一种提高花青素含量的方法

摘要

本发明涉及柑橘八氢番茄红素合成酶基因用于提高草莓花青素含量以及利用所述柑橘八氢番茄红素合成酶基因提高草莓花青素含量的方法，包括以下步骤：构建柑橘八氢番茄红素合成酶基因表达质粒；优化草莓遗传转化体系；利用农杆菌介导法将柑橘八氢番茄红素合成酶基因表达质粒转入草莓中，获得表达柑橘八氢番茄红素合成酶基因的草莓；将转入柑橘八氢番茄红素合成酶基因的草莓进行分子生物学鉴定，检测表达柑橘八氢番茄红素合成酶基因的草莓中花青素的含量。利用柑橘八氢番茄红素合成酶基因以及上述的方法可以显著提高草莓中花青素的含量。

权利要求

1.柑橘八氢番茄红素合成酶基因用于转入草莓中以提高草莓花青素含量的用途。

2.一种提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建柑橘八氢番茄红素合成酶基因表达质粒；

2)利用农杆菌介导法将步骤1)构建的柑橘八氢番茄红素合成酶基因表达质粒转入草莓中，获得转柑橘八氢番茄红素合成酶基因的草莓；

3)将转柑橘八氢番茄红素合成酶基因的草莓进行分子生物学鉴定；

4)检测表达柑橘八氢番茄红素合成酶基因的草莓中花青素的含量；

5)转入柑橘八氢番茄红素合成酶基因的草莓中花青素代谢相关基因表达量检测。

3.根据权利要求2所述一种提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步骤2)所述获得转柑橘八氢番茄红素合成酶基因的草莓的方法包括以下步骤：

21)制备草莓无菌试管苗材料；

22)制备接种用的草莓外植体；

23)利用叶盘法农杆菌介导法转化。

4.根据权利要求3所述一种提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步骤23)所述利用叶盘法农杆菌进行转化具体包括以下步骤：a)将含有柑橘八氢番茄红素合成酶基因表达质粒的农杆菌划线培养；

b)将草莓外植体于固体外植体再生培养基暗培养，得到叶盘；

c)取步骤a)的单菌落接种于含有抗生素的液体培养基中进行培养；

d)取步骤c)中培养的菌液接种到不含有抗生素的液体培养基中，扩大培养；

e)取步骤d)培养的菌液离心，弃上清，重悬；

f)将步骤b)培养的叶盘于无菌条件下悬浮备用；

g)将步骤f)中用于悬浮的液体滤出，向叶盘中加入步骤e)重悬的菌液，摇动，滤出菌液，将叶片多余菌液吸干后，接于固体的外植体再生培养基上进行共培养,所述共培养为暗培养，之后进行推迟筛选，所述推迟筛选也为暗培养；

h)将推迟筛选后的叶片接于筛选培养基；

i)进行暗培养至叶片长出愈伤组织后转入光照培养，筛选抗性芽；

j)将筛选培养后得到的抗性芽切下，接在含有抗生素的植株继代培养基中培养，当芽体长出并出现小叶片后，移至含有抗生素的生根培养基中诱导生根；

上述步骤c)、j)中所述的抗生素的抗性与柑橘八氢番茄红素合成酶基因表达质粒所携带的抗性基因抗性一致。

5.根据权利要求4所述一种提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步骤g)中，所述外植体再生培养基是以MS培养基为基础，添加终浓度为1.5mg/L的脱叶灵和终浓度为

0.2mg/L的吲哚丁酸。

6.根据权利要求4所述一种提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步骤g)中，共培养时间为3d，推迟筛选的时间为7-14d。

7.根据权利要求4所述一种提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步骤h)中，所述筛选培养基是以MS培养基为基础，添加终浓度为1.5mg/L的脱叶灵、终浓度为0.2mg/L的吲哚丁酸、终浓度为250mg/L的头孢霉素和终浓度为10mg/L的卡那霉素。

8.根据权利要求4至7任一项所述一种提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步骤j)中，所述含有抗生素的植株继代培养基是以MS培养基为基础，添加终浓度为0.2mg/L的6-苄基腺嘌呤、终浓度为0.02mg/L的吲哚丁酸、终浓度为0.2mg/L的赤霉素、终浓度为10mg/L的卡那霉素和终浓度为250mg/L的头孢霉素。

9.根据权利要求8所述一种提高草莓花青素含量的方法，其特征在于，步骤j)中，所述含有抗生素的生根培养基为将MS培养基稀释两倍后同时添加终浓度为0.2mg/L的吲哚丁酸、终浓度为10mg/L的卡那霉素和终浓度为250mg/L的头孢霉素。

说明书

一种提高花青素含量的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种利用柑橘八氢番茄红素合成酶基因(CitPSY)来提高草莓花青素含量的方法。

背景技术

[0002] 草莓(Fragaria anannassa Duch.)属蔷薇科草莓属多年生草本植物。草莓全基因组比较小，二倍体的基因组大小约240Mbp。对生长环境要求不高，在各地均可种植。与其它果树相比，草莓的生长期比较短，在短时间内可以得到果实。基因工程师草莓育种的新途径之一，其再生及遗传转化体系等已较成熟。加之草莓为无性繁殖，目的基因转入植株中表达后，可以通过组织培养、分株繁殖等无性繁殖方式进行保存和扩繁。因此，草莓是柑橘等童期长的果树中相关基因功能验证的良好植物材料之一。

[0003] 草莓中主要含有的色素为花青素。花青素是一种水溶性色素，其基本骨架是2-苯基苯并吡喃阳离子(2-phenylbenzo-pyryalium),如式1所示(张宁，2008)。在自然界中游离的花青素不稳定，常与一个或多个葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖等形成糖苷贮藏在液泡中，糖苷使花青素更加稳定，但不会影响花青素的颜色，花青素的颜色是由R1和R2位置上的不同取代基决定的(式1)。在植物中常见的花青素有六种：飞燕草色素(Dp)、矢车菊色素(Cy)、天竺葵色素(Pg)、锦葵色素(Mv)、芍药色素(Pn)和牵牛花色素(Pt)。

[0004]

[0005] 式1中，R1＝R2＝H时，为天竺葵色素(Pelargonidin)；R1＝H,R2＝OH时，为矢车菊色素(Cyanidin)；R1＝R2＝OH时，为飞燕草色素(Delphinidin)；R1＝H,R2＝OCH3时，为芍药色素(Peonidin)；R1＝OH,R2＝OCH3时，为牵牛花色素(Petunidin)；R1＝R2＝OCH3时，为锦葵花色素(Malvidin)。

