一种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备及其应用

摘要

本发明公开了一种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备及其应用。以亚麻籽为原料，经亚麻籽粉碎—壳仁分离—微波辅助热水提取—Sevage法脱蛋白—乙醇沉淀—冷冻干燥得到亚麻籽粗多糖，经过“离子交换柱层析—葡聚糖凝胶柱层析—超滤”制备出亚麻籽硫酸酯多糖。本发明所得的FHP‑1组分均一，分子量为2626kDa。本发明首次从亚麻籽中分离到具有硫酸酯和三螺旋结构的多糖。通过细胞生物学实验证明该多糖能够降低乙肝表面抗原、乙肝e抗原的表达和抑制乙肝病毒DNA的复制，能激活免疫应答，提高免疫细胞分泌肿瘤坏死因子TNF‑a、白细胞介素IL‑6、IL‑12及炎症因子NO。

权利要求

1.一种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)亚麻籽壳仁分离：亚麻籽经粉碎、过20目筛后，亚麻籽粉与甘油和乙醇充分混和，其中甘油和乙醇体积比为15：3～4，离心20～30min，分别收集上层亚麻籽仁和沉积在底层的亚麻籽壳；

(2)亚麻籽多糖的提取：以步骤(1)获得的亚麻籽壳为原料，微波辅助热水浸提多糖，提取液过100目筛，收集浓缩液，真空冷冻干燥；微波辅助热水浸提的条件为：料液比1:20～1:

30g/mL、浸提温度60～100℃、浸提时间40～60min、输出功率600～800W、搅拌速度600～

900r/min；

(3)亚麻籽多糖的分离：将步骤(2)冷冻干燥后的粗提物用Sevage法脱蛋白25～30次，

3500～5000r/min离心20～30min，取上清液；向上清液中加入无水乙醇，静置沉淀4～12h，

3500～5000r/min离心20～30min，取沉淀，真空冷冻干燥后得到亚麻籽壳粗多糖；

(4)亚麻籽多糖的纯化：将步骤(3)获得的亚麻籽壳粗多糖配成5～8mg/mL溶液，用层析柱A纯化，水洗并用苯酚硫酸法检测多糖，合并糖反应阳性收集液，50～60℃旋转蒸发浓缩，透析后真空冷冻干燥；将干燥后的多糖配成2～5mg/mL溶液，用层析柱B纯化，用蒸馏水洗脱，收集多糖组分，透析，超滤，浓缩、冷冻干燥，得到所述具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖；所述柱层析A为DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱，所述层析柱B为Sephadex G-

100葡聚糖凝胶柱。

2.根据权利要求1所述的一种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的Sevage试剂的配制方法为将氯仿、正丁醇按体积比3：1～5：1混合。

3.根据权利要求1所述的一种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的Sevage法脱蛋白的方法具体为：将步骤(2)冷冻干燥后的粗提物与Sevage试剂按体积比1：1～1：3混合，振摇20～30min，3500～5000r/min离心20～30min，取出上层溶液，把所得上层溶液重复如下处理过程25～30次：与Sevage试剂按体积比1：1～1：

3混合，振摇20～30min，3500～5000r/min离心20～30min，取上层溶液。

4.根据权利要求1所述的一种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的无水乙醇加入量为亚麻籽壳粗多糖溶液体积的3～5倍，加入无水乙醇后于4℃下静置沉淀4～12h。

5.根据权利要求1所述的一种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述超滤过程中所用的膜截留分子量为1×106Da；所述透析时间为48小时，透析袋截留分子量为3000～5000Da。

6.权利要求1至5任一项所述制备方法获得的具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖，其特征在于，所述具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖组分均一，经凝胶渗透色谱测定其平均分子量为2626kDa，经衍生化后气相测定发现其主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖和岩藻糖七种单糖组成。

7.根据权利要求6所述的具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖，其特征在于，所述具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖具有三螺旋结构及硫酸酯基团的特殊结构，同时具有抗乙肝病毒和增强免疫应答的功能。

8.权利要求6所述的具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖在制备预防乙肝病毒HBV感染，治疗免疫缺陷或改善免疫力低下的功能性食品中的应用。

说明书

一种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药和功能性食品领域，具体涉及一种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备及其应用。

