一种荔枝霜疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法和应用

摘要

本发明属于农作物病害防治及植物检疫领域，公开了一种荔枝霜疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法和在荔枝霜疫霉菌的早期诊断、病菌的监测和鉴定中的应用。该引物包括内引物对F3和B3，以及外引物对FIP和BIP，序列见SEQNO.1～SEQNO.4。本发明的检测方法结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高，适用于发病组织中荔枝霜疫霉菌的快速可靠的检测和鉴定，可直接用于带菌的植株高灵敏度快速检测，可用于荔枝霜疫霉菌的早期诊断、病菌的监测和鉴定中。本发明建立了荔枝霜疫霉菌快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系，对农业生产中荔枝霜疫霉菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。

权利要求

1.一种荔枝霜疫霉菌(Peronophythora litchi)LAMP引物，其特征在于包括内引物对F3和B3，以及外引物对FIP和BIP，序列如下所示：F3：5’-TGAGGACGTGTACTCGTTCC-3’；

B3：5’-CGCTCATACAGTGGGTGATC-3’；

FIP：

5’-AGCTAAACTGTGACCAGGGTGGCGTCTCCTTTTGGCTTCGTG-3’；

BIP：

5’-GTTACCCGGTCAGCTATGCTGGGCGGGCTTTGAACATCTTGT-3’。

2.一种基于权利要求1所述的荔枝霜疫霉菌LAMP引物的快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：以待检测样本的DNA为模板，利用所述的荔枝霜疫霉菌LAMP引物进行LAMP扩增反应，再通过荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行检测。

3.根据权利要求2所述的快速检测方法，其特征在于：所述LAMP反应体系为：25μL，其中F3与B3浓度分别为0.2μM，FIP与BIP浓度分别为1.6μM，20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2～4mM MgSO4，0.1％Tween-20，0～1.2M Betaine，1mM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段，10～50ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；反应条件为在60～65℃温育30～

90min，80℃保温5～10min。

4.根据权利要求2所述的快速检测方法，其特征在于：所述LAMP反应体系为：25μL，其中F3与B3浓度分别为0.2μM，FIP与BIP浓度分别为1.6μM，20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2～4mM MgSO4，0.1％Tween-20，0～1.2M Betaine，1mM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；反应条件为在65℃温育60min，80℃保温

10min。

5.根据权利要求2所述的快速检测方法，其特征在于：所述LAMP反应体系为：25μL，其中F3与B3浓度分别为0.2μM，FIP与BIP浓度分别为1.6μM，20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％Tween-20，0.2M Betaine，1mM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段，

25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；反应条件为在65℃温育60min，80℃保温

10min。

6.根据权利要求2所述的快速检测方法，其特征在于：所述荧光染料目测观察法：在LAMP反应的最终扩增产物中加入1μL显色剂，所述显色剂为SYBR Green Ⅰ，观察显示结果，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。

7.根据权利要求2所述的快速检测方法，其特征在于：所述的琼脂糖凝胶电泳法：取6μL LAMP反应的最终扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果，出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。

8.根据权利要求2所述的快速检测方法，其特征在于：所述待检测样本的DNA通过DNA抽提试剂盒法提取。

9.根据权利要求2所述的快速检测方法，其特征在于：当所述的待检测样本为菌体时，使用真菌DNA抽提试剂盒法提取；当所述的待检测样本为植物组织时，使用植物组织DNA抽提试剂盒法提取。

10.根据权利要求2～9任一项所述的快速检测方法在荔枝霜疫霉菌的早期诊断、病菌的监测和鉴定中的应用。

说明书

一种荔枝霜疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于农作物病害防治及植物检疫领域，特别涉及一种荔枝霜疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法和在荔枝霜疫霉菌的早期诊断、病菌的监测和鉴定中的应用。