[0006] 花青素具有良好的保健功能，例如：增强视力，消除眼睛疲劳；延缓脑神经衰老，改善睡眠；对由糖尿病引起的毛细血管病有治疗作用；增强心肺功能；预防老年痴呆，预防癌症；美容养颜，清除自由基。

[0007] 八氢番茄红素合成酶(PSY)是类胡萝卜素代谢中的核心酶，也是最重要的限速酶。根据已有的研究成果，八氢番茄红素合成酶的作用是催化2分子的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)，从而生成无色八氢番茄红素。因为八氢番茄红素合成酶对类胡萝卜素重要的限速作用，因此，目前主要是利用PSY基因通过基因工程技术来改变类胡萝卜素的积累。目前已从玉米、拟南芥、温州蜜柑、辣椒等多种植物中分离出了PSY基因(Palaisa K A，2003)。

[0008] 草莓中主要含有花青素，而只含有少量的类胡萝卜素。柑橘中则积累大量的类胡萝卜素，这表明植物只优先积累某一种色素，且植物积累哪一种色素是由植物进化决定的。花青素是水溶性色素，类胡萝卜素是脂溶性色素，两者在分子结构上存在显著区别，合成代谢途径也完全不同。Davison等(2002)研究发现，在拟南芥中超量表达HYD基因，类胡萝卜素的含量增加，积累的花青素减少；曹洪波(2012)在研究苹果愈伤组织时发现类胡萝卜素的大量积累会导致花青素的合成减少，调控花青素合成的基因表达量下调。

发明内容

[0009] 鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种柑橘八氢番茄红素合成酶基因CitPSY的新用途，以及利用柑橘八氢番茄红素合成酶基因CitPSY来提高草莓花青素含量的方法，通过在草莓表达柑橘八氢番茄红素合成酶基因可以显著提高草莓果实中花青素的含量。

[0010] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

[0011] 本发明提供了柑橘八氢番茄红素合成酶基因CitPSY的新用途，即将柑橘八氢番茄红素合成酶基因CitPSY用于转入草莓中以提高草莓花青素含量的用途。

[0012] 所述柑橘八氢番茄红素合成酶基因CitPSY的详细信息可以在NCBI网站的查询，编号为Gene ID:102578001。也可以参见参考文献：张建成.红肉脐橙类胡萝卜素合成酶基因(CsPSY、CsLCYb)功能分析与CrtB转基因对类胡萝卜素生物合成的影响.[博士学位论文].武汉：华中农业大学，2009。上述文献中的红肉脐橙类胡萝卜素合成酶基因(CsPSY)在本发明的描述中的名称为柑橘八氢番茄红素合成酶基因(CitPSY)。

[0013] 一种提高草莓花青素含量的方法，包括以下步骤：

[0014] 1)构建柑橘八氢番茄红素合成酶基因CitPSY表达质粒；

[0015] 2)利用农杆菌介导法将步骤1)构建的柑橘八氢番茄红素合成酶基因CitPSY表达质粒转入草莓中，获得转柑橘八氢番茄红素合成酶基因CitPSY的草莓；

[0016] 3)将转柑橘八氢番茄红素合成酶基因CitPSY的草莓进行分子生物学鉴定；

[0017] 4)检测表达柑橘八氢番茄红素合成酶基因CitPSY的草莓中花青素含量；

[0018] 5)转柑橘八氢番茄红素合成酶基因CitPSY草莓中花青素代谢相关基因表达量检测。

[0019] 本发明的有益效果：本发明通过在草莓中表达CitPSY基因可以显著提高草莓中的花青素的含量。

[0020] 本发明所述的提高草莓花青素含量的方法是以质粒的形式携带CitPSY并将其一起转入草莓中进行表达，本领域技术人员可以选择适当的表达载体并进行相应的优化，实施例中只是提供了效果较好的技术方案，但不只局限于实施例中的技术方案。另外，除了质粒的形式以外，也可以通过其他的方式，例如将CitPSY整合到草莓的染色体上从而提高草莓中花青素的含量。

[0021] 在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

[0022] 进一步，步骤2)所述获得转柑橘八氢番茄红素合成酶基因的草莓的方法包括以下步骤：

[0023] 21)制备草莓无菌试管苗材料；

[0024] 22)制备接种用的草莓外植体；

[0025] 23)利用叶盘法农杆菌介导法转化。

[0026] 进一步，步骤23)所述利用叶盘法农杆菌进行转化具体包括以下步骤：

[0027] a)将含有CitPSY表达质粒的农杆菌划线培养；

[0028] b)将草莓外植体于固体外植体再生培养基暗培养，得到叶盘；

[0029] c)取步骤a)的单菌落接种于含有抗生素的液体培养基中进行培养；

[0030] d)取步骤c)中培养的菌液接种到不含有抗生素的液体培养基中，扩大培养；

[0031] e)取步骤d)培养的菌液离心，弃上清，重悬；

[0032] f)将步骤b)培养的叶盘无菌条件下悬浮备用；

[0033] g)将步骤f)悬浮用的液体滤出，向叶盘中加入步骤e)重悬的菌液，摇动，滤出菌液，将叶片多余菌液吸干后，接于固体的外植体再生培养基上进行共培养，所述共培养为暗培养，之后进行推迟筛选，所述推迟筛选也为暗培养；

[0034] h)将推迟筛选后的叶片接于筛选培养基；

[0035] i)进行暗培养至叶片长出愈伤组织后转入光照培养，筛选抗性芽；

[0036] j)将筛选培养后得到的抗性芽切下，接在含有抗生素的植株继代培养基中培养，当芽体长出并出现较多小叶片后，移至含有抗生素的生根培养基中诱导生根；

[0037] 上述步骤c)、j)中所述的抗生素的抗性与柑橘八氢番茄红素合成酶基因表达质粒所携带的抗性基因抗性一致。

[0038] 进一步，步骤g)中，所述外植体再生培养基为以MS培养基为基础，添加终浓度为1.5mg/L的脱叶灵和终浓度为0.2mg/L的吲哚丁酸。所述共培养时间为3d，推迟筛选的时间为7-14d。

[0039] 进一步，步骤h)中，所述筛选培养基以MS培养基为基础，添加终浓度为1.5mg/L的脱叶灵、终浓度为0.2mg/L的吲哚丁酸、终浓度为250mg/L的头孢霉素和终浓度为10mg/L的卡那霉素。