背景技术

[0002] 亚麻(Linum ustitatissimum L.)又称胡麻，属亚麻科、亚麻属植物。作为一种传统的油料作物，亚麻籽富含不饱和脂肪酸、必需氨基酸、维生素E及糖类化合物等多种营养成分，其中多糖类物质主要存在于亚麻籽壳中，含量随产地和品种不同而有所差异。

[0003] 多糖又称多聚糖(Polysaccharide)，是由10个以上的单糖通过糖苷键连接而成的一种高分子化合物，其相对分子质量为数万至数百万。多糖在自然界分布极广，在高等植物、藻类、菌类及动物体内均有存在，如真菌多糖、植物多糖、动物多糖、藻类多糖、细菌多糖等，是自然界含量最丰富的生物聚合物，已知的天然多糖化合物约有300多种。多糖具有多种生物学功能，如细胞特异性识别，细胞表面对各种抗原和药物的受体，激活免疫细胞等，尤其是植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血糖等多种生物活性，愈来愈引起人们的兴趣。植物多糖作为天然活性物质，最大优点是毒副作用小，来源广泛。此外，研究表明，具有硫酸酯结构的多糖通常表现出较强抗病毒活性，而具有三螺旋结构的多糖其免疫调节功能要显著高于其它多糖。多糖类物质具有广泛多样化的生理功能且对机体几乎没有毒副作用，是理想的药物赋形剂。

[0004] 传统亚麻籽多糖的提取多采用热水浸提法，目前公开的与亚麻籽多糖提取相关的专利有：中国专利申请公布号CN1221771、CN1242952、CN1263139，这些专利涉及的内容都是关于传统的热水浸提亚麻籽胶工艺的改进，所提取的亚麻籽多糖未发现有硫酸酯基团和三螺旋高级结构。

发明内容

[0005] 为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备方法。

[0006] 本发明的另一个目的在于提供上述制备方法获得的具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖。

[0007] 本发明的再一个目的在于提供上述具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的应用。

[0008] 为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

[0009] 一种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备方法，包括以下步骤：

[0010] (1)亚麻籽壳仁分离：亚麻籽经粉碎机粉碎后，过筛，将过筛后的亚麻籽粉与甘油和乙醇充分混和，离心20～30min，分别收集上层亚麻籽仁和沉积在底层的亚麻籽壳；

[0011] (2)亚麻籽多糖的提取：以步骤(1)获得的亚麻籽壳为原料，微波辅助热水浸提多糖，提取液过筛，收集浓缩液，真空冷冻干燥；

[0012] (3)亚麻籽多糖的分离：将步骤(2)冷冻干燥后的粗提物用Sevage法脱蛋白25～30次，3500～5000r/min离心20～30min，取上清液；向上清液中加入无水乙醇，静置沉淀(即醇沉)4～12h，3500～5000r/min离心20～30min，取沉淀，真空冷冻干燥后得到亚麻籽粗多糖；

[0013] (4)亚麻籽多糖的纯化：将步骤(3)获得的亚麻籽壳粗多糖配成5～8mg/mL溶液，用层析柱A纯化，水洗并用苯酚硫酸法检测多糖，合并糖反应阳性收集液，50～60℃旋转蒸发浓缩，透析后真空冷冻干燥；将干燥后的多糖配成2～5mg/mL溶液，用层析柱B纯化，用蒸馏水洗脱，收集多糖组分，透析，超滤，浓缩、冷冻干燥，得到所述具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖(FHP-1)。

[0014] 步骤(1)所述的亚麻籽壳仁分离是根据不同体积比的甘油和乙醇(15：3～4)利用密度差实现亚麻籽壳仁的有效分离，亚麻籽粉碎后过20目筛。

[0015] 步骤(2)所述的微波辅助热水浸提的条件为：料液比1:20～1:30(w/v)、浸提温度60～100℃、浸提时间40～60min、输出功率600～800W、搅拌速度600～900r/min；微波辅助热水浸提所得的提取液过100目筛。