背景技术

[0002] 荔枝(Litchii chinensis Sonn.)是原产于我国南部和越南北部著名的热带亚热带特产水果，在我国主要分布于广东、广西、福建、海南、台湾、四川、云南、贵州、浙江等省区。我国荔枝的种植面积和产量为世界之首，且大量出口。荔枝因其经济价值高，是我国在国际市场上最有竞争力的果品之一。随着荔枝连作和种植面积的扩大，荔枝产业的发展主要由真菌病害的发生和危害所影响，尤其是荔枝霜疫霉病(Peronophythora litchii Chen ex Ko et al.)，是荔枝上最常见的主要真菌性病害，已成为影响荔枝生产的限制因子之一。病菌主要危害近成熟的果实，也危害幼果、果柄、花穗和叶片，常造成大量烂果、落果和贮运期间果品损失，严重时烂果率达到30～80％，严重威胁了荔枝的产量与品质，并常与其他荔枝病害混合发生，给病害的诊断造成困难，而生产上则常因不明发病原因，难以有针对性的防治措施，故造成更为严重的危害。因此建立荔枝霜疫霉菌快速检测体系，早期对发病植株进行荔枝霜疫霉菌的快速准确检测，对预测病害发生情况、及时采取有效的防治措施控制病原菌的传播和流行、减少经济损失都具有重要的理论和实际意义。

[0003] 目前对荔枝霜疫霉菌的检测大多仍沿用传统的组织分离培养及形态学鉴定方法，但是，这种鉴定方法耗时长，并且分离成功率不高。若是多种病原菌复合侵染，所分离的病害样本不新鲜，则更难确诊病原菌，难以满足对荔枝霜疫霉病诊断的实际需要，这对病原菌的检测和防控十分不利。

[0004] 环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)是2000年由日本荣研株式会社Notomi等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。LAMP反应针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种链式置换活性的DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)，在恒温条件下(60～65℃)保温30～90分钟，即可完成扩增反应。由于LAMP反应的高效性和等温快速扩增的特点，在短短的30～90分钟内就能实现109～1010倍产物的扩增。LAMP扩增产物的检测一般采用荧光染料目测观察、琼脂糖凝胶电泳和浊度观察等方法。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道极少，荔枝霜疫霉的检测国内外均未见报道。

发明内容

[0005] 为了克服上述现有技术中荔枝霜疫霉菌的生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差，灵敏度低的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种荔枝霜疫霉菌(Peronophythora litchii)LAMP引物。

[0006] 本发明另一目的在于提供一种基于上述荔枝霜疫霉菌LAMP引物的快速检测方法。该检测方法结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高。

[0007] 本发明再一目的在于提供上述快速检测方法在荔枝霜疫霉菌的早期诊断、病菌的监测和鉴定中的应用。

[0008] 本发明的目的通过下述方案实现：

[0009] 一种荔枝霜疫霉菌(Peronophythora litchii)LAMP引物，包括内引物对F3和B3，以及外引物对FIP和BIP，序列如下所示：

[0010] F3：5’-TGAGGACGTGTACTCGTTCC-3’；

[0011] B3：5’-CGCTCATACAGTGGGTGATC-3’；

[0012] FIP：

[0013] 5’-AGCTAAACTGTGACCAGGGTGGCGTCTCCTTTTGGCTTCGTG-3’；

[0014] BIP：

[0015] 5’-GTTACCCGGTCAGCTATGCTGGGCGGGCTTTGAACATCTTGT-3’。

[0016] 本发明还提供了一种基于上述荔枝霜疫霉菌LAMP引物的快速检测方法，包括以下步骤：

[0017] 以待检测样本的DNA为模板，利用上述引物进行LAMP反应扩增，再通过荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行检测。

[0018] 所述LAMP反应体系优选为：25μL，其中F3与B3浓度分别为0.2μM，FIP与BIP浓度分别为1.6μM，20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2～4mM MgSO4，0.1％Tween-20，0～1.2M Betaine，1mM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段，10～50ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；反应条件为在60～65℃温育30～90min，80℃保温5～10min。

[0019] 所述LAMP反应体系更优选为：25μL，其中F3与B3浓度分别为0.2μM，FIP与BIP浓度分别为1.6μM，20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2～4mM MgSO4，0.1％Tween-20，0～1.2M Betaine，1mM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；反应条件为在65℃温育60min，80℃保温10min。