[0040] 进一步，步骤j)中，所述含有抗生素的植株继代培养基以MS培养基为基础，添加终浓度为0.2mg/L的6-苄基腺嘌呤、终浓度为0.02mg/L的吲哚丁酸、终浓度为0.2mg/L的赤霉素、终浓度为10mg/L的卡那霉素和终浓度为250mg/L的头孢霉素。

[0041] 进一步，步骤j)中，所述含有抗生素的生根培养基为MS培养基的稀释两倍后同时添加终浓度为0.2mg/L的吲哚丁酸、终浓度为10mg/L的卡那霉素和终浓度为250mg/L的头孢霉素。

[0042] 采用上述进一步方案的有益效果是：在本发明所述的转化方法中选择了合适的转化条件以及使用试剂的浓度，具有较高再生频率以及较高的转化频率，成功的制备了转CitPSY的草莓，并且在后续的培养过程中发现假阳性率比较低。

[0043] 上述步骤c)中的含有抗生素的液体培养基指适于培养含有柑橘八氢番茄红素合成酶基因表达质粒的农杆菌，可以根据含有柑橘八氢番茄红素合成酶基因表达质粒所携带的抗性基因选用合适的抗生素以及浓度，本实施中使用的含有抗生素的液体培养基为含有Kan的浓度为50mg/L的LB液体培养基。

附图说明

[0044] 图1为本发明所述质粒pBI121-Cit-PSY表达载体T-DNA区示意图，其中：LB代表T-DNA左边界；RB代表T-DNA右边界；npt II代表新霉素磷酸转移酶II基因；

[0045] 图2包括图2A和图2B，图2A为本发明所述提高草莓花青素含量的方法的过程示意图；图2B为本发明所述根癌农杆菌介导草莓叶片遗传转化过程示意图；

[0046] 图3为本发明所述转基因阳性株系PCR扩增CitPSY基因结果，其中：M为1kb DNA ladder；Q为CitPSY质粒；c为非转基因草莓对照；条带1-14为抗性草莓植株；

[0047] 图4为利用HPLC测定不同草莓株系中花青素色谱图,包括图4A至4F；其中，纵坐标为含量(AU)，横坐标为时间(单位为分钟)；图4A至4F分别是利用HPLC测定甜查理、金玉、红颜、章姬、PMV株系、4-1株系的花青素色谱图；

[0048] 图5为草莓果实中花青素积累特征比较结果，包括图5A和图5B，其中：a、b代表在P<0.05水平上存在显著差异；纵坐标为含量，单位为μg/g；横坐标为草莓的品种；图5A为不同草莓株系的天竺葵-3-O-葡萄糖苷的含量比较；图5B为不同草莓株系的矢车菊-3-O-葡萄糖苷的含量比较；

[0049] 图6为花青素合成相关基因在不同草莓品种间的表达特征结果图,包括图6A至图6J；其中，纵坐标为含量，单位为μg/g；横坐标为草莓的品种，其中，4-1代表4-1株系，TCL代表甜查理，HY代表红颜，ZJ代表章姬，JY代表金玉；图6A至6J分别是分别针对CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UFGT、MYB1、MYB10、bHLH3、bHLH33的不同草莓品种间的表达特征结果图。

具体实施方式

[0050] 以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

[0051] 一、植物材料：

[0052] 草莓品种‘全明星’(F.ananassa Duch.‘Allstar’),国内主要栽培品种，由美国引进，具有高产、耐储藏、抗病能力强等特点；甜查理、金玉、红颜、章姬等草莓品种果实,购自湖北省农业科学院经济作物研究所基地大棚。

[0053] 脱毒试管苗：来自沈阳农业大学张志宏老师实验室，后经扩繁得到大量无菌苗。

[0054] 实施例中采用叶片作为外植体材料。

[0055] 二、细菌材料：

[0056] 大肠杆菌菌株DH5α，购自武汉鼎国生物技术有限公司；根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105(可以参考文献：Jiancheng Zhang,Nengguo Tao,Qiang Xu,Wenjing Zhou,Hongbo Cao,Juan Xu,Xiuxin Deng.Functional 
characterization of Citrus PSY gene in Hongkong kumquat(Fortunella hindsii Swingle).Plant Cell Rep(2009)28:1737-1746)，由华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室保存，可以为公众所获得。

[0057] 三、主要生化试剂：

[0058] 卡那霉素(Kan):购自鼎国生物公司，用无菌水配制成50mg/mL的母液，0.22μm滤膜过滤灭菌，于-20℃下保存。

[0059] 头孢霉素(cefotaxime，Cef):购自Sigma公司，用无菌水配制成400mg/mL的母液，0.22μm滤膜过滤灭菌，于-20℃下保存。

[0060] 脱叶灵(TDZ):购自武汉鼎国生物技术有限公司，用少量2mol/L的KOH溶解后，再用无菌水配制成20mg/mL的母液，于-4℃下保存。

[0061] 其他主要试剂主要购自Sigma公司、Takaya公司。

[0062] 四、本实施例中所涉及的培养基：

[0063] 1、用于培养根癌农杆菌的培养基

[0064] LB液体培养基：含有10g/L胰化蛋白、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl；

[0065] LB固体培养基：LB液体培养基的基础上添加7g/L琼脂。

[0066] 2、植株快繁培养基：MS培养基的基础上添加终浓度为0.5mg/L的BA、终浓度为0.02mg/L的IBA和终浓度为0.2mg/L的GA；

[0067] 3、植株继代培养基：MS培养基的基础上添加终浓度为0.2mg/L的BA、终浓度为0.02mg/L的IBA和终浓度为0.2mg/L的GA；

[0068] 4、外植体再生培养基：MS培养基的基础上添加终浓度为1.5mg/L的TDZ和终浓度为0.2mg/L的IBA；

[0069] 5、推迟筛选培养基：MS培养基的基础上添加终浓度为1.5mg/L的TDZ、终浓度为0.2mg/L的IBA和终浓度为250mg/L的Cef；

[0070] 6、筛选培养基：MS培养基的基础上添加终浓度为1.5mg/L的TDZ、终浓度为0.2mg/L的IBA、终浓度为250mg/L的Cef和终浓度为10mg/L的Kan；

