XbaI)，HbCEN2OF(EcoRI)和HbCEN2OR(XbaI)组成为引物对，每个引物对再分别以橡胶树根，叶片，芽和花序的cDNA为模版，分别扩增5个目标基因。

[0047] PCR反应程序为：95℃3min预变性，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃1min延伸，35个循环，72℃10min终延伸。

[0048] 将扩增产物与pMD-19载体连接，转化大肠杆菌DH5a中并测序。最后，获得5个基因的完整开放阅读框。

[0049] 5个基因5’UTR的获得：

[0050] 对于HbTFL1-3来说，5’UTR通过5’RACE获得，所用的接头引物共有3条：

[0051] QT(CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTT)，

[0052] Q1(GAGGACTCGAGCTCAAGC)和Q0(CCAGTGAGCAGAGTGACG)。

[0053] 5’RACE操作流程参照文献(迪芬巴赫C W，德维克斯勒G R.PCR技术实验指南.黄培堂译.北京：科学出版社，1998:268-277)。

[0054] HbTFL1-3所用5’RACE特异引物为：

[0055] HbTFL1-3-GSP51st:(GGGCCTTGGAATTTCATAGCTC)，

[0056] HbTFL1-3-GSP52nd:(GTGCAGGTGCTCCCTCAAATAAG)。

[0057] 其余基因，在起始密码子上游设计了一些不同位置的正引物分别与开放阅读框之内的一条下游引物配对进行PCR，直到获得最长的5’UTR为止。

[0058] HbTFL1-1获得最长的5’UTR所用的引物对为：

[0059] HbTFL1-15UF:(CTCCTCTCACGAGTCCCTTTCTACC)，

[0060] HbTFL1-15UR:(ACATCGCCTACAACTCTCCCT)。

[0061] HbTFL1-2获得最长的5’UTR所用的引物对为：

[0062] HbTFL1-25UF:

[0063] (ATTCCAGGACCAGGAGTCTTATTCTTGATG)，

[0064] HbTFL1-25UR:(ATGTCCATTGTAGACTTGCCTGTTATTGTA)。

[0065] HbCEN1获得最长的5’UTR所用的引物对为：

[0066] HbCEN15UF:(TCCACCCCCATTGCCTTACAAGAG)，

[0067] HbCEN15UR:(ATCTGTTGTCTTCGCCATTAGAGACTTG)。

[0068] HbCEN2获得最长的5’UTR所用的引物对为：

[0069] HbCEN25UF:(GGTCTGCTTCCACCCTCATTGCCTTAC)，

[0070] HbCEN25UR:(TCTCCAATAACCCCCCCAACCACC)。

[0071] 扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终延伸10min。

[0072] 5个基因3’UTR的获得：

[0073] HbTFL1-1基因3’UTR在转录组中是完整的。其余基因的3’UTR通过3’RACE获得3’UTR。所用的接头引物与5’RACE用到的3个接头引物一样，同时3’RACE操作流程也是参照文献(迪芬巴赫C W，德维克斯勒G R.PCR技术实验指南.黄培堂译.北京：科学出版社，1998:268-277)。先用QT引物作为反转录引物，反转录程序按反转录照说明书进行。之后分别以
1st
HbTFL1-2、HbTFL1-3、HbCEN1和HbCEN2基因的GSP3 和Q0为引物分别进行第一轮PCR，之后分别以50倍稀释PCR产物作为第二轮PCR的模版。进行第二轮PCR时，再分别以这4个基因的GSP32nd和Q1组合为引物对进行第二轮PCR，产物通过电泳挖胶获得。扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终延伸10min。

