本发明公开了一种快速测定N1、N2亚流感病毒的方法，本发明采用一步法荧光定量RT‑PCR检测方法，将Buffer、dNTP、Enhance solution预混成2X one‑step buffer，将多种酶配比进行混合，使本发明的操作的反应液配制更为简单方便，缩短操作时间，同时避免了操作污染，本发明操作简便、敏感性好、方便快捷，适合开发检测用的N1和N2鉴别检测荧光定量RT‑PCR试剂盒，用于N1和N2亚型的临床鉴别诊断和流行病学调查，对我国流感的防控具有重要意义。
1.一种快速鉴别检测禽类动物N1、N2亚型流感病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：取以下浓度及体积的反应试剂放入反应管中混匀：
2X one-step RT-PCRBuffer 12.5μL；
RNase inhibitor 5UM-MLV 40UTaq HS 3U；
启动荧光PCR仪器，将反应管放入PCR仪器中；RT-PCR反应条件：第一步20min 42℃，第二步94℃ 1min，第三步95℃ 15s，60℃ 30s，进行45个循环，4℃ 保存；60℃采集荧光，检测扩增曲线；
所述N1-fwd的碱基序列如SEQ IN NO:1所示；
所述N1-rev的碱基序列如SEQ IN NO:2所示；
所述N2-fwd的碱基序列如SEQ IN NO:3所示；
所述N2-rev的碱基序列如SEQ IN NO:4所示；
所述N1 probe的碱基序列如SEQ IN NO:5所示；
所述N2 probe的碱基序列如SEQ IN NO:6所示；
所述N1 probe5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的淬灭基团为BQ1；N2 probe5’端标记的荧光报告基团是VIC，3’端标记的淬灭基团为BQ2；
N1 RNA模板或N2 RNA模板的制备方法如下：取含N1或N2亚型的病毒，按照Trizol试剂说明提取病毒RNA，取1.5mL的无RNA酶的EP管中加入200μL尿囊液和1mL的Trizol，充分混匀后在室温放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体；加入0.2mL的氯仿，加盖好后剧烈震荡15秒，在室温放置2-3min，然后离心12,000×g，15min，4°C；
离心后管内分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相；RNA沉淀 小心将上层水相转移到另一无RNA酶的EP管中，加入等量体积的预冷异丙醇，室温静置10min，离心12,000×g，15min，4°C;离心后可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀；
RNA洗涤 去上清，向沉淀中加入1mL75%预冷的乙醇洗涤RNA沉淀，轻轻混匀，离心12,000×g，5min，4°C；RNA溶解 去上清，超净台内风干RNA沉淀，加入20μLDEPC水充分溶解RNA。
一种快速鉴别N1、N2亚型流感病毒的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种鉴别流感病毒不同亚型的方法，具体涉及一种利用多重荧光定量PCR方法快速鉴别N1、N2亚型流感病毒的方法。
背景技术
[0002] 流感病毒（Influenza Virus）属正粘病毒科，为RNA病毒。根据病毒膜蛋白（M）和核蛋白（NP）的差异，将流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三个大型。其中A型流感的流行时间最长，危害最大，流行宿主范围也最广。根据病毒表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的结构及其基因特性的不同，又可分为不同亚型。目前A型流感病毒已发现的血凝素（HA）有16个亚型，分别用H1、H2 …H16来表示；神经氨酸酶有9个亚型，分别用NI、N2 …N9来表示。各亚型间的HA和NA交叉组成不同的亚型毒株，如H1N1、H5N2、H5N1、H9N2等。各亚型的基因序列有所不同，病毒特性和抗原性等亦有所不同。其中H5N1、H5N2、H9N2亚型禽流感病毒是目前感染肉鸡、蛋鸡的最常见的亚型，引起鸡群高死亡率的是H5N1、H5N2亚型，H9N2亚型的死亡率较低。因此根据临床鸡群发病死亡情况结合检测N1、N2亚型流感病毒的多重荧光定量RT-PCR方法，使我们能在极短的时间内判断鸡群是由哪种亚型的病毒引起的感染，为临床预防治疗禽病提供理论基础。