[0071] 7、生根培养基：MS培养基的稀释两倍后同时添加终浓度为0.2mg/L的IBA。

[0072] 上述所有激素浓度单位均为mg/L，以MS为基础的培养基pH均调至5.85，灭菌后备用。

[0073] 固体培养基在液体培养基成分基础上，加入7g/L的琼脂。

[0074] MS培养基具体成份及配制方法参见《植物组织培养实验指导》(龚一富，2011)。

[0075] IBA指吲哚丁酸(Indole-3-Butytric acid)，BA指6-苄基腺嘌呤(6-Benzyladenine)，GA指赤霉素(Gibberellin)，均购自武汉鼎国生物技术有限公司。

[0076] 实验例中所用引物均由Primer 5和Primer Express软件设计。

[0077] 若非特别指出，本发明所述的试剂或方法均可参照《分子克隆实验指南》(第二版)，本领域技术人员可以实现本发明所描述的技术方案。

[0078] 实施例1

[0079] 构建柑橘八氢番茄红素合成酶基因CitPSY表达质粒。

[0080] CitPSY的扩增以及构建CitPSY表达质粒的方法详细内容见文献：张建成.红肉脐橙类胡萝卜素合成酶基因(CsPSY、CsLCYb)功能分析与CrtB转基因对类胡萝卜素生物合成的影响.[博士学位论文].武汉：华中农业大学，2009。克隆的CitPSY其cDNA长为1540bp，包含1308bp的开放读码框，编码436个氨基酸，5′端有49bp长的非翻译区，3′端包含160bp的非编码序列；预测的分子量和等电点分别为49.5kDa和5.86。

[0081] 上述文献中的红肉脐橙类胡萝卜素合成酶基因(CsPSY)在本发明的描述中的名称为柑橘八氢番茄红素合成酶基因(CitPSY)。

[0082] 上述文献中的构建的表达载体pBI-CsPSY在本发明的描述中的名称为pBI121-Cit-PSY。质粒pBI121-Cit-PSY表达载体T-DNA区示意图如图1所示。

[0083] 将质粒pBI121-Cit-PSY转化到根癌农杆菌菌株EHA105中，得到菌株EHA105/pBI121-Cit-PSY。具体的转化方法可以参考上述文献。

[0084] 实施例2

[0085] 根癌农杆菌介导草莓叶片遗传转化，具体过程如图2所示。

[0086] 1、草莓无菌试管苗材料的准备

[0087] 将无菌试管苗接种在快速繁殖固体培养基(在植株快繁培养基的基础上添加终浓度为30g/L的蔗糖和终浓度为7g/L的琼脂)上增殖培养，单株繁殖，每个三角瓶接种4个外植体，将其置于光照培养室培养。培养条件：温度25℃，光照强度2000lx，光周期16h/d。经2-3个月，得到大量无菌试管苗，作为实验材料备用。

[0088] 2、接种外植体

[0089] 取步骤1培养基上生长30-40d左右、生长部位长势一致的叶片，切割成4mm×4mm的块状叶盘，作为试验中接种用的外植体。所有外植体近轴面与培养皿中培养基接触，每皿接种35个外植体，每个处理重复3次。

[0090] 3、农杆菌叶盘法转化程序

[0091] (1)将EHA105/pBI121-Cit-PSY菌液于LB(含有的Kan的浓度为50mg/L)固体培养基上划线，28℃培养至少2d。

[0092] (2)将叶片(即草莓外植体)切成4mm×4mm左右块状，于固体外植体再生培养基暗培养2d，得到叶盘。

[0093] (3)取上述菌单菌落于50mL LB液体培养基(含有的Kan的浓度为50mg/L)中，200r/min、28℃、震荡16h，OD600值约为0.8-1.0。

[0094] (4)取上述菌液1mL于50mL LB液体培养基中，200r/min、28℃、震荡10h，OD600值约为0.3-0.4。

[0095] (5)5000r/min常温离心5min，弃上清，加入同体积MS液体培养基(不加激素)悬浮。

[0096] (6)预培养的叶盘于无菌的含30g/L蔗糖的MS液体培养基中悬浮备用。

[0097] (7)将上述MS液体培养基滤出，加入步骤(5)中重悬的菌液，摇动5-7min，滤出菌液，将叶片多余菌液吸干，接于固体外植体再生培养基，共培养3d(暗室)，利用推迟筛选培养基进行推迟筛选7-14d，此过程均为暗培养。

[0098] (8)推迟筛选后的叶片接于筛选培养基。

[0099] (9)选择培养：暗培养至叶片长出愈伤组织后转入光照培养，总共选择培养的时间为35-45d，大约每隔20d左右换一次筛选培养基,由愈伤组织到生成抗性芽的时间为15-20d。

[0100] (10)抗性芽的增殖与生根：将筛选培养后得到的抗性芽(长度大于1cm)切下，接在同时含有10mg/L Kan、250mg/L Cef的植株继代培养基中培养，当芽体生长至2-3cm时，并出现较多小叶片后，移至含有10mg/L Kan、250mg/L Cef的生根培养基中诱导生根，从获得抗性芽至长出根的时间约为30d。

[0101] 在进行实施例2的同时，发明人还同时开展了对比实施例2-1至2-8的工作，从而验证本发明所述的技术方案以及技术方案中具体参数的选择具有的优点。对比实验例的具体内容如下所示。

[0102] 对比实施例2-1

[0103] 在上述步骤(7)中，调整固体外植体再生培养基中TDZ的浓度分别为1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L和3.0mg/L等不同浓度的TDZ，培养50d后统计不定芽再生情况，每20d继代一次。其余步骤同实施例2。

[0104] 对比实施例2-2

[0105] 步骤(9)中，将草莓叶片接种于再生培养基上，置于暗室培养，暗处理时间分别为：7d、14d、21d、28d和35d。其余步骤同实施例2。

[0106] 对比实施例2-3

[0107] 步骤(8)中，将叶片接种在不同Kan浓度的筛选培养基上，每20d继代一次，观察不定芽再生情况，选出使叶片再生愈伤但不能再生不定芽的最低Kan浓度，设置以下浓度处理：0mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L和40mg/L。其余步骤同实施例2。

[0108] 对比实施例2-4

[0109] 步骤(8)中，用OD600＝0.4的农杆菌菌液侵染叶盘，无菌滤纸吸干菌液后接种在添加不同浓度Cef的筛选培养基上，观察农杆菌生长抑制效果。设置以下浓度处理：0mg/L、100mg/L、250mg/L、400mg/L和550mg/L。并统计农杆菌生长时间和生长情况。其余步骤同实施例2。