[0020] 所述LAMP反应体系更优选为：25μL，其中F3与B3浓度分别为0.2μM，FIP与BIP浓度分别为1.6μM，20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％Tween-20，0.2M Betaine，1mM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；反应条件为在65℃温育60min，80℃保温10min。

[0021] 所述荧光染料目测观察法：在LAMP反应的最终扩增产物中加入1μL显色剂，所述显色剂为SYBR GreenⅠ，观察显示结果。显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。

[0022] 所述的琼脂糖凝胶电泳法：取6μL LAMP反应的最终扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果。如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。

[0023] 所述待检测样本的DNA优选通过DNA抽提试剂盒法提取。

[0024] 当所述的待检测样本为菌体时，优选使用真菌DNA抽提试剂盒法提取。

[0025] 当所述的待检测样本为植物组织时，优选使用植物组织DNA抽提试剂盒法提取。

[0026] 本发明检测方法结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高，适用于发病组织中荔枝霜疫霉菌的快速可靠的检测和鉴定，可直接用于带菌的植株高灵敏度快速检测，可用于荔枝霜疫霉菌的早期诊断、病菌的监测和鉴定中。本发明建立了荔枝霜疫霉菌快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系，对于农业生产中荔枝霜疫霉菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。

[0027] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

[0028] 1、结果可靠：本发明的LAMP引物及LAMP反应体系，已经对荔枝霜疫霉菌和带荔枝霜疫霉的植物组织进行了多次重复验证，结果可靠。

[0029] 2、特异性强：本发明的LAMP引物是针对荔枝霜疫霉M90基因序列中6个不同区域设计出4条特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故特异性高。

[0030] 3、灵敏度高：本发明的LAMP检测方法对荔枝霜疫霉菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到1pg，比常规PCR检测高1000倍。

[0031] 4、操作简便快速：应用本发明方法，对带荔枝霜疫霉菌的组织进行检测可在1小时内完成，且LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需一个水浴锅即可，不需要复杂的仪器设备和昂贵的分子试剂，结果肉眼直接可见。

附图说明

[0032] 图1为荔枝霜疫霉菌的特异LAMP琼脂糖凝胶电泳检测结果图。其中：泳道M为DL 2000DNAmarker，泳道1为荔枝霜疫霉，泳道2为荔枝炭疽菌，泳道3为黄瓜疫霉菌，泳道4为黄瓜腐霉菌，泳道5为阴性对照，泳道6为空白对照。

[0033] 图2为荔枝霜疫霉的LAMP灵敏性琼脂糖凝胶电泳检测结果图。其中：泳道M为DL2000DNAmarker，泳道1～9模板浓度分别为100ng，10ng，1ng，100pg，10pg，1pg，100fg，10fg，1fg，第10泳道为阴性对照。

[0034] 图3为对接种叶片的琼脂糖凝胶电泳检测结果图。其中，泳道M为DL 2000DNAmarker，第1泳道为阳性对照，泳道2～3为荔枝霜疫霉的发病叶片，第4～5泳道为荔枝霜疫霉和荔枝炭疽菌复合发病的叶片，第6泳道为阴性对照，第7泳道为空白对照。

具体实施方式

[0035] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0036] 下列实施例所用试剂：Bst DNA聚合酶大片段购自英国NEB公司；DNA marker和dNTPs试剂购自宝生物工程大连有限公司；甜菜碱(Betaine)和SYBR GreenⅠ试剂购自北京鼎国昌盛有限公司。

[0037] 实施例1：荔枝霜疫霉菌LAMP引物的设计

[0038] 用本实验室所得到的荔枝霜疫霉M90基因序列，荔枝霜疫霉M90基因序列获得的方法：在NCBI数据库中，用致病疫霉菌的M90基因序列(登录号XM_002909036)进行同源性比对，获得并下载多个其他近似种的M90基因序列(登录号分别为AF507056，XM_008903240，XM_009531244)，找出其保守序列并设计了4条引物，序列分别为：

