一种抗凝血黑莓籽多糖及其提取分离方法、应用

摘要

本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种抗凝血黑莓籽多糖及其提取分离方法、应用。该提取分离方法将黑莓籽粉碎后，用水提醇沉的方法得到粗多糖，再分别通过DEAE-52纤维素柱色谱和SephadexG-100凝胶柱色谱得到三个多糖。本发明采用特殊的提取分离方法从黑莓籽中分离得到三个多糖，并对这三个多糖的体外凝血效果进行考察，结果表明，这三个多糖均有良好的抗凝血效果。

权利要求

1.抗凝血黑莓籽多糖的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将黑莓籽粉碎，室温下用石油醚脱脂，挥干石油醚后，药渣用乙醇提取，过滤，阴干残渣，然后向残渣中加入蒸馏水提取，趁热抽滤，合并滤液后减压浓缩，再向浓缩液中加入乙醇，静置离心，得到的沉淀加蒸馏水溶解透析以除去小分子杂质，减压浓缩，冷冻干燥即得黑莓籽粗多糖；

（2）取黑莓籽粗多糖溶于蒸馏水中，过滤，弃去杂质后加入到DEAE-52纤维素色谱柱，依次用蒸馏水、0.1mol/L氯化钠溶液和0.2 mol/L氯化钠溶液进行洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测490 nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，透析、浓缩后冷冻干燥；其中，蒸馏水洗脱峰为组分1，0.1 mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分2，0.2 mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分3；

（3）组分1溶于蒸馏水中、过滤弃去杂质，加入到Sephadex G-100凝胶色谱柱，用蒸馏水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法进行检测，在波长490 nm处测其吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，得到两组洗脱峰，浓缩第2组洗脱峰，冷冻干燥得到的多糖命名为BSP-2；

（4）组分2和3均采用步骤（3）组分1的方法进行洗脱，得单一洗脱峰，分别命名为BSP-3和BSP-4；

BSP-2、BSP-3和BSP-4即为抗凝血黑莓籽多糖。

2.利用权利要求1的方法制备得到的抗凝血黑莓籽多糖。

3.权利要求2所述抗凝血黑莓籽多糖在制备抗凝血药物方面的应用。

说明书

一种抗凝血黑莓籽多糖及其提取分离方法、应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种抗凝血黑莓籽多糖及其提取分离方法、应用。

背景技术

[0002] 黑莓Rubus spp.Blackberry为蔷薇科悬钩子属聚合果类植物，未作药用，是世界上新兴的4种小果类果树之一，原产北美，其果实酸甜可口，具有很高的营养价值和药用价值，除鲜食外还大部分制成速冻果、果汁、果酒和果酱等食品。文献检索发现对黑莓研究主要集中在果实挥发油、黑莓籽油脂肪酸成分和黑莓叶、种子中黄酮、花色苷及维生素E含量分析方面。

[0003] 黑莓籽是黑莓果酒、黑莓汁等加工产品的副产物，含有约27.14%的功能性油脂，其中不饱和脂肪酸总量高达93.55%，此外还有人体必需的氨基酸，在对抗动脉粥样硬化、抗糖尿病、免疫调节、促进生长和智力发育等方面具有重要的作用。

[0004] 凝血的实质是呈水溶性的纤维蛋白原转变为水中不溶解的固态纤维蛋白的过程，是在内源性或（和）外源性凝血途径下产生凝血酶原激活物，在凝血因子的作用下产生凝血酶，最后在凝血酶的作用下使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。PT主要反映的是外源性凝血途径中凝血因子I、II、V、VII、X的活性；APTT主要反映内源性凝血系统状况，与VIII、X、XI、XII等内源性凝血因子活性有关；TT值是主要反映纤维蛋白原转变为纤维蛋白程度的重要指标；FIB主要反映纤维蛋白原的含量。

[0005] 血栓形成是许多疾病如心肌梗死、缺血性卒死、深静脉血栓等的基本病理过程，它严重地危害着人类的健康，它的形成与血小板的聚集、粘附、内源性和外源性凝血系统以及纤维蛋白的形成密切相关。根据世界卫生组织的调查报告，由于动脉粥样硬化导致的血栓疾病引起的死亡已经排到了第一位。动脉血栓是由于动脉粥样硬化，斑块不稳定发生了斑块的破裂，使血液里的血小板发生聚集，激活了体内的凝血系统，最后导致血栓形成。一旦堵塞以后就会发生组织的缺血和坏死，产生严重的后果。在动脉血栓性疾病的急性或特殊状态下，需要辅助使用抗凝血药物，才能达到更好的抗血栓效果。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种从黑莓籽中提取的抗凝血黑莓籽多糖，同时提供该多糖的提取分离方法、应用。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