[0110] 对比实施例2-5

[0111] 步骤(4)中将活化后的根癌农杆菌吸出1mL，加入新配制的LB培养基中，分别摇至OD600为0.1、0.3、0.5、0.7，离心后，用等体积MS液体再生培养基重悬，分别侵染1min、5min、10min，共培养3d，25d后观察抗性愈伤生长情况。其余步骤同实施例2。

[0112] 对比实施例2-6

[0113] 步骤(2)中将叶片置于外植体再生培养基上预培养0d、1d、2d、3d、4d，后用OD600＝0.5的菌液侵染5min，共培养3d，25d后观察抗性愈伤生长情况。其余步骤同实施例2。

[0114] 对比实施例2-7

[0115] 步骤(7)中，将叶片预培养2d，之后用OD600＝0.5的菌液侵染5min，共培养2d、3d、4d，脱去根癌农杆菌后继续培养，观察抗性愈伤生长情况。其余步骤同实施例2。

[0116] 对比实施例2-8

[0117] 步骤(7)中，共培养3d后，被侵染的叶片分别接种于含Kan和Cef的固体外植体再生培养基中立即筛选，在只含有Cef的的推迟筛选培养基中推迟筛选，分别推迟筛选2d、7d、14d，30d后统计观察抗性愈伤生长和出芽情况。其余步骤同实施例2。

[0118] 通过上述方法获得的转入CitPSY的草莓，并进行分子生物学鉴定，鉴定结果为阳性的菌株命名为4-1株系。

[0119] 同时按照上述方法将不含有CitPSY的空载体的质粒pBI121转入草莓品种‘全明星’，将其命名为PMV株系。

[0120] 所述4-1株系、PMV株系的植株均保存至华中农业大学国家柑橘育种中心。

[0121] 4-1株系与PMV株系相比，4-1株系的叶片呈现出浅绿色、叶片较薄、果型较小、颜色更加鲜艳，呈深红色。PMV株系叶片呈深绿色、叶片较厚、茎比较粗壮。

[0122] 样品预处理

[0123] 采集4-1株系、PMV株系、甜查理、金玉、红颜、章姬的果实(均为全红期果实)，用清水将果实清洗干净，去掉果蒂，将果实平均分成三份重复，用液氮冻过后密封保存在-80℃冰箱中，用于分子生物学鉴定和各种代谢物质的测定。

[0124] 实施例3转基因草莓的分子生物学鉴定

[0125] 1、提取草莓DNA：采用CTAB小量法法提取叶片DNA,具体步骤见(Yunjiang Cheng,Wenwu Guo,Hualin Yi,Xiaomin Pang,Xiuxin Deng.An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species.Plant Molecular Biology Reporter,
2003,21:177a-177g)。

[0126] 2、利用PCR进行鉴定

[0127] 将实施例2得到14株经Kan筛选后的抗性苗。利用CitPSY特异引物(fwd5’-CGGGATCCATGTCTGTTACA-3’,rev5’-GGGGTACCTTAAGCCTTACT-3’)(张建成.红肉脐橙类胡萝卜素合成酶基因(CsPSY、CsLCYb)功能分析与crtB转基因对类胡萝卜素生物合成的影响.[博士学位论文].武汉：华中农业大学，2009)，将抗性苗的叶片提取DNA，进行PCR扩增。阳性对照为农杆菌质粒，阴性对照为未转基因的草莓DNA。结果如图3所示，可看出PCR扩增后，3个株系扩增出一条1300bp左右条带，报告基因nptII(fwd5’-GTGCCCTGAATGAACTGC-3’,rev5’-GCCTTGAGCCTGGCGAAC-3’)(张建成.红肉脐橙类胡萝卜素合成酶基因(CsPSY、CsLCYb)功能分析与crtB转基因对类胡萝卜素生物合成的影响.[博士学位论文].武汉：华中农业大学，
2009)也扩增出对应条带。

[0128] 第二年，将上述得到的阳性株系和空载株系(PMV株系)转移到实验大棚中，让其生长结果，鉴定结果为阳性的株系命名为4-1株系。

[0129] 按照表1中的反应体系配制PCR扩增反应液。

[0130] 表1 PCR扩增反应液

[0131]

[0132] 按照表2中的条件运行PCR反应。

[0133] 表2 PCR反应运行程序

[0134]总变性 变性 复性 延伸 循环数
94℃，7min 94℃，1min 55℃，50s 72℃，2min 35

[0135] 对比实施例3-1

[0136] 分别以PMV株系、甜查理、金玉、红颜、章姬的果实(均为全红期果实)作为对照，进行对比实施例。具体操作过程同实施例3。

[0137] 所述甜查理、金玉、红颜、章姬购自于湖北省农业科学院经济作物研究所基地大棚。

[0138] 实施例4

[0139] 利用HPLC测定花青素含量，具体步骤可以参照Bordonaba  JG,Terry LA.Biochemical profiling and chemometric analysis of seventeen UK-grown black currant cultivars.Agricul tural and Food Chemistry,2008,56(16):7422-7430所述的方法。

[0140] 1)将样品用液氮研磨，准确称取1g样品到10mL离心管中。

[0141] 2)向离心管中加入5mL的提取液(所述提取液为盐酸和甲醇溶液的混合液，其中盐酸的体积分数为1％)，涡旋2min。

[0142] 3)将涡旋后的试管放入超声仪中超声40min。

[0143] 4)超声后5000g离心10min，过0.22μm的滤膜，准备上样。

[0144] 其中，色谱柱为4.6mm×250mm，5μm(Sigma，USA)；流动相A为水(含有质量分数为1％的甲醇)，流动相B为甲醇，流速为1mL/min。

[0145] 具体洗脱条件参见表3。

[0146] 表3 HPLC测定花青素的洗脱条件

[0147]时间 洗脱条件
0-10min 10％-20％B
10-15min 20％-30％B
15-50min 30％-50％B
50-60min 50％-60％B
60-68min 60％-10％B
68-70min 10％B

[0148] 选择天竺葵-3-O-葡萄糖苷(The nature network,97％)、矢车菊-3-O-葡萄糖苷(上海惠城生物,98％)作为标准品，分别稀释成512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml。做出标准曲线，得出定量公式及R值。