[0016] 步骤(3)所述的Sevage试剂的配制方法为将氯仿、正丁醇按体积比3：1～5：1混合。

[0017] 步骤(3)所述的Sevage法脱蛋白的方法具体为：将步骤(2)冷冻干燥后的粗提物与Sevage试剂按体积比1：1～1：3混合，振摇20～30min，3500～5000r/min离心20～30min，取出上层多糖溶液；再按上述步骤重复25～30次(即把所得上层溶液重复如下处理过程25～30次：与Sevage试剂按体积比1：1～1：3混合，振摇20～30min，3500～5000r/min离心20～
30min，取上层溶液)。

[0018] 步骤(3)所述的无水乙醇加入量为亚麻籽壳粗多糖溶液体积(是指上层溶液)的3～5倍，加入无水乙醇后于4℃下静置沉淀4～12h。

[0019] 上清液有3层，下面那层是澄清的(有机试剂)，中间那层是白色乳化层(蛋白层)，最上面那层是亚麻籽壳粗多糖多糖溶液。

[0020] 步骤(4)所述的亚麻籽多糖纯化过程中所用柱层析A为DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱，所述层析柱B为Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱；所述超滤过程中所用的膜截留分子量为1×106Da；所述透析时间为48小时，透析袋截留分子量为3000～5000Da。

[0021] 上述制备方法获得的具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖(FHP-1)，所述亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)组分均一，经凝胶渗透色谱(GPC)测定其平均分子量为2626kDa，经衍生化后气相测定发现其主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖和岩藻糖七种单糖组成。

[0022] 所述具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖具有三螺旋结构及硫酸酯基团的特殊结构，同时具有抗乙肝病毒和增强免疫应答的功能。

[0023] 所述具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖(FHP-1)同时具有抗乙肝病毒和增强免疫应答的功能，可将其作为预防乙肝病毒HBV感染、治疗免疫缺陷或改善免疫力低下的功能性食品。

[0024] 与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

[0025] (1)本发明在传统的热水浸提法中引入微波辅助提取技术，利用微波热效应使萃取体系中的溶剂更高效地破坏亚麻籽壳表皮组织中的细胞壁，使多糖内容物更好地被提取出来。本方法与传统的热水浸提法(温度、料液比相同的条件下)相比，得到相同提取率的亚麻籽硫酸酯多糖，提取时间缩短了6～8倍，大大地提高了提取效率。

[0026] (2)为了深入开发利用亚麻籽资源，我们还对分离纯化后亚麻籽硫酸酯多糖进行了化学结构鉴定、抗病毒试验以及免疫调节活性试验。本发明首次利用不同比例的甘油和乙醇实现了亚麻籽壳仁的有效分离，结构鉴定中首次发现亚麻籽硫酸酯多糖具有三螺旋高级结构及硫酸酯基团，并首次证明了亚麻籽硫酸酯多糖具有抗乙肝病毒活性和免疫调节活性，在预防HBV的药品及提高机体免疫功能的食品和保健品领域有广阔的应用前景。

[0027] 亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)经刚果红实验分析，FHP-1与刚果红形成络合物的最大吸收波长同空白对照刚果红相比发生红移。表明FHP-1能与刚果红形成络合物，有规则的三螺旋构象。元素分析表中含有0.85％的S元素，经硫酸钡比浊法测定FHP-1中的硫酸基含量为2.63％，结合红外图谱中，1244cm-1为S＝O伸缩振动，823.71cm-1硫酸基位于单糖残基的平伏位置，表明亚麻籽硫酸酯多糖FHP-1中存在少量的硫酸酯结构。

[0028] 毒性试验显示，本发明亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)多糖在1000mg/mL浓度下对HepG2.2.15、RAW264.7细胞无细胞毒性；添加了FHP-1的药物组与空白对照相比，能明显够降低乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝e抗原(HBeAg)的表达和抑制乙肝病毒DNA的表达水平，同时FHP-1显著提高小鼠巨噬细胞Raw264.7分泌肿瘤坏死因子TNF-a、白细胞介素IL-6、IL-12及炎症因子NO，具有显著的抗病毒活性和免疫调节功能，可用于作为预防HBV的药品以及提高机体免疫功能的食品和保健品。本发明公布的亚麻籽硫酸酯多糖制备方法简单可靠，可大规模生产。