[0039] F1：5’-AAGTCGGAGAAATGGGG-3’；

[0040] R1：5’-CTCAAAACGTGCTTCCC-3’；

[0041] F2：5’-ATCTGGACGAACCCTCACAAC-3’；

[0042] R2：5’-TAGTCCTCGTTGTGTCGAAT-3’；

[0043] 再以荔枝霜疫霉菌的DNA为模板进行PCR扩增，经测序后，即可获得荔枝霜疫霉M90基因的部分序列，采用PrimerExplorer V4软件设计出一套LAMP检测引物，包括外引物对(F3和B3)和内引物对(FIP和BIP)，引物序列分别为：

[0044] F3：5’-TGAGGACGTGTACTCGTTCC-3’；

[0045] B3：5’-CGCTCATACAGTGGGTGATC-3’；

[0046] FIP：

[0047] 5’-AGCTAAACTGTGACCAGGGTGGCGTCTCCTTTTGGCTTCGTG-3’；

[0048] BIP：

[0049] 5’-GTTACCCGGTCAGCTATGCTGGGCGGGCTTTGAACATCTTGT-3’。

[0050] 实施例2：LAMP快速检测体系的建立及荔枝霜疫霉菌LAMP引物的特异性检测[0051] 为了验证荔枝霜疫霉菌的特异引物序列，以黄瓜疫霉菌(Phytophthora melonis)、黄瓜腐霉菌(Pythium aphanidermatum)和荔枝炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)(均可购买于中国科学院微生物研究所的微生物资源中心)为对比材料。

[0052] 当所述的待检测样本为菌体时，使用真菌DNA抽提试剂盒法提取，所用真菌DNA抽提试剂盒为Omega公司的Fungal DNAkit，货号为D3390，具体方法如下：

[0053] (1)取冻干菌丝约100mg放入研钵中研磨至粉状，立即加入800μL Buffer FG1，充分混匀后加入2mL离心管中，65℃水浴10min，水浴期间颠倒混匀样品两次。

[0054] (2)加入140μL Buffer FG2，漩涡混匀，10,000rpm下离心10min。

[0055] (3)取上清液至一新的1.5mL离心管中，加0.7倍体积的异丙醇沉淀DNA，10,000rpm下离心10min。

[0056] (4)倒出上清液，然后把离心管倒置在几层干净的滤纸或吸水纸上倒扣1min，以吸干残余的水份。

[0057] (5)加入300μL无菌水(预热65℃)使DNA悬浮，加4μL RNase(终浓度20μg/mL)并混匀，RNA酶处理时不需温育。

[0058] (6)加入150μL Buffer FG3和300μL无水乙醇，混匀，得到一均匀的混合液。

[0059] (7)把收集到的DNA样品纯化柱置于2mL收集管中，10,000rpm下离心1min，弃去滤出液体和收集管。

[0060] (8)把柱子套到另一个收集管上，加入750μL DNAWash Buffer(已用96～100％的无水乙醇稀释)10,000rpm下离心1min，弃去滤出液。

[0061] (9)再用750μL DNAWash Buffer洗涤一次，10,000rpm下离心1min，弃去滤出液。

[0062] (10)10,000rpm下空柱离心2min以甩干柱子的膜基质。

[0063] (11)把纯化柱放在一个新的1.5mL离心管中，加60μL Elution Buffer或无菌去离子水(预热65℃)至柱子的膜中央，在室温下静置3～5分钟，10,000rpm下离心1min以洗脱DNA，得到待检测样品DNA。

[0064] 当所述的待检测样本为植物组织时，使用植物组织DNA抽提试剂盒法提取，所用植物组织DNA抽提试剂盒为Omega公司Plant DNAKit，货号D3485，具体方法如下：

[0065] (1)取100mg发病植物组织放入研钵中研磨至粉状，立即加入500μL Buffer CPL，加入10μLβ-巯基乙醇，充分混匀后加入1.5mL离心管，65℃水浴15min，水浴期间上下翻转混匀两次；