[0074] HbTFL1-2-GSP31st:GTGAGCGACATCCCTGGAACA

[0075] HbTFL1-2-GSP32nd:CGAAGACAGACAATCAACCCACC

[0076] HbTFL1-3-GSP31st:CGAAGACAGACAATCAACCCACC

[0077] HbTFL1-3-GSP32nd:GAAACTGCTGCAAGAAGACGCTAAC

[0078] HbCEN1-GSP31st:GCACTTGCACTGGATAGTTACGGAC

[0079] HbCEN1-GSP32nd:TCCATAGGTTTGTTTTCCTTCTGTTCA

[0080] HbCEN2-GSP31st:ATAGTGACAGACATCCCGGGCA

[0081] HbCEN2-GSP32nd:TCCATAGGTTTGTGTTCCTTCTGTT

[0082] 5个基因cDNA序列的获得：

[0083] 根据5’和3’UTR的获得，再次设计了特异引物。

[0084] 其中：

[0085] HbTFL1-1引物对为：

[0086] HbTFL1-1F:CTCCTCTCACGAGTCCCTTTCTACCCTTG，

[0087] HbTFL1-1R:GAGAGAAACAATTTCATACTTACATTAC；

[0088] HbTFL1-2引物对为：

[0089] HbTFL1-2F：ATTCCAGGACCAGGAGTCTTATTCTTG，

[0090] HbTFL1-2R：GACAGATATATATGTTTCTGCAAGCTTA；

[0091] HbTFL1-3引物对为：

[0092] HbTFL1-3F：AGAGAGAGAGAGAGAGATGACAGATTCC，

[0093] HbTFL1-3R：GACAGATGAAACAGATTATATAGAGAGC；

[0094] HbCEN1引物对为：

[0095] HbCEN1F：TCCACCCCCATTGCCTTACA，

[0096] HbCEN1R：ACTTTTGGCTAATACCCATTTTTATTCA；

[0097] HbCEN2引物对为：

[0098] HbCEN2F：GGTCTGCTTCCACCCTCATTGC，

[0099] HbCEN2R：ACGAGGAAGAAGTCCATTGTTAGGACAC。

[0100] 5个目的基因cDNA序列的扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环，72℃终延伸10min。获得的PCR产物与pMD19连接并进行测序。
测序结果得到的5个基因片段如序列表中编号为1，4，7，10，13的序列。

[0101] 5个目的基因DNA序列的扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环，72℃终延伸10min。获得的PCR产物与pMD19连接并进行测序。
测序结果得到的5个基因片段即为序列表2，5，8，11，14的序列。

[0102] 实施例2 5个目标基因组织特异性表达分析

[0103] 本研究选取3个月大的橡胶组培苗为实验材料。分别采集根、茎、芽、古铜叶、变色叶、淡绿叶和稳定叶，分别提取它们的RNA备用。

[0104] 对上述所获得的RNA进过DnaseI消化后按照反转录试剂盒进行反转录。通过荧光定量技术进行5个目标基因组织特异性表达分析。

[0105] 5个基因荧光定量引物分别为：

[0106] HbTFL1-1QF:CCTCCTTAATCCCTGGCTACG，

[0107] HbTFL1-1QR:ACATCGCCTACAACTCTCCCT，

[0108] HbTFL1-2QF:GCCACATTTGGAAGGGAGATAG，

[0109] HbTFL1-2QR:TAACACTTATTATTGAAGGCCACTTG，

[0110] HbTFL1-3QF:ATACACCTCTTAGCCAGACGCTC，

[0111] HbTFL1-3QR:TGTCGCCTCCTTGGACCTCA，

[0112] HbCEN1QF:CTAATGGCGAAGACAACAGAT，

[0113] HbCEN1QR:CACCTCCCTGGACCTCAAC，

[0114] HbCEN2QF:GAAACAGCAGCAAGGAGACG，

[0115] HbCEN2QR:ATTGGTGCGACTGATACGAC。

[0116] 结果表明：对于TFL1-like基因来说，HbTFL1-1主要在根和稳定叶中表达，HbTFL1-2主要在根中特异表达，而HbTFL1-3则在茎和顶端分生组织中表达，如图1所示。对于CEN-like基因来说，HbCEN1和HbCEN2都主要在根、茎和芽中表达。如图2所示。

[0117] 实施例3 5个目标基因的时空表达模式分析

[0118] 分别以3个月，2年和10年树为研究对象，在开花季节(3月份)分别采集个年龄段的根、茎、芽、古铜叶、变色叶、淡绿叶和稳定叶，以及10年树开花时的雄花和雌花，分别提取RNA备用。

[0119] 对上述所获得的RNA进过DnaseI消化后按照反转录试剂盒进行反转录。通过荧光定量技术分别对5个目标基因进行时空表达模式分析。

[0120] 结果显示：在开花季节，对于TFL1-like基因来说，HbTFL1-1、HbTFL1-2和HbTFL1-33个基因在10年树中各自营养器官中的表达明显低于3个月和2年树的。在刚刚分化的花序中3个基因的表达几乎为0，而在开花的雄花和雌花中，3个基因的表达都明显上升且表现出不同的表达水平。HbTFL1-1在雄花和雌花中表达差不多，HbTFL1-2在雌花中表达明显高于在雄花中的表达；而HbTFL1-3则在雄花中的表达非常显著的高于雌花中的表达，如图3所示。而对于CEN-like基因来说，HbCEN1和HbCEN2表现出的表达趋势分为三种。第一，在根中，二者都随着年龄增加表达逐渐降低，在2年树中降低为零。第二，在茎中，二者表现出先升高后降低的趋势；在芽中，HbCEN1表现出先升高后降低的表达趋势，而HbCEN2则表现出随着年龄增加逐渐降低的趋势。如图4所示。