[0029] (3)本发明亚麻籽原料来源广泛，方法简单可靠，产品安全性高，无毒副作用，可大批量生产，有望开发成预防乙型肝炎的药品及提高机体免疫力的功能性食品。

附图说明

[0030] 图1是亚麻籽硫酸酯多糖的提取纯化及应用技术流程图。

[0031] 图2是亚麻籽壳表面的扫描电镜图，其中a为微波辅助提取前，b为微波辅助提取后。

[0032] 图3是亚麻籽粗多糖纯化DEAE-Sepharose Fast Flow洗脱曲线。

[0033] 图4是亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)的GPC图谱。

[0034] 图5是亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)的单糖组成测定图谱，其中a是单糖标品气相图，b是FHP-1水解衍生化后的气相图。

[0035] 图6是亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)刚果红实验图。

[0036] 图7是亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)红外图谱。

[0037] 图8测定的是亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)对HepG2.2.15细胞的抗病毒活性的影响，阳性对照拉米夫定的浓度为20μg/mL，其中a是亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)对HepG2.2.15细胞存活率的影响图；b、c、d分别是亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)对HbeAg、HBsAg以及DNA的影响图。

[0038] 图9测定的是亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)对RAW264.7细胞的免疫活性的影响，阳性对照脂多糖的浓度为50μg/mL，其中a是亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)对RAW264.7细胞存活率的影响；b、c、d、e分别是亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)对IL-12、TNF-α、IL-6、NO诱生的影响图。

具体实施方式

[0039] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0040] 实施例1：制备亚麻籽硫酸酯多糖

[0041] 按照以下步骤制备亚麻籽硫酸酯多糖：

[0042] (1)亚麻籽壳仁分离：亚麻籽经粉碎机粉碎后，过筛，将过筛后的亚麻籽粉与甘油和乙醇充分混和，离心20min，分别收集上层亚麻籽仁和沉积在底层的亚麻籽壳；

[0043] (2)亚麻籽多糖的提取：取250g步骤(1)获得的亚麻籽壳为原料，料液比1:20(g/mL)、浸提温度60℃、浸提时间40min、输出功率600W、搅拌速度600r/min条件下进行微波辅助热水浸提多糖，提取液过100目筛，收集浓缩液，真空冷冻干燥；

[0044] (3)亚麻籽多糖的分离：将步骤(2)冷冻干燥后的粗提物用Sevage法脱蛋白25次，3500r/min离心20min，取上清液；向上清液中加入3倍体积的无水乙醇，4℃下醇沉4h，
3500r/min离心20min，取沉淀，真空冷冻干燥后得到亚麻籽壳粗多糖约8.35g；

[0045] (4)亚麻籽多糖的纯化：将步骤(3)获得的亚麻籽壳粗多糖配成5mg/mL溶液，上样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱(洗脱曲线如图3所示)，依次用0～2.0mol/L NaCl溶液阶梯式洗脱，分管收集，并用苯酚硫酸法检测多糖，合并糖反应阳性收集液，50℃旋转蒸发浓缩，透析48h(3000～5000Da)后真空冷冻干燥；将干燥后的多糖配成2mg/mL溶液，上样于Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱，用蒸馏水洗脱，收集多糖组分，再次透析后经截留分子量为1×106Da的膜超滤，分别收集截留液，浓缩、冷冻干燥得分子量大于1×106Da的样品亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)。

[0046] 实施例2：制备亚麻籽硫酸酯多糖

[0047] 按照以下步骤制备亚麻籽硫酸酯多糖：

[0048] (1)亚麻籽壳仁分离：亚麻籽经粉碎机粉碎后，过筛，将过筛后的亚麻籽粉与甘油和乙醇充分混和，离心30min，分别收集上层亚麻籽仁和沉积在底层的亚麻籽壳；

[0049] (2)亚麻籽多糖的提取：取250g步骤(1)获得的亚麻籽壳为原料，料液比1:30(g/mL)、浸提温度100℃、浸提时间60min、输出功率800W、搅拌速度900r/min条件下进行微波辅助热水浸提多糖，提取液过100目筛，收集浓缩液，真空冷冻干燥；

[0050] (3)亚麻籽多糖的分离：将步骤(2)冷冻干燥后的粗提物用Sevage法脱蛋白30次，5000r/min离心30min，取上清液；向上清液中加入5倍体积的无水乙醇，4℃下醇沉12h，
5000r/min离心30min，取沉淀，真空冷冻干燥后得到亚麻籽壳粗多糖约11.55g；

