一种基于抗痢疾杆菌效应当量因子调节黄连药材用量的方法

摘要

本申请提供了一种基于抗痢疾杆菌效应当量因子调节黄连药材用量的方法，包括以下步骤(1)测量黄连药材中的活性成分的含量；(2)计算黄连抗痢疾杆菌效应当量因子；(3)根据抗痢疾杆菌效应当量因子来调节黄连药材的用量。本发明以临床功用为导向，抗痢疾杆菌效应当量因子可表征黄连抗痢疾杆菌药效活性，指导临床个体化用药标准的建立和完善；解决多成分指标对黄连药效的贡献度差异问题，使黄连品质评价实现综合、量化、集成；可直接通过检测黄连成分含量表征其“效”，施行简易可重复，可操作性强。

权利要求

1.一种基于抗痢疾杆菌效应当量因子调节黄连药材用量的方法，所述方法包括以下步骤：(1)测量所述黄连药材中的小檗碱BER、表小檗碱EPI、黄连碱COP、巴马汀PAL和药根碱JAT的含量，即分别测量XBER、XEPI、XCOP、XPAL、XJAT；

(2)构建黄连药材的抗痢疾杆菌效应当量因子，包括：

a.考察不同浓度的小檗碱BER、表小檗碱EPI、黄连碱COP、巴马汀PAL和药根碱JAT对痢疾杆菌生长的抑制率，将抑菌率与浓度进行线性关系分析，计算二者的量效关系方程；

b.将小檗碱BER、表小檗碱EPI、黄连碱COP、巴马汀PAL和药根碱JAT的量效关系方程加和得到黄连的抗痢疾杆菌效应加和值，与对照药材成分抗痢疾杆菌效应加和值0.9583之比，定义为黄连的抗痢疾杆菌效应当量因子方程，即公式I：EEF测＝3.352*XBER+1.293*XEPI+6.635*XCOP+0.140*XPAL+0.419*XJAT-0.111所述EEF测定义为待测黄连药材的抗痢疾杆菌效应当量因子；

(3)利用公式II计算黄连药材的实际用量

公式II：D测＝Dtarget/EEF测；其中所述D测为待测黄连药材的实际用量，Dtarget为黄连药材的目标用量。

2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的所述测量采用高效液相色谱法。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述黄连药材选自毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao和云连Coptis teeta Wall。

说明书

一种基于抗痢疾杆菌效应当量因子调节黄连药材用量的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基于抗痢疾杆菌效应当量因子调节黄连药材用量的方法。

背景技术

[0002] 黄连(Coptidis Rhizoma)为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao和云连Coptis teeta Wall.的干燥根茎。常用于清热燥湿、泻火解毒，与其药效活性相关的成分为生物碱类成分，包括小檗碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、药根碱等。现代药理研究表明，黄连具有抗菌、抗肿瘤、降血糖、抗病毒、抗炎等作用，其中黄连对痢疾杆菌的抑制作用与其传统功效“止痢”具有重要的相关性。

[0003] 作为临床大宗药材，如何对黄连质量进行有效评控将对保证其临床疗效和促进其产品开发具有重要意义。当前主要以多个指标成分定量分析来实现对黄连品质的评控，但这种方法没有反映出不同成分对药材整体药效的贡献度差异，忽视了不同成分所关联的药效大小有所区别，实际应用时难以评价不同药材的品质优劣情况。对黄连来说，现行标准对其进行质量把关的指标成分包括小檗碱、黄连碱、表小檗碱、巴马汀四个生物碱类成分，在实际检测中发现，两批黄连中，一批的小檗碱含量8.2％，黄连碱为2.7％，另一批的小檗碱含量为9.5％，黄连碱为1.8％时，此时如何通过观察成分含量情况来判断这两批药材的质量差异呢？

[0004] 此外，不同于化学药品，其成分结构清楚，构效关系明确，鉴别、检查、含量测定可以直接作为疗效评价的指标。而对于中药来说，其物质内涵复杂，仅检测成分含量就会导致很多局限性，需要将质控指标切实关联药效活性。但若仅在当前成分含测的基础上单纯添加这些药效活性指标，则会增加今后质控标准施行时的难度和复杂度。因为每个药效指标的增添，会导致每种药材有更多要满足的标准，更多繁琐的操作，耗费更多实验材料和实验动物，这势必会造成能源资源的浪费。况且，这种多指标质控模式所带来的贡献度差异问题依然没有解决，无法说明其中哪个指标对药材质量有更重要的关联。