[0149] 对比实施例4

[0150] 分别以PMV株系、甜查理、金玉、红颜、章姬的果实(均为全红期果实)作为对照，进行对比实施例。具体操作过程同实施例4。

[0151] 实施例5与花青素相关基因表达分析

[0152] 1.RNA反转录成单链cDNA：参照RevertAid M-MuLV KIT的方法。以1-1.5μg mRNA作为模板进行反转录，完成后的cDNA加80μL ddH20稀释；

[0153] 2.根据已报道文献，利用Primer 5和Primer Express软件设计实时荧光定量PCR引物，其中CHS fwd5’-CCGACTACTACTTTCGTATCACCA-3’,rev5’-ACTACCACCATGTCTTGTCTTGC-3’；CHI fwd5’-TTTTCAATGGCTTTCGCTTCTG-3’,rev5’-GTGACAATGATACTACCGCTGACG-3’；F3H fwd5’-GTGCGCCACCGTGACTACTC-3’,rev5’-ATGCCTTTGTCAATGCCTCC-3’；DFR fwd5’-GGGTGGTGTTTACATCTTCGG-3’,rev5’-CTGCTTGCTCGGCTAGAGTTT-3’；ANS fwd5’-
ATCGTCATGCACATAGGCGACACC-3’,rev5’-CCTTGGGCGGCTCACAGAAAA-3’；UFGT fwd5’-ATCGTGGCTTGACAAACAGAA-3’,rev5’-TGACCACAAGAATGGAACCCTA-3’；MYB1fwd5’-
ATGAGGAAGCCCTGCTGCGA-3’,rev5’-AACGACGCAACCCTGCAGCC-3’(可以参考文献：
Salvatierra A,Pimentel P,Moya-león MA,Herrera R.Increased accumulation of anthocyanins in Fragariachiloensis fruits by transient suppression of 
FcMYB1gene.Phytochemistry,2013,90:25-36.)；MYB10fwd5’-TCAAATCAGGCTTAAACAGA-3’,rev5’-TTAAAGACCACCTGTTTCCT-3’；bHLH3fwd5’-ACCGAGTAGTAGCAGACTCCGTGGTAT-3’,rev5’-CCATCTGCCCATATTAACATCCCTTG-3’；bHLH33fwd5’-AATCCATGAGAGGGTGCCTGAGAAT-3’,rev5’-CAGCACCCCTTGTTGAGTTGTTGA-3’(可以参考文献Espley RV,Hellens RP,Putterill J,Stevenson DE,Kutty-Amma S,Allan AC.Red colouration in apple fruit is due to the activity of the MYB transcription factor,MdMYB10.Plant Journal,2007,49:
414-427.)。荧光实时定量PCR在ABI7500Real Time System(PEApplied Biosystems；
Foster City,CA,USA)上进行，方法及反应程序参考文献：刘庆.‘暗柳’甜橙红色突变体形状形成的分子机理研究[博士学位论文].武汉：华中农业大学，2008.。将目的基因和内参基因GADPH特异性引物(fwd5’-TCTTTGATGCCAAGGCTGGA-3’,rev5’-TCACACGGGAACTGTAACCC-
3’)和 GREEN Master Mix混合均匀，加入到事先加有模板的反应管中，反应体系为
10μL，详细组份件表4-1。实时荧光定量PCR反应程序为见表4-2。

[0154] 表4-1 荧光定量PCR反应体系

[0155]

[0156] 表4-2 实时荧光定量PCR反应程序

[0157]

[0158] 实验结果：

[0159] 关于实验结果的统计方法：外植体再生率＝再生愈伤数/接种的总外植体数×100％；不定芽再生率＝再生不定芽的外植体数/接种的总外植体数×100％；平均再生芽数＝再生不定芽总数/再生芽的外植体数×100％。

[0160] 实施例2中，对预培养2d的叶盘进行农杆菌(OD600＝0.4)侵染，共培养3d后，转移至推迟筛选培养基上，7d后开始出现愈伤组织，颜色发白。2周(简写为w)后将叶盘接于筛选培养基中，后期进行光照培养，愈伤大量生长，大部分愈伤组织贴近培养基部位逐渐褐化，生长中的愈伤组织逐渐显出淡绿色，少部分褐化。褐化的愈伤组织所依附的外植体逐渐变黑至枯死。继续生长的抗性愈伤，正常生长后，少量分化出不定芽。不定芽逐渐伸长后，将其切下，转接到含有10mg/L Kan，250mg/L Cef的草莓植株继代培养基中，待抗性芽再进一步长大后，将筛选压Kan浓度提高至20mg/L。抗性芽后期伸长、增殖生长过程中，部分转化芽逐渐白化死亡，即为逃逸芽，也有出现半白半绿的现象，即为嵌合体。剩下的抗性芽，保持绿色，生长正常。

[0161] 当抗性芽生长至2-3cm时，置于含有10mg/L Kan，250mg/L Cef的生根培养基中进行根的诱导。所有19株抗性芽在接种至生根培养基中，前8w一直未生根。经过数次继代，减少培养基中抗生素浓度，最终有14株生根。

[0162] 一、关于根癌农杆菌介导草莓叶片遗传转化部分的具体实验结果与对比实验例的对比结果如下所示。

[0163] 1、与对比实施例2-1的对比结果

[0164] 对于‘全明星’叶片，以MS+TDZ+IBA(0.2mg/L)为外植体再生培养基，表5中数据表明，随着TDZ浓度的增加，愈伤组织再生率和不定芽再生水平都有所提高。本发明技术方案中采用的TDZ浓度为1.5mg/L，既可以保证具有较高的不定芽再生率而且很好的避免了再生芽玻璃化现象。由于TDZ价格较贵，采取较低浓度的TDZ也有利于节约成本。

[0165] 表5 不同浓度TDZ对‘全明星’叶片愈伤诱导和不定芽再生的影响

[0166]

[0167] 2、与对比实施例2-2的对比结果

[0168] 从表6可以看出，本发明在进行草莓遗传转化试验采用21-30d的暗培养，相比其他的暗培养的时间，既缩短了愈伤组织形成的时间又能够使在光照培养后愈伤组织逐渐变绿。全明星叶片经过暗培养后再放置于光照下培养，随之暗培养时间的增加，愈伤再生率、不定芽出芽率逐渐提高。暗培养14d，愈伤再生率和不定芽再生率都达到最高，随着暗培养时间增加，再生率和出芽率有所下降。试验中可以观察到，叶片暗培养可以缩短愈伤组织形成的时间，最初形成的愈伤发白，光照培养后，愈伤逐渐变绿，之后开始发生不定出芽。侵染试验、筛选试验表明，叶片在含有抗生素的培养基上生长时，愈伤组织形成、不定芽发生都有所推迟。