[0051] (4)亚麻籽多糖的纯化：将步骤(3)获得的亚麻籽壳粗多糖配成10mg/mL溶液，上样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱(洗脱曲线如图3所示)，依次用0～2.0mol/L NaCl溶液阶梯式洗脱，分管收集，并用苯酚硫酸法检测多糖，合并糖反应阳性收集液，60℃旋转蒸发浓缩，透析48h(3000～5000Da)后真空冷冻干燥；将干燥后的多糖配成5mg/mL溶液，上样于Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱，用蒸馏水洗脱，收集多糖组分，再次透析后经截留分子量为1×106Da的膜超滤，分别收集截留液，浓缩、冷冻干燥得分子量大于1×106Da的样品亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)。

[0052] 实施例3：亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)纯度鉴定

[0053] 采用GPC对实施例2分离纯化得到的亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)进行纯度测定。具体测试条件和方法如下：采用TSK G-5000PWXL和TSK G-3000PWXL色谱柱串联2414型示差折光检测器，柱温为35℃，流动相为0.02mol/L的KH2PO4，流速为0.6mL/min。准确称取样品2.0～2.5mg，溶于1mL流动相中，过0.22μm滤膜，手动进样10μL，GPC图谱如图4所示。根据色谱图判定该多糖组分的纯度，结果显示纯化后的FHP-1为均一分子量多糖，分子量大约为2626kD。

[0054] 实施例4：亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)的单糖组成测定

[0055] 取10mg实施例2制备的亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)样品，添加4.0mL的2mol/L三氟乙酸100～120℃水解6～8h后成为单糖，再加入吡啶0.5mL，于90℃反应0.5h，冷却后再加0.5mL乙酸酐于90℃反应0.5h，冷却后加水和氯仿萃取3次，取氯仿层蒸干，残渣用氯仿溶解，0.22μm真空过滤器过滤，进行GC分析。气相色谱条件：HP-5石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)；载气为N2；进样量：1μL；流速是1mL/min；不分流，进样口温度：250℃；FID检测器的温度设置为250℃；程序升温：初始温度100℃，保持0.5min，以3℃/min升至160℃，改变升温速度，继续升温。以10℃/min的速度升到250℃，并保持5min。FHP-1单糖组成测定结果如图5所示，结合单糖标准品气相谱图，显示FHP-1主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、岩藻糖七种单糖组成。

[0056] 实施例5：亚麻籽壳扫描电镜图及刚果红实验分析

[0057] 随机选取浸提前后的亚麻籽壳1～2mg，置于铜台上，利用扫描电镜对比微波辅助提取前后亚麻籽壳表面变化，如图2所示，对比微波辅助提取前(a)与提取后(b)，亚麻籽壳由表面光滑的胶质薄膜明显变得凸凹不平，可能是由于微波透过萃取介质到达物料内部，导致细胞内压超过细胞壁所能承受的压力，造成细胞破裂，使得内部活性成分游离出来。

[0058] 取一定量实施例2制备的FHP-1多糖配成2mL 1～2mg/mL的溶液，加入2mL的刚果红试剂(100μmol/L)，逐渐加入NaOH溶液(1mol/L)，使得碱的终浓度从0mol/L慢慢地上升到0.5mol/L，记录全波长扫描并做空白对照，结果如图6所示，FHP-1与刚果红形成络合物的最大吸收波长同空白对照刚果红相比发生红移，表明FHP-1能与刚果红形成络合物，有规则的三螺旋构象，而具有三螺旋构象的有序结构是其具有免疫活性的重要因素。

[0059] 实施例6：元素分析、硫酸钡比浊法测定硫酸基含量及红外图谱分析

[0060] 取3～5mg左右的实施例2制备的FHP-1多糖，置于锡杯中，进行元素分析，结果见表1，其中硫元素含量达0.85％，比同类多糖含量都要高。硫酸钡比浊法中硫酸基含量标准曲线为y＝0.259x-0.014，R2＝0.990，线性关系良好，经计算FHP-1中的硫酸基含量为2.63％。

[0061] 表1 FHP-1元素分析结果

[0062]