[0003] 流感病毒容易变异，变异形式有抗原性变异、温度敏感性变异、宿主范围等方面的变异，但最主要的是抗原性变异。抗原性变异主要是表面抗原HA和NA易变异。流感病毒表面抗原变异幅度的大小，直接影响到病毒传播的能力。若变异幅度小，属于量变，称为抗原漂移。如果抗原变异幅度大，属于质变，称为抗原性转变，形成新的亚型，危害一般较大，往往引起较大的流行，甚至世界性流行。如甲型流感病毒的HA、NA基因容易发生抗原转变，导致HA和NA的部分或大部分氨基酸发生改变，出现抗原性完全不同的新亚型。
[0004] 流感病毒的检测主要依靠实验室进行确切诊断，常规的诊断方法主要包括血清学检测及病原的分离鉴定两方面。病毒的分离是诊断该病最常用的方法之一，通常采用鸡胚接种分离流感病毒，经培养后的病毒经过血凝(HA)及血凝抑制(HI)实验，可初步鉴定出流感病毒。但是病毒分离无论是鸡胚接种还是细胞分离都存在周期过长、不能准确区分病毒亚型、准确性和敏感性差的问题。
[0005] 随着分子生物学的飞速发展，分子生物学技术已广泛应用于流感病毒的测定。尤其是近年来快速发展的荧光定量RT-PCR方法。荧光定量PCR通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号进行实时检测，从而实现对起始模板定量及定性的分析。反转录和PCR扩增又在同一管内完成， 有助于减少操作污染，时间更短、灵敏度更高。在实时荧光定量PCR反应中引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度的变化来监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。最常用的探针是Taq Man 探针，该探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。其序列与目标序列上游引物和下游引物之间的序列高度配对。其中，荧光基团连接在探针的 5’末端，而淬灭基团则在 3’末端。常用的荧光基团有FAM、TET、VIC、HEX等。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光基因与 3’端的淬灭基团接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭基团分离。这样随着扩增循环数的不断增加，释放出来的荧光基团也在不断积累，因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。
[0006] 目前，荧光定量PCR检测被广泛应用于病原微生物检测、基因病诊断、传染病检测和病变检测等。
[0007] N1和N2亚型的AIVs 是感染家禽并能致病的常见NA 亚型（如H5N1、H5N2、H9N2等）。目前检测AIV 的方法多是针对其HA亚型的检测，如H3、H4、H5、H7、H9等亚型，针对NA亚型的检测技术少有报道，尤其是针对多个NA亚型的鉴别诊断。因此，本研究建立了一种快速、敏感、特异的多重荧光定量RT-PCR方法，可同时检测N1、N2亚型的流感病毒。
发明内容
[0008] 为了解决以上技术问题，本发明提供了一种快速鉴别N1、N2亚型流感病毒的多重荧光定量PCR方法。
[0009] 具体鉴别方法如下：
[0010] 取以下浓度及体积的反应试剂放入反应管中混匀：
[0011] 2X one-step RT-PCR Buffer 12.5μL；
[0012] 三种混合酶：
[0013] RNase inhibitor 5U[0014] M-MLV 40U[0015] Taq HS 3U；
[0016] N1-fwd （浓度为20μM） 0.5μL ；
[0017] N1-rev （浓度为20μM） 0.5μL ；
[0018] N2-fwd （浓度为20μM） 0.5μL ；
[0019] N2-rev （浓度为20μM） 0.5μL ；
[0020] N1 probe 10μM 0.5μL ；
[0021] N2 probe 10μM 0.5μL ；
[0022] N1RNA模板 10ng-1μg；
[0023] N2 RNA模板 10ng-1μg；
[0024] RNase-free ddH2O 补至25μL；
[0025] 启动荧光PCR仪器，将反应管放入PCR仪器中，RT-PCR反应条件：第一步20 min 42℃，第二步94℃ 1 min，第三步95℃ 15s，60℃ 30s，进行45个循环，4℃ 保存；60℃采集荧光，检测扩增曲线，即得。
[0026] 引物和探针的碱基序列如下：
[0027]
[0028] 所述N1 probe 5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的淬灭基团为BQ1；N2 probe 5’端标记的荧光报告基团是VIC，3’端标记的淬灭基团为BQ2；
[0029] 所述RNA模板的制备方法如下：