[0008] 抗凝血黑莓籽多糖的提取分离方法，包括以下步骤：（1）将黑莓籽粉碎，室温下用石油醚脱脂3次，挥干溶剂石油醚后，药渣用70 %乙醇提取3次，过滤，阴干残渣，然后向残渣中按料液质量体积比为20 mL/g的比例加入蒸馏水提取（80 ℃下提取3次，一次3 h），趁热抽滤，合并滤液后减压浓缩，再向浓缩液中加入95%乙醇调至乙醇的终浓度为70 %，4 ℃静置24 h后离心（10000 r/min，10 min），得到的沉淀加蒸馏水溶解透析（48 h，每4 h换一次蒸馏水）以除去小分子杂质，减压浓缩，冷冻干燥即得黑莓籽粗多糖；

[0009] （2）取300 mg的黑莓籽粗多糖溶于10mL蒸馏水中，过滤，弃去杂质后加入到DEAE-52纤维素色谱柱(2.5*60 cm)，依次用蒸馏水、0.1mol/L氯化钠溶液和0.2 mol/L氯化钠溶液进行洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测490 nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线(图2)，合并同一洗脱峰的多糖样品，透析、浓缩后冷冻干燥；其中，蒸馏水洗脱峰为组分1，0.1 mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分2，0.2 mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分3；

[0010] （3）称取70 mg的组分1溶于5mL蒸馏水中、过滤弃去杂质，加入到Sephadex G-100凝胶色谱柱(1.5*100cm)，用蒸馏水进行洗脱（洗脱流速为0.5 mL/min，每管2 mL），采用苯酚-硫酸法进行检测，在波长490 nm处测其吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线（图3），得到两组洗脱峰，浓缩第2组洗脱峰，冷冻干燥得到的多糖命名为BSP-2；组分2和3均采用组分1的方法进行洗脱，得单一洗脱峰，分别命名为BSP-3和BSP-4；

[0011] BSP-2、BSP-3和BSP-4即为抗凝血黑莓籽多糖。

[0012] 其中DEAE-52纤维素色谱柱为：二乙氨基乙基型纤维素，是一种阴离子交换纤维素，常用于多糖纯化和分离。粗多糖溶液吸附于DEAE-52后，以不同离子强度的盐进行洗脱，根据多糖的离子交换能力差异进行分离。

[0013] 其中Sephadex G-100凝胶色谱柱为：是一种半合成的凝胶，基本骨架是以葡萄糖(右旋糖酐)为残基的多糖，在链状结构间，以3-氯-1,2-环氧丙烷为交联剂，以醚桥相互连接成为三维空间的网状高分子化合物。

[0014] 利用上述提取分离方法得到的抗凝血黑莓籽多糖。

[0015] 抗凝血黑莓籽多糖在制备抗凝血药物方面的应用。

[0016] 本发明采用特殊的提取分离方法从黑莓籽中分离得到多糖BSP-2、BSP-3和BSP-4，并对这三个多糖的体外凝血效果进行考察，结果表明，这三个多糖均有良好的抗凝血效果，且BSP-2和BSP-4的抗凝血效果比阳性对照灯盏花素好（P<0.001），BSP-3的抗凝血效果与阳性对照灯盏花素相当(P>0.05)，可见，它们可以单独或组合用于制备抗凝血剂。