[0005] 因此，若能建立一种综合的既能直接关切“可控有效”，又不会增加质控模式施行难度，同时能指导临床用药的黄连质量评控方法，将对黄连及其他中药质控标准的完善具有重要意义。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种基于黄连药材的抗痢疾杆菌效应当量因子(Effect equivalency factor,EEF)调节黄连药材用量的方法。

[0007] 本发明的基于黄连药材的抗痢疾杆菌效应当量因子调节黄连药材用量的方法包括以下步骤：

[0008] (1)测量所述黄连药材中的小檗碱(BER)、表小檗碱(EPI)、黄连碱(COP)、巴马汀(PAL)和药根碱(JAT)的含量，即分别测量XBER、XEPI、XCOP、XPAL、XJAT；

[0009] (2)利用公式I来计算待测黄连药材的抗痢疾杆菌效应当量因子:

[0010] 公式I：EEF＝3.352*XBER+1.293*XEPI+6.635*XCOP+0.140*XPAL+0.419*XJAT-0.111；

[0011] 所述EEF为待测黄连药材的抗痢疾杆菌效应当量因子；

[0012] (3)利用公式II计算黄连药材的实际用量:

[0013] 公式II为D测＝Dtarget/EEF；其中所述D测为待测黄连药材的实际用量，Dtarget为黄连药材的目标用量。

[0014] 本发明的基于抗痢疾杆菌效应当量因子来调节黄连用量的方法不仅能仅通过测量成分含量来反映其“效”，不会增加质量标准在施行时的难度，具有精准可量化、集成可重现、综合可操作、有效可适用的特点，并且能关联药材临床效用，根据抗痢疾杆菌效应当量因子对黄连用量进行调试，保证效应当量一致性，对黄连药材的品质评控标准的创新整合研究和临床用药指导具有重要意义。

具体实施方式

[0015] 以下结合具体实例来进一步说明发明内容。

[0016] 本发明的基于抗痢疾杆菌效应当量因子调节黄连用量的方法可对黄连样品进行活性评价和临床用量调适。

[0017] 试验中所用到的仪器：粉碎机；分析天平(JM-B型，余姚市纪铭称重校验设备有限公司)；旋转蒸发仪(R205B，上海申生科技有限公司)；电热鼓风干燥箱(DHG9070A，上海一恒科学仪器有限公司)；循环水多用真空泵(SHB-B95，郑州长城科工贸有限公司)；Agilent 1100高效液相色谱仪(DAD检测器)，Chemstations色谱工作站(美国Agilent有限公司)；
BS210S型电子天平(北京Sartorious有限公司)；水为蒸馏水。

[0018] (1)测量所收集的黄连药材中的小檗碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、药根碱的含量：

[0019] 表1所收集的黄连药材

[0020]

[0021] (i)首先制备黄连水提物：取黄连药材除去杂质，洗净干燥后粉碎成粗粉。称取不同批次的黄连药材粉末各50g，加水浸泡30分钟，水煎提取3次(加水量分别为药材重量的10、10、8倍，各提取1.5、1.0、0.5小时)，趁热滤过，合并滤液，减压浓缩，将浸膏转至烘箱中，
75℃烘干，即得黄连水提样品干粉。

[0022] (ii)对照品溶液制备：精密称取小檗碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、药根碱各适量，分别置于棕色量瓶中，加盐酸-甲醇(1:100)分别配制成各对照品储备液。精密量取各对照品储备液适量，置于同一棕色量瓶中，配制成每1ml分别含小檗碱0.4337mg、表小檗碱0.1052mg、黄连0.0606mg、巴马汀0.1160mg、药根碱0.0721mg的混合对照品贮备溶液，备用(10℃以下密封保存)。

[0023] (iii)供试品溶液制备：称取黄连水提浸膏粉末样品约50mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入盐酸-甲醇(1:100)50ml，称定重量，60℃水浴中加热15分钟，取出，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用盐酸-甲醇(1:100)补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。

[0024] (iv)液相色谱法测量：

[0025] 色谱条件：色谱柱：Kromasil 100-8C18(250mm×4.6mm)；流动相A：乙腈(1.5g十二烷基硫酸钠/500ml)-水(2:1)(磷酸调pH 6.0)，流动相B：水(3.0g磷酸二氢钾/500ml)，线性梯度洗脱程序(0min：38％B，55min：38％B，65min：15％B，70min：0％B)；检测波长：345nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl。

[0026] 测量结果如表2所示。

[0027] 表2：黄连药材中的活性成分含量

[0028]

[0029]