[0030] 取含N1或N2亚型的病毒，按照Trizol试剂说明提取病毒RNA：置于1.5mL的无RNA酶的EP管中加入200μL尿囊液和1mL的Trizol，充分混匀后在室温放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体； 加入0.2 mL 的氯仿，加盖好后剧烈震荡15秒，在室温放置2-3min，然后离心 12,000× g，15 min，4°C；离心后管内分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相； RNA沉淀 小心将上层水相转移到另一无RNA酶的EP管中， 加入等量体积的预冷异丙醇，室温静置10 min，离心12,000 × g，15min，4°C；离心后可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀； RNA洗涤 去上清，向沉淀中加入1mL 75%预冷的乙醇洗涤RNA沉淀，轻轻混匀，离心12,000 × g，5min， 4°C； RNA溶解 去上清，超净台内风干RNA沉淀，加入20μL DEPC水充分溶解RNA。
[0031] 使用本发明提供的方法，可快速的鉴别检测N1、N2亚型的流感病毒。
附图说明
[0032] 图1为N1的扩增曲线；
[0033] 图2为N2的扩增曲线；
[0034] 图3为N1和N2特异性扩增曲线；
[0035] 图4为N1灵敏度检测扩增曲线；
[0036] 图5为N1基因扩增的标准曲线；
[0037] 图6为为N2灵敏度检测扩增曲线；
[0038] 图7为N2基因扩增的标准曲线。
具体实施方式
[0039] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0040] 实施例1
[0041] 材料与方法
[0042] 一、材料
[0043] 1、病毒模板：N1为已鉴定的两株H5N1等量进行混合提取的总RNA，N2为已鉴定的一株H5N2和一株H9N2样品等量进行混合提取的总RNA。
[0044] 2、主要试剂：小量质粒提取试剂盒和One-step Real-time RT-PCR kit均购自TaKaRa公司。
[0045] 3、引物和探针的设计与合成：选取以上毒株N1和N2基因的高度保守区，用Primer Express进行引物和探针的设计。N1探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的淬灭基团为BQ1；N2探针5’端标记的荧光报告基团是VIC，3’端标记的淬灭基团为BQ2，引物和探针均由Life公司合成，其中引物为PAGE级纯化，探针为HPLC级纯化。引物和探针的详细序列和未知，见表1。
[0046] 4、主要仪器：荧光定量PCR仪为CFX 384 touch Real-time PCR detection systems，购自美国BIO-RAD公司。
[0047] 表1 引物和探针的序列
[0048]
[0049] 二、方法
[0050] 1、N1和N2引物进行单独扩增
[0051] 一步法RT-PCR预混体系
[0052] 2X one-step RT-PCR Buffer 12.5μL；
[0053] 三种混合酶
[0054] RNase inhibitor 5U[0055] M-MLV 40U[0056] Taq HS 3U；
[0057] N1-fwd/ N2-fwd （浓度为20μM） 0.5μL ；
[0058] N1-rev / N2-rev （浓度为20μM） 0.5μL ；
[0059] N1 probe / N2 probe 10μM 0.5μL ；
[0060] N1 RNA模板 / N12RNA模板 10ng-1μg；
[0061] RNase-free ddH2O 补至25μL；
[0062] 2、多重荧光RT-PCR检测
[0063] 加等量多套探针引物，具体如下：
[0064] 2Xone-step RT-PCR Buffer 12.5μL；
[0065] 混合酶
[0066] RNase inhibitor 5U[0067] M-MLV 40U[0068] Taq HS 3U；
[0069] N1-fwd 20μM 0.5μL；
[0070] N1-rev 20μM 0.5μL；
[0071] N2-fwd 20μM 0.5μL；
[0072] N2-rev 20μM 0.5μL；
[0073] N1 probe 10μM 0.5μL；
[0074] N2 probe 10μM 0.5μL；
[0075] N1RNA模板 10ng-1μg；
[0076] N2RNA模板 10ng-1μg；
[0077] RNase-free ddH2O 补至25μL。
[0078] 启动荧光PCR仪器，将反应管放入PCR仪器中。RT-PCR反应条件：第一步20 min 42℃，第二步94℃ 1 min，第三步95℃ 15s，60℃ 30s，进行45个循环，4℃ 保存。注：60℃采集荧光。记录扩增曲线。