[0121] 实施例4 5个目标基因在花序发育过程中的表达分析

[0122] 以正在发育过程的花序为研究对象。将花序发育分为5个时期，划分标准为第一个时期：花序长度约为0.5cm，第二个时期：花序长度约为2.0cm，第三个时期：花序长度约为4.0cm，第四个时期：花序长度约为8.0cm，第五个时期为开花时期，花序长度>8.0cm。分别采集5个时期的花序并提取RNA备用。

[0123] 对上述所获得的RNA进过DnaseI消化后按照反转录试剂盒进行反转录。通过荧光定量技术分别对5个目标基因进行不同花序发育阶段的表达分析。

[0124] 结果显示：3个TFL1-like基因在花序发育过程中都随着花序的发育不断升高，如图5所示。而2个CEN-like基因在花序发育过程中都随着花序的发育不断降低，如图6所示。

[0125] 实施例5 5个目标基因转化野生型拟南芥的功能验证

[0126] 利用pXCS植物表达载体(由中国热带农业科学院橡胶研究所保存)分别与5个目标基因连接，构建转化拟南芥野生型转化载体。具体实施方案如下：

[0127] 分别设计构建植物表达载体的5个目标基因的引物。所用到的用于构建植物表达载体的引物即为实施例1中所述5个基因的特异引物，其中5个基因的正引物5’端分别加有EcoRI酶切位点，反引物5’端分别加有XbaI酶切位点。将获得的PCR产物与pMD19载体连接并进行测序。然后，提取测序正确的质粒，用EcoRI和XbaI分别双酶切pXCS和5个测序正确的质粒，并用T4DNA连接酶分别将pXCS载体和5个目的基因连接，并命名为pXCS-HbTFL1-1/WT，pXCS-HbTFL1-2/WT，pXCS-HbTFL1-3/WT，pXCS-HbCEN1/WT，pXCS-HbCEN2/WT。

[0128] 之后，将含有5个目标基因的植物表达载体分别导入根癌农杆菌GV3101(PMP90RK)中(由中国热带农业科学院橡胶研究所保存)。

[0129] 对于野生型拟南芥的侵染，参照文献(Clough，S.J.and Bent，A.F.(1998)Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J.16:735-743.)。获得的T0代种子，先将其用自来水浸泡，并放置于4℃环境暗室里春化3天。之后播撒在经1/2M培养基浸泡过的蛭石上面于22℃长日照环境生长(16h/8h)，待小苗发芽时，用浓度为10g/L的除草剂进行喷洒，以便筛选抗性植株。10天后，将生长正常的小苗移栽到营养土(营养土：蛭石＝2：1)中生长并等待收种。阳性植株的检测通过southern方法，此方法参照文献(Blanc G，Baptiste C，Oliver G，Martin F，Montoro P.(2006)Efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of embryogenic calli and regeneration of Hevea brasiliensis M¨ull Arg.Plants.Plant Cell Rep(2006)24:724–733)。

[0130] 将5个基因T3代转基因植株分别和野生型在相同环境中培养，并比较对它们进行开花表型比较。

[0131] 结果显示：对于TFL1-like基因来说，当野生型拟南芥在32天左右开花时，3个TFL1-like基因转基因植株还未看到抽薹，如图5所示；而对于CEN-like基因来说，野生型拟南芥在40天后已经结了很多角果，但是2个CEN-like基因转基因植株才开始开花，如图6所示。