[0169] 表6 不同暗培养时间对‘全明星’叶片愈伤诱导和不定芽再生的影响

[0170]

[0171] 3、与对比实施例2-3的对比结果

[0172] 将‘全明星’叶盘接种到含有不同Kan浓度的外植体再生培养基中，30d后观察抗性愈伤再生情况，50d后观察不定芽出芽和生长情况。Kan对草莓叶盘愈伤组织的诱导和不定芽的分化有显著的抑制作用。

[0173] 表7中表明，相比其他浓度，本发明选择10mg/L Kan可以既达到筛选的目的又避免了过高浓度的Kan对不定芽再生的影响。

[0174] 因为，随着Kan浓度的提高，愈伤组织再生频率，不定芽的分化率和成活率都显著降低。当Kan浓度大于20mg/L时，愈伤组织依然能够诱导发生，但不定芽不能再生，更大浓度的Kan可导致叶片迅速褐化死亡。Kan浓度为10mg/L时，虽然也能诱导出不定芽，但后期培养中，不定芽逐渐白化死亡。在含有不同浓度Kan的筛选培养基中，继代培养50d后，未分化愈伤组织的外植体叶片逐渐黄化、白化后死亡。在附加Kan的筛选培养基上，可以观察到外植体叶片愈伤组织产生较对照晚5-10d，不定芽出芽时间比对照晚30-45d。

[0175] 表7 卡那霉素对叶片不定芽再生的影响

[0176]

[0177] 4、与对比实施例2-4的对比结果

[0178] 对抑菌剂Cef浓度的选择，要求既能够有效抑制农杆菌的大量生长，又对外植体细胞生长的影响最小。

[0179] 从表8中可以看出，本发明中采用250mg/L Cef推迟筛选培养基上进行培养，相比其他浓度，可以达到最佳的抑菌效果且使抗菌剂对叶片影响变小。当Cef浓度大于400mg/L时，可以有效的抑制农杆菌的生长繁殖。当Cef浓度小于100mg/L时，农杆菌的生长几乎不受到抑制。Cef浓度为250mg/L时，虽然农杆菌也有所生长，但生长速度较慢。因此，本实验中先采用含有低浓度的Cef液体外植体再生培养基对共培养的叶片进行1-2次漂洗，再将叶片上液体外植体再生培养基吸干后接于含有250mg/L Cef推迟筛选培养基上进行培养，可达到最佳的抑菌效果，且使抗菌剂对叶片影响变小。

[0180] 表8 不同浓度头孢霉素对农杆菌抑制效果及对叶片生长影响

[0181]

[0182] 5、与对比实施例2-5的对比结果

[0183] 从表9中可以看出，本发明利用OD600为0.5的根癌农杆菌侵染外植体并且侵染时间为5-7min，相比其他侵染条件，具有较高的抗性愈伤再生率。根癌农杆菌浓度关系到转化率的高低，过低的菌液浓度不利于根癌农杆菌在外植体上的附着，过高的菌液浓度不利于共培养后除去根癌农杆菌，并且对外植体伤害较大。选择合适的菌液浓度对转化率的提高很重要。当OD600值在0.3-0.5时，所得抗性愈伤再生率最高，并且共培养后对外植体生长影响不大。OD600为0.1时，外植体叶片转化率较低，后期逐渐死亡、OD600为0.7时，外植体受到农杆菌侵染影响较大，在推迟筛选阶段快速褐变死亡。实验选用OD600≈0.4为农杆菌侵染最适浓度。

[0184] 侵染时间同样是影响外植体转化效率的重要因素。侵染时间短，农杆菌未接种到伤口面，侵染时间过长农杆菌过度伤害外植体导致切口褐化死亡。

[0185] 表9 菌液浓度和侵染时间对转化率的影响

[0186]

[0187] 6、与对比实施例2-6和2-7的对比结果

[0188] 从表10中可以看出，本发明采用预培养时间为2d且共培养时间为3d，相比其他的培养时间，可以使愈伤较快形成并且只有少量叶片褐化。多数关于植物外植体转化前进行预培养的研究表明，进行预培养可提高外植体组织代谢，促进细胞分裂，减少培养时间，利于外植体侵染后吸收培养基营养，从而提高转化率。从表10中可以看出，预培养2d，转化效率比其他培养时间都高。因为，一般对于预培养的叶片，切口处细胞所受伤害逐渐修复，在再生培养基的诱导下，细胞旺盛分裂，形成较多的感受态细胞，此时对根癌农杆菌侵染较为敏感，利于T-DNA的插入整合，提高转化率。当预培养时间超过4d时，叶片切口基本愈合，利于转化的小分子酚类物质产生量减少，细胞不再敏感，从而转率降低，后期导致叶片在根癌农杆菌侵染和抗生素筛选双重压力下逐渐死亡。

[0189] 根癌农杆菌转化的原理是将T-DNA转移至植物细胞中，并整合到外植体基因组中。农杆菌附着后不能立即转化，须在切口创伤部位生长至少16h才能诱发肿瘤并插入T-DNA。
适当的共培养时间，对转化效率影响很关键。从表10中可以看到，本发明选择共培养2-3d，相比其他培养时间，具有较高的抗性愈伤再生率；而共培养4d时，由于根癌农杆菌生长过量，会导致外植体快速褐化死亡，转化率下降。若共培养超过4d，外植体细胞会因农杆菌生长而不能再生，势必得不到抗性愈伤。

[0190] 表10 预培养时间和共培养时间对叶片再生及转化效率的影响

[0191]

[0192] 7、与对比实施例2-8的对比结果

[0193] 从表11可以看出，本发明采用推迟7-14d筛选的选择方式进行抗性芽的筛选，相比其他的推迟筛选时间，具有较高的愈伤再生率且叶片生长良好。

[0194] 从表11可以看出，逐步增加Kan筛选压或者延迟筛选有利于转化率的提高，原因可能是在共培养之后，外植体在推迟筛选培养基上首先逐步恢复生长活力，之后再进行筛选，能更好的适应环境并生长。