[0079] 三、N1和N2基因的灵敏度实验和标准曲线
[0080] 3.1 质粒的提取
[0081] 取过夜菌1-5 ml，加入离心管中，12,000rpm离心1分钟收集细菌，弃上清。注意：尽量吸除全部上清。向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μL SolutionⅠ（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液枪或涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。向离心管中加入250 μL SolutionⅡ，轻轻颠倒离心管混匀5-10次，静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。向离心管中加入350 μL Solution Ⅲ，立即反转多次，至溶液充分混匀，出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10分钟，吸取上清，将上清加入过滤柱中，室温下12,000rpm离心1分钟过滤，收集滤液。向吸附柱中加入650 μL Washing Buffer（确保已加入无水乙醇），室温下12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。 重复上述步骤。将吸附柱重新放回收集管中，12,000 rpm室温离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温干燥5分钟。将吸附柱置于一个新的收集管中，向吸附膜的中间部位加入50μL ddH2O（pH在7.0-8.5之间）或Elution Buffer，室温放置2-5分钟，12,000rpm离心2分钟，将质粒溶液收集到离心管中。-20℃保存质粒。
[0082] 敏感性检测和标准曲线
[0083] 模板分别为N1片段或N2片段连接的PMD19-T载体质粒，初始模板浓度为109copies/μL。观察对N1和N2单独扩增，同时扩增曲线，并将模板进行连续的10倍倍比稀释后进行荧光定量的扩增后曲线。
[0084] 三、结果
[0085] N1基因的单独扩增曲线
[0086] 图1中N1基因获得特异性的扩增（波浪线所示），而N2基因未获扩增（虚线所示）。黑色实线扩增为空模板对照。
[0087] N2基因的单独扩增曲线
[0088] 图2中N2基因获得特异性的扩增（虚线），而N1基因未获扩增（黑色）。
[0089] N1和N2特异性检测—双重荧光定量RT-PCR（FAM/VIC）
[0090] 从图3中可以看出N1和N2在双重荧光定量RT-PCR得到了预期相应的扩增，证明了反应的特异性，不存在交叉扩增（N1为波浪线、N2为实线）。
[0091] N1基因扩增的灵敏度实验
[0092] 图4 为N1基因敏感性检测的扩增曲线，图5为标准曲线。模板为N1片段连接的T载体质粒，初始模板浓度为109copies/μL。将模板进行10倍的倍比稀释，从图4中看出，进行8倍稀释的模板仍能获得扩增。标准曲线的计算公式为Cq=35.9-2.96log10（q）， E=2.177，R2=0.9964, Error=0.406。注：q=模板copies。因此，本次实验检测灵敏度可达到10-100 copies。
[0093] N2基因扩增的灵敏度实验
[0094] 图6 为N2基因敏感性检测的扩增曲线，图7为标准曲线。反应模板为N2片段连接的9
PMD19-T载体的重组质粒，初始模板浓度为10copies/μL。将模板进行10倍的倍比稀释，从图6中看出，进行8倍稀释的模板仍能获得有效的扩增。标准曲线的计算公式为Cq=37.72-
3.12log10（q）， E=2.09， R2=0.9948, Error=0.519。注：q=模板copies。因此本次实验检测灵敏度可达到10-100 copies。
[0095] 综合分析：
[0096] 以上实验结果证明了该多重鉴别检测方法的特异性和准确性。常规的病毒分离方法需要3-5天的时间，而荧光定量PCR只需数小时，而且其具有良好的特异性和敏感性。而本发明采用的一步法荧光定量RT-PCR检测方法，将Buffer、dNTP、Enhance solution预混成2X one-step buffer，将多种酶配比进行混合，使实验操作的反应液配制更为简单方便，缩短操作时间，同时避免了操作污染。因此本发明方法建立了针对N1和N2亚型的快速检测方法，操作简便、敏感性好、方便快捷，适合开发检测用的N1和N2鉴别检测荧光定量RT-PCR试剂盒，用于N1和N2亚型的临床鉴别诊断和流行病学调查，对我国流感的防控具有重要意义。