[0132] 实施例6 5个目标基因对tfl1-1突变体表型恢复验证实验

[0133] 本次恢复验证实验重新构建了5个目标基因的植物表达载体，所用到的引物如下：

[0134] HbTFL1-1OF(EcoRI):G ATGTCAAGGATCATGGAGCC

[0135] HbTFL1-1OR(XmaI):CCC TCTTCTTCTTGCAGCA

[0136] HbTFL1-2OF(EcoRI):G ATGGCAAGAATAATAGAACCTCT

[0137] HbTFL1-2OR(XmaI):CCC GCGCCTTCTTGCAGCA

[0138] HbTFL1-3OF(EcoRI):G ATGGCAAGAATAATAGAACCTCT

[0139] HbTFL1-3OR(XmaI):CCC GCGTCTTCTTGCAGCA

[0140] HbCEN1OF(EcoRI):G ATGGCGAAGACAACAGATCCTC

[0141] HbCEN1OR(XmaI):CCC GCGCCTCCTTGCAGC

[0142] HbCEN2OF(EcoRI):G ATGGCCAAGACTTCAGACCCTC

[0143] HbCEN2OR(PstI):TGCA GCGTCTCCTTGCTG

[0144] 5个基因的正引物5’端分别加有EcoRI酶切位点。对于反引物，HbTFL1-1、HbTFL1-2、HbTFL1-3和HbCEN1的5’端都分别加有XmaI酶切位点，而HbCEN2的5’端则加有PstI酶切位点。将获得的PCR产物与pMD19载体连接并进行测序。最后，提取测序正确的质粒，用EcoRI和XmaI分别双酶切pXCS载体和测序正确的HbTFL1-1、HbTFL1-2、HbTFL1-3和HbCEN1质粒，并用T4DNA连接酶分别将pXCS载体和目的基因连接，与此同时，用EcoRI和PstI分别双酶切pXCS载体和测序正确的HbTFL1-2质粒，用T4DNA连接酶连接。最后分别构建了5个目标基因的植物表达载体，命名为pXCS-HbTFL1-1/tfl1-1，pXCS-HbTFL1-2/tfl1-1，pXCS-HbTFL1-3/tfl1-1，pXCS-HbCEN1/tfl1-1，pXCS-HbCEN2/tfl1-1。

[0145] 之后，将含有5个目标基因的植物表达载体分别导入根癌农杆菌GV3101(PMP90RK)中(由中国热带农业科学院橡胶研究所保存)。

[0146] 将构建好的5个目标基因植物表达载体分别转化拟南芥tfl1-1突变体中，参照文献(Clough，S.J.and Bent，A.F.(1998)Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J.16:735-743.)。获得的T0代种子，先将其用自来水浸泡，并放置于4℃环境暗室里春化3天。之后播撒在经1/2M培养基浸泡过的蛭石上面于22℃长日照环境生长(16h/8h)，待小苗发芽时，用浓度为10g/L的除草剂进行喷洒，以便筛选抗性植株。10天后，将生长正常的小苗移栽到营养土(营养土：蛭石＝2：1)中生长并等待收种。

[0147] 5个tfl1-1突变体转基因植株分别和野生型、tfl1-1突变体植株在相同环境中培养，并分别比较它们和野生型，tfl1-1突变体植株的开花表型。

[0148] 结果显示：tfl1-1突变体植株开花时间为27天左右，野生型植株开花时间为32天左右，而5个tfl1-1突变体转基因植株都能有效地延迟开花时间，并长于32天，如图7和8所示。

[0149] 结论：

[0150] 本发明首次在巴西橡胶树中获得5个TFL1-like基因。3个TFL1-like基因有不同的组织表达特异性；在开花季节(3月份)，3个基因在10年树中各自营养器官中的表达明显低于3个月大的树和2年树；同时3个基因在花序发育过程中都随着花序的发育不断升高。在开花的雄花和雌花中，3个基因的表达都明显高于刚刚分化的花序但各自在雄花和雌花中的表达水平却不相同。HbTFL1-1在雄花和雌花中表达差不多，HbTFL1-2在雌花中表达明显高于在雄花中的表达；而HbTFL1-3则在雄花中的表达非常显著的高于雌花中的表达。这些结果推测这3个基因可能同时参与了橡胶树童期的维持及花序发育，与此同时，HbTFL1-2和HbTFL1-3可能对雌花和雄花的发育分别起着不同的作用。对于2个CEN-like基因来说，它们在橡胶树营养器官中有着类似的表达模式，但不完全相同。在3个月大小苗中二者主要在根、茎和芽中表达。随着随着生长发育，二者表现出的表达趋势分为三种。第一，在根中，二者都随着年龄增加表达逐渐降低，在2年树中降低为零。第二，在茎中，二者表现出先升高后降低的趋势；在芽中，HbCEN1表现出先升高后降低的表达趋势，而HbCEN2则表现出随着年龄增加逐渐降低的趋势。在花序发育过程中，二者表现出相似的表达模式，即随着花序的发育它们的表达逐渐降低，尤其是HbCEN1，表达趋势非常明显。这些结果推测，这两个基因很有可能参与维持橡胶树营养生长。通过对拟南芥野生型遗传转化表明，5个基因都能明显影响拟南芥营养生长和花序的发育。同时，5个基因在tfl1-1突变体植株中过表达，tfl1-1突变表型皆能被有效地恢复为野生型表型，甚至出现延迟开花或者不开花表型。总之，无论从橡胶树营养生长还是从进入生殖生长的花序发育阶段来看，5个基因的高表达对橡胶树童期的维持和/或者对花序发育都有非常重要的作用。而这些作用在转基因拟南芥中都得以体现。因此这5个可作为巴西橡胶树非常有用的开花调控候选基因，可通过功能获得突变或者功能缺失突变研究实现对橡胶树开花的有效调控。

[0151] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。