[0195] 表11 推迟筛选时间对叶片再生及转化效率的影响

[0196]推迟筛选(d) 愈伤再生率(％) 叶片生长情况
0 0 叶片伤口褐化严重，5d后大部分死亡
2 8.7 大部分叶片伤口褐化严重，少量能形成愈伤
7 47.6 5-7d开始出现愈伤组织，生长良好
14 48.6 5-7d开始出现愈伤组织，生长良好

[0197] 二、HPLC测定草莓花青素结果

[0198] HPLC测定甜查理、金玉、红颜、章姬和PMV株系中的花青素，洗脱产生三个峰，分别为峰1、峰2、峰3；HPLC测定4-1株系中的花青素，洗脱时同样产生三个峰，但是第三个峰与峰3的出峰时间明显不同，命名为峰4(如图4)。

[0199] 将天竺葵-3-O-葡萄糖苷和矢车菊-3-O-葡萄糖苷的标准品分别稀释成512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL。做出标准曲线，得出的定量计算公式。根据天竺葵-3-O-葡萄糖苷和矢车菊-3-O-葡萄糖苷的标准曲线可得知，峰1为矢车菊-3-O-葡萄糖苷，峰2为天竺葵-3-O-葡萄糖苷。从这图5A和图5B中可以看出在所有的草莓品种主要积累天竺葵-3-O葡萄糖苷；4-1株系中的天竺葵-3-O-葡萄糖苷和矢车菊-3-O-葡萄糖苷的含量极显著均高于其他品种；在甜查理中未检测到矢车菊-
3-O-葡萄糖苷。

[0200] 三、基因表达分析结果

[0201] 目前，花青素的代谢途径已基本清晰，控制花青素合成的各个结构基因已经被克隆，花青素含量主要受基因表达调控(Espley RV,Hellens RP,Putterill J,Stevenson DE,Kutty-Amma S,Allan AC.Red colouration in apple fruit is due to the activity of the MYB transcription factor,MdMYB10.Plant Journal,2007,49:414-
427)。为诠释4-1株系中花青素高积累的原因，发明人还测定了与草莓花青素代谢相关结构基因和转录因子在不同品种间的表达特性。

[0202] 从图6可以看出，以PMV株系(空载)为对照，4-1株系果实中多数检测基因的表达量高于PMV株系。其中上调趋势最明显的是查尔酮合成酶基因(CHS)，该基因上调8.5倍。其次是查尔酮异构酶基因(CHI)，在4-1株系中上调了6.1倍。另外，4-1株系中黄烷酮-3-羟化酶基因(F3H)、二氢黄酮醇-4-还原酶基因(DFR)、花色素苷合成酶基因(ANS)、类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因(UFGT)也有2-4倍的上调趋势。在与花青素相关的MYB1基因、MYB10基因、bHLH3基因、bHLH33基因表达量的测定中，4-1株系中MYB10基因、bHLH3基因上调明显，上调3-4倍。对于MYB1基因和bHLH33基因，4-1株系的变化趋势不明显。

[0203] 如何使根癌农杆菌介导草莓叶片遗传转化具有较高的转化率以及柑橘八氢番茄红素合成酶基因CitPSY在草莓中稳定表达是本发明所述技术方案的关键内容也是难点。

[0204] 遗传转化的过程相当复杂，受众多因素影响，如根癌农杆菌菌体活力、所带质粒致病性、浓度、侵染时间、共培养时间、抗生素类型、筛选压浓度、受体细胞活力、受体细胞DNA复杂程度、再生培养条件、外植体再生周期等，这些因素交互作用，从而影响转化效率。根癌农杆菌菌液的浓度及侵染时间，必需能够满足能够得到较高再生频率以及较高的转化频率，低浓度的菌液侵染时间过长或者高浓度侵染较短时间都不能得到很好的转化效果。Kan是植物遗传转化中最常用的抗生素，选择合适的Kan浓度是成功筛选并获抗性芽的关键。Kan对于植物组织有不良的影响，浓度过高会对转化细胞造成剧烈的毒害作用，会致使外植体快速死亡；浓度低，筛选不彻底，会得到很多的假阳性苗或者嵌合体苗。Cef是常用的农杆菌抑制剂，为是受体细胞正常发育，要在共培养后抑制农杆菌继续生长。Cef同样对于外植体材料有毒害作用，会抑制愈伤组织形成和不定芽再生，同时会使被侵染叶片发育畸形。本发明中，Kan浓度达到10mg/L时，叶片的愈伤再生率已变的极低，几乎完全抑制不定芽发生。
接种的叶片及再生的不定芽逐渐由绿色变浅至白化死亡。当Kan浓度高于20mg/L时，叶盘得再生几乎被完全抑制。Cef浓度在250mg/L时已能较好抑制根癌农杆菌的繁殖，再高的浓度容易是叶片的生长畸形。在本发明中，共培养后的叶盘用还有相同浓度的Cef液体再生培养基漂洗1-2次，能有有效的抑制农杆菌，很好的降低了愈伤的褐化和叶片的畸形生长。本发明对于Kan浓度的选择与常用的用量差别很大。Kan对草莓叶片的不定芽再生抑制作用很明显，但不同基因型的草莓对其敏感度不同，无法根据已有的用量来直接用于本发明的技术方案中。本发明中，前期以10mg/L Kan作为筛选压，不定芽伸长后，筛选压逐步加大到15mg/L。在生根培养基中，Kan对转化植株的生根具有强烈的抑制作用，不定芽伸长生长后，接种于含有10mg/L Kan的生根培养基中，每3w继代一次，10w后才生根，之后正常生长。

[0205] 本发明中，以推迟2w(即2周)筛选后转化效果最佳，而非立即筛选。叶盘共培养后立即接于筛选培养基上，伤口褐化严重，大部分叶盘黄化或白化，再生率大大降低。推测的原因可能为：叶盘在培养时边缘开始膨大、向上翘起或者卷曲，如果立即接种于含Kan的筛选培养基上筛选培养，叶盘中部受到抗生素影响而产生黄化或白化，导致生长素和营养供应不足，叶盘的边缘上转化的细胞不能分化成芽。此外，单个转化细胞可能不能承受Kan选择压而死亡，推迟10d筛选，其周围形成大量细胞团，增加筛选压的承受能力，但是这种情况下，非转化细胞和转化细胞同时生长，假阳性和嵌合体出现是不可避免的。本发明中，得到的假阳性植株在后期继代中慢慢白化，嵌合体植株中出现一半白化、一半保持绿色的状态，之后也相继死亡。

[0206] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。