[0066] (2)加入500μL氯仿/异丙醇(24：1)，剧烈震荡，10,000rpm室温下离心10min；

[0067] (3)取上清液300μL于新的1.5mL离心管中，加入10μL Rnase酶；

[0068] (4)加入150μL Buffer CXD和300μL无水乙醇，混匀得到一均匀的混合液；

[0069] (5)把收集到的DNA样品纯化柱置于2mL收集管中，10,000rpm下离心1min，弃去滤出液体和收集管；

[0070] (6)加650μL SPW Wash Buffer，10000rpm下离心1min，弃去滤出液体；

[0071] (7)再用650μL SPW Wash Buffer洗涤一次，10,000rpm下离心1min，弃去滤出液；

[0072] (8)10,000rpm下空柱离心2min以甩干柱子的膜基质；

[0073] (9)把纯化柱置于新的1.5mL离心管中，加50～100μL Elution buffer或无菌去离子水(预热65℃)至柱子的膜中央，在室温下静置3～5分钟，10,000rpm下离心1min以洗脱DNA，得到待检测样品DNA。

[0074] LAMP反应体系的建立：25μL，其中F3与B3浓度分别为0.2μM，FIP与BIP浓度分别为1.6μM，20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％Tween-20，0.2M Betaine，1mM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；反应条件为在65℃温育60min，80℃保温10min。

[0075] 以荧光染料目测观察法和琼脂糖凝胶电泳法检测。所述荧光染料目测观察法：在LAMP反应的最终扩增产物中加入1μL显色剂，所述显色剂为SYBR GreenⅠ，观察结果，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。所述琼脂糖凝胶电泳法：取6μL扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，即可判断所述的荔枝组织中存在荔枝霜疫霉菌；没有出现扩增条带判断为阴性，即所述的荔枝组织中未存在荔枝霜疫霉菌。

[0076] 结果如图1(图1是针对菌丝提取的DNA样品)。由图1可见，除了荔枝霜疫霉菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳检测出现LAMP特征性的梯形带外，其他菌株(荔枝炭疽菌、瓜疫霉菌、黄瓜腐霉菌)的显示结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带。这说明本发明设计的LAMP引物对于荔枝霜疫霉菌具有高特异性，可被用于生产实践中发病组织中荔枝霜疫霉菌快速可靠的检测和鉴定。

[0077] 实施例3：LAMP引物对荔枝霜疫霉菌的灵敏性检测

[0078] 采用10倍浓度系列稀释法将实施例2中提取的荔枝霜疫霉菌DNA稀释成100ng，10ng，1ng，100pg，10pg，1pg，100fg，10fg，1fg共9个不同浓度梯度。

[0079] LAMP反应体系的建立：25μL，其中F3与B3浓度分别为0.2μM，FIP与BIP浓度分别为1.6μM，20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％Tween-20，0.2M Betaine，1mM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；反应条件为在65℃温育60min，80℃保温10min。

[0080] 在LAMP反应的最终扩增产物中加入1μL显色剂，所述显色剂为SYBR GreenⅠ，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取6μL扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。

[0081] 检测结果：荔枝霜疫霉菌LAMP灵敏性检测，显示结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，检测灵敏度可达1pg(结果见图2)。

[0082] 实施例4：荔枝霜疫霉接种叶片的检测

[0083] 叶片接种：采取刚转绿的带枝条荔枝幼嫩叶片。设置三组接种叶片，第一组叶片针刺后接种没有菌的培养基块，作为阴性对照；第二组叶片针刺后只接种荔枝霜疫霉的菌丝块；第三组叶片针刺后同时接种荔枝霜疫霉和荔枝炭疽菌的菌丝块。第二组和第三组重复两个样品。

[0084] 样品DNA提取及检测：发病叶片采用植物组织DNA提取试剂盒快速提取DNA，具体方法同实施例2。

[0085] 按下述方法进行LAMP检测：

[0086] (1)LAMP反应体系的建立：25μL，其中F3与B3浓度分别为0.2μM，FIP与BIP浓度分别为1.6μM，20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％Tween-20，0.2M Betaine，1mM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；反应条件为在65℃温育60min，80℃保温10min。

[0087] (2)在LAMP反应的最终扩增产物中加入1μL显色剂，所述显色剂为SYBR GreenⅠ，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取6μL扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。

[0088] 检测结果：如图3所示，带荔枝霜疫霉菌的发病叶片，显示结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，未接种荔枝霜疫霉的健康组织显示结果则观察到橙色荧光或琼脂糖凝胶电泳未出现LAMP特征性的梯形带。

[0089] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。