附图说明

[0017] 图1为凝血机制图；

[0018] 图2 黑莓籽粗多糖DEAE-52洗脱曲线；

[0019] 图3 组分1的Sephadex G-100凝胶色谱柱洗脱曲线；

[0020] 图4 组分2的Sephadex G-100凝胶色谱柱洗脱曲线；

[0021] 图5 组分3的Sephadex G-100凝胶色谱柱洗脱曲线；

[0022] 图6标准单糖混合物的GC色谱图；

[0023] 图7 BSP-2水解物GC色谱图；

[0024] 图8 BSP-3水解物GC色谱图；

[0025] 图9 BSP-4水解物GC色谱图；

具体实施方式

[0026] 以下通过具体实施方式，对本发明的上述内容再做进一步的详细说明。

[0027] 黑莓籽购于河南省封丘县黑莓种植基地，为蔷薇科悬钩子属植物黑莓Rubus spp.Blackberry籽。

[0028] 本文中的乙醇浓度均为体积浓度。

[0029] 1、抗凝血黑莓籽多糖的提取分离方法，包括以下步骤：（1）将黑莓籽粉碎，室温下用石油醚脱脂3次，挥干溶剂石油醚后，药渣用70 %乙醇提取3次，过滤，阴干残渣，然后向残渣中按料液质量体积比为20 mL/g的比例加入蒸馏水提取，80 ℃下提取3次，一次3 h，趁热抽滤，合并滤液后减压浓缩，再向浓缩液中加入95%乙醇调至乙醇的终浓度为70 %，4 ℃静置24 h后离心（10000 r/min，10 min），得到的沉淀加蒸馏水溶解透析（48 h，每4 h换一次蒸馏水）以除去小分子杂质，减压浓缩，冷冻干燥即得黑莓籽粗多糖；

[0030] （2）取300 mg的黑莓籽粗多糖溶于10mL蒸馏水中，过滤，弃去杂质后加入到DEAE-52纤维素色谱柱(2.5*60 cm)，依次用蒸馏水、0.1mol/L氯化钠溶液和0.2 mol/L氯化钠溶液进行洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测490 nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线(图2)，合并同一洗脱峰的多糖样品，透析、浓缩后冷冻干燥；其中，蒸馏水洗脱峰为组分1，0.1 mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分2，0.2 mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分3；

[0031] （3）称取70 mg的组分1溶于5mL蒸馏水中、过滤弃去杂质，加入到Sephadex G-100凝胶色谱柱(1.5*100cm)，用蒸馏水进行洗脱（洗脱流速为0.5 mL/min，每管2 mL），采用苯酚-硫酸法进行检测，在波长490 nm处测其吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线（图3），得到两组洗脱峰，浓缩第2组洗脱峰，冷冻干燥得到的构成命名为BSP-2；组分2和3均采用组分1的方法进行洗脱，得单一洗脱峰（图4和5），分别命名为BSP-3和BSP-4；BSP-2、BSP-3和BSP-4即为抗凝血黑莓籽多糖。

[0032] 2抗凝血黑莓籽多糖（BSP-2、BSP-3、BSP-4）的分子量测定和组分分析：

[0033] 2.1、多糖样品BSP-2、BSP-3和BSP-4送至北京市理化分析测试中心检测，根据中华人民共和国药典（2010年版）二部附录VH（分子排阻色谱法）进行测定。BSP-2、BSP-3、BSP-4的Mw分别为2.696e+5、6.089e+4、3.406e+5。

[0034] 2.2单糖组成分析

[0035] 2.2.1多糖的水解

[0036] 准确称取10 mg的BSP-2、BSP-3、BSP-4分别溶于2 mL、2 mol/L的三氟乙酸中，再转移到5 mL安瓿瓶中，充氮气封管，于110 ℃下水解3 h，再用旋转蒸发除去三氟乙酸溶液，残余物中加入少量甲醇溶解，再旋转蒸发到干，如此反复3次，得到水解产物备用。

[0037] 2.2.2单糖的衍生化

[0038] 向水解产物中依次加入10 mg盐酸羟胺和0.5 mL吡啶，振荡混匀，放入90℃水浴中加热反应30 min。取出后冷却至室温，加入0.5 mL醋酸酐，在90℃下继续反应30 min进行乙酰化，反应产物经0.22 μm滤膜过滤后注入气相色谱进行分析；标准单糖用相同方法处理，并制成标准单糖衍生物混合液。

[0039] 2.2.3气相色谱条件

[0040] 色谱柱：Thermo TG-Waxms（30 m×0.32 mm，0.5 μm)；进样温度：250℃；FID检测器温度：280℃；色谱柱升温程序：初始温度100℃保持1 min，然后以4℃/min的速率由100℃升至230℃，保持10min； 载气：高纯氮气，流速2 mL/min；进样量为2 µL。