[0063] 取3～5mg实施例2制备的FHP-1多糖与溴化钾混合研磨压片，室温条件下在4000～400cm-1范围内进行红外光谱扫描，扫描结果如图7所示，其中1244cm-1是S＝O伸缩振动，820～850cm-1是C-O-S振动特征频率，823.71cm-1表示硫酸基位于单糖残基的平伏位置，结合前面的元素分析以及硫酸钡比浊法测定结果证明亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)中存在少量的硫酸酯结构，硫酸酯多糖具有广泛的生物学性质，包括抗病毒、抗肿瘤、对免疫系统作用和抗凝活性。

[0064] 实施例7：亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)抗病毒活性试验

[0065] MTT实验取活化的对数生长期HepG2.2.15细胞以1×106个/mL浓度接种于96孔板，置于5％CO2，37℃条件下培养，24h后，换加亚麻籽硫酸酯多糖药物组150μL，以不加药物组作为空白对照，继续培养。24h后加入20μL MTT溶液，继续培养4h后终止培养，吸去孔内培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。

[0066] 细胞存活率计算公式如下：

[0067] 存活率＝A1/A0，其中A1为样品组平行试验的吸光值，A0为对照组平行试验的吸光值。

[0068] 亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)对HepG2.2.15细胞存活率的影响如图8的(a)所示，存活率都大于90％，说明FHP-1对HepG2.2.15细胞无抑制作用。

[0069] 取活化的对数生长期HepG2.2.15细胞，用6cm培养板培养，每个培养板细胞数为50万。24h后加亚麻籽硫酸酯多糖药物组，以不加药物组为阴性对照，加20μg/mL的拉米夫定作为阳性对照。培养24h收集培养上清液，并加入新的细胞液培养。将上清液稀释100倍以检测HBsAg，稀释10倍检测HBeAg，并检测不同浓度组上清液中的HBV-DNA的含量。HBeAg和HBsAg的检测按对应的试剂盒说明书操作，HBV-DNA的检测按普通QPCR的试剂盒说明书操作。在酶标仪于450nm处测量各孔的吸光值，结果分别如图8的(b)、(c)、(d)所示。结果表明加了FHP-1的药物组与空白对照相比明显的抑制了HBeAg、HBsAg的分泌和HBV-DNA的复制，对抗HBV病毒有显著作用。

[0070] 实施例8：亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)免疫活性试验

[0071] MTT实验RAW264.7以细胞以1×106个/mL浓度接种于96孔板，于5％CO2，37℃条件下培养，24h后，去除上清液换新鲜培养液，加入20μL的亚麻籽硫酸酯多糖药物，以不加药物组作为空白对照，加20μg/mL的脂多糖作为阳性对照继续培养。24h后加入20μL MTT溶液，继续培养4h后终止培养，吸去孔内培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。结果如图9的(a)所示，亚麻籽硫酸酯多糖(FHP-1)对RAW264.7细胞存活率的影响存活率都大于90％，说明FHP-1对RAW264.7细胞无抑制作用。

[0072] 将小鼠腹腔巨噬细胞加入96孔板中培养24h，加入待测样品100μL继续培养36h，后续实验按照相应的IL-6，IL-12，TNF-α、NO酶联反应试剂盒的操作进行试验，结果分别如图9的(d)、(b)、(c)、(e)所示。结果显示，药物组与空白对照组相比，药物组显著提高了小鼠巨噬细胞Raw264.7分泌肿瘤坏死因子TNF-a、白细胞介素IL-6、IL-12及炎症因子NO，具有显著的抗病毒活性和免疫调节功能。

[0073] 毒性试验显示，本发明FHP-1多糖在1000mg/mL浓度下对HepG2.2.15、RAW264.7细胞无细胞毒性；添加了FHP-1的药物组与空白对照相比，能明显够降低乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝e抗原(HBeAg)的表达和抑制乙肝病毒DNA的表达水平，同时，FHP-1显著提高小鼠巨噬细胞Raw264.7分泌肿瘤坏死因子TNF-a、白细胞介素IL-6、IL-12及炎症因子NO，具有显著的抗病毒活性和免疫调节功能，可用于作为预防HBV的药品以及提高机体免疫功能的食品和保健品。本发明公布的亚麻籽多糖制备方法简单可靠，可大规模生产。

[0074] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。