[0041] 2.2.4单糖组成分析结果

[0042] 标准单糖混合物的GC色谱图见图6，图7、8、9分为BSP-2、BSP-3、BSP-4经水解后的单糖GC色谱图，通过和标准单糖图谱中保留时间的比较可以确定样品的单糖组成。由图7可知，BSP-2至少由鼠李糖、阿拉伯糖和木糖构成，其摩尔比为鼠李糖：阿拉伯糖：木糖=0.236:0.433:0.140，由图8可知，BSP-3至少由鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、木糖构成，摩尔比为鼠李糖：果糖：阿拉伯糖：木糖=0.203:0.366:1.605:0.593 ，由图9可知，BSP-4至少有鼠李糖和阿拉伯糖构成，其摩尔比=0.851:0.733。

[0043] 3抗凝血黑莓籽多糖（BSP-2、BSP-3、BSP-4）的活性分析

[0044] 方法：家兔体外血浆凝血四项检测

[0045] 3.1仪器和材料

[0046] TGL-16gR高速台式冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；LRH-150生化培养箱(上海一恒科技有限公司)；氯化钠注射液（河北天成药业股份有限公司，A14091701）；0.109 mol/L枸橼酸钠溶液（自制）、维生素K1注射液(天津药业集团新郑股份有限公司，1403112)；注射用灯盏花素(湖南恒生制药有限公司，20110202)；凝血酶原时间（PT）测定试剂盒（105241）；活化部分凝血酶时间（APTT）测定试剂盒（112175）；凝血酶时间（TT）测定试剂盒（121132）；
纤维蛋白原（FIB）含量测定试剂盒（1320701）均由上海太阳生物技术有限公司生产。

[0047] 3.2实验动物

[0048] 獭兔，雄性，体重2.0～2.5 kg，由河南大学药学院中药研究所提供(医动字14-2-6号)。

[0049] 3.3样品溶液配制

[0050]  1 mg的样品（BSP-2、BSP-3、BSP-4）用200 μL溶剂溶解制5 mg/mL溶液。取灯盏花素8 mg用600 μL溶剂制得13.33 mg/mL，维生素K1注射液用溶剂溶解制得维生素K1浓度5 mg/mL的溶液。溶剂（也作为空白溶剂）为：无水乙醇:1,2-丙二醇:生理盐水=1:1:3（体积比）。

[0051] 3.4实验方法

[0052] 3.4.1对APTT影响的检测方法

[0053] 血浆的制备：家兔耳缘静脉取血3.6 mL，置于含有0.109 mol/L枸橼酸钠400 μL的4 mL离心管中，轻轻颠倒混匀，3000 rpm离心15 min，取上层清液备用。

[0054] 分别在不同测试杯中加入50 μL各个样品溶液，再加入100 μL血浆和37 ℃预温的APTT试剂100 μL，37 ℃孵育5 min后加入37℃预温的0.025 mol/L CaCl2溶液100 μL，记录凝固时间。

[0055] 3.4.2对PT影响的检测方法

[0056] 血浆制备方法同3.4.1，分别在不同测试杯中加入50 μL各个样品溶液，再加入100 μL的血浆，37℃孵育3 min后加入37℃预温的PT试剂200 μL，记录凝固时间，即为PT值。

[0057] 3.4.3对TT影响的检测方法

[0058] 血浆制备方法同3.4.1，分别在不同测试杯中加入50μL各个样品溶液和200 μL的血浆，孵育3min后加入TT试剂200 μL，记录凝固时间。

[0059] 3.4.4对FIB影响的检测方法

[0060] 血浆制备方法同3.4.1，按照试剂说明书定标准曲线。取200 μL血浆和200 μL样品，然后加入700 μL缓冲液。混匀后，取稀释后的血浆200μL，37℃预温3 min，加入凝血酶溶液100 μL，记录纤维蛋白原的含量。

[0061] 3.4.5数据处理

[0062] 结果采用算术平均值和标准差表示，数值统计采用SPSS19.0软件单因素方差分析法(One-Way ANOVA)比较其显著性差异。测定结果见表1。

[0063] 表1体外凝血四项结果

[0064]

[0065] 注:与空白比较###P＜0.001, 0.01＜##p＜0.05,#P＞0.05；

[0066] 与维生素K1比较，△△△P＜0.001, 0.01＜△△P＜0.05。

[0067] 由表1可知，BSP-2、BSP-3、BSP-4延长TT的效果与空白组相比有极显著差异（P<0.001），说明这三个多糖都有一定的抗凝血作用，且BSP-3的抗凝血效果与阳性对照灯盏花素相当（P>0.05），而BSP-2和BSP-4的抗凝血效果比阳性对照灯盏花素好（P<0.001）。