[0030] (2)黄连的抗痢疾杆菌效应当量因子的构建：

[0031] ①痢疾杆菌接种：精取1.1mL痢疾杆菌原菌液(第四代)，用L.B.培养基稀释成总体积为44mL的接种培养基，即原菌液扩大40倍，痢疾杆菌浓度为1×106CFU/mL。②在洁净无菌的环境下，向每个体积为20mL的玻璃安瓿瓶中精确加入5mL已接种了痢疾杆菌的L.B.培养基，然后向各瓶中分别加入不同体积的活性成分储备液，定容至10mL，使活性成分终浓度分别为0.00mg/mL，0.05mg/mL，0.10mg/mL，0.15mg/mL，0.20mg/mL，0.25mg/mL，加盖瓶塞，密封，放入微量量热仪中，通过仪器自带的记录跟踪软件检测各安瓿瓶中痢疾杆菌生长代谢的“功率-时间(power-time，P-t)”曲线变化。仪器的温度控制于37℃，当所有的曲线全部重新返回基线时，结束实验。通过软件导出相应数据，并将曲线上的数据导入Origin 8.5软件(Origin Lab公司，美国)作图。③进行抑菌率I％(Inhibition ratio)计算，公式如下：I％＝(t2–t0)/t0×100％，其中，t0为未经药物干预时痢疾杆菌生长代谢的第二指数生长期的达峰时间，t2为药物干预时痢疾杆菌生长代谢的第二指数生长期的达峰时间。根据黄连各活性成分作用下痢疾杆菌生长代谢的第二指数生长期的达峰时间t2，计算不同浓度各成分对痢疾杆菌生长的抑制率I％。将抑菌率I％(y)与浓度C(x)进行线性关系分析，计算二者的量效关系方程，结果见表3。

[0032] 表3

[0033]

[0034] 将五种活性成分的量效关系方程加和得到黄连的抗痢疾杆菌效应加和值，与对照药材成分抗痢疾杆菌效应加和值0.9583之比，即为该批黄连的抗痢疾杆菌效应当量因子方程，即公式I：

[0035] EEF＝3.352*XBER+1.293*XEPI+6.635*XCOP+0.140*XPAL+0.419*XJAT-0.111。

[0036] (3)验证黄连抗痢疾杆菌效应当量因子对其药效活性的代表性：

[0037] ①痢疾杆菌接种：精取1.1mL痢疾杆菌原菌液(第四代)，用L.B.培养基稀释成总体积为44mL的接种培养基，即原菌液扩大40倍，痢疾杆菌浓度为1×106CFU/mL。②采用安瓿法，在洁净无菌的环境下，向每个体积为20mL的玻璃安瓿瓶中精确加入5mL已接种了痢疾杆菌的L.B.培养基，然后向各瓶中分别加入不同体积的黄连样品储备液，定容至10mL，使黄连水提物终浓度分别为0.00mg/mL，0.20mg/mL，0.40mg/mL，0.60mg/mL，0.80mg/mL，1.00mg/mL，加盖瓶塞，密封，放入微量量热仪中，通过仪器自带的记录跟踪软件检测各安瓿瓶中痢疾杆菌生长代谢的P-t曲线变化。仪器的温度控制于37℃，当所有的曲线全部重新返回基线时，结束实验。③以同浓度小檗碱为阳性对照，以0.20mg/mL作为考察不同批次黄连水提物对痢疾杆菌产生抑制作用的浓度，根据t2，计算不同批次黄连样品对痢疾杆菌的抑制率Im％；并以相同浓度的小檗碱抑制率IBER％为对照，计算各批次黄连水提物的相对抑菌率RIm％，公式为RIm％＝Im/IBER×100％。④将各批次黄连水提物的活性成分含量值带入公式I，计算它们的EEF，将各批样品的相对抑制率结果与EEF进行相关性分析，结果如表4所示，说明二者具有显著相关性，EEF能较好地代表黄连药材抑菌活性。

[0038] 表4

[0039]

[0040] 黄连的抗痢疾杆菌效应当量因子EEF的应用：

[0041] 将按照前述步骤(1)的方法测得的各批次黄连药材的活性成分的含

[0042] 量值代入公式I中，得到黄连药材的EEF，结果如表5所示：

[0043] 表5

[0044]

[0045] 然后，根据公式II：D＝Dtarget/EEF，假设目标剂量Dtarget为1克，则[0046] 待测的黄连药材的实际用量如表6所示：

[0047] 表6

[0048]

[0049] 本发明所建立的基于抗痢疾杆菌效应当量因子调节黄连用量的方法经验证能较好地代表黄连抗痢疾杆菌活性。作为化学成分分析与生物活性综合加权的指标，其以集成量化的形式解决了靠多指标评价黄连品质时出现的指标间相悖结果难以评价药材品质差异的问题。由于直接给每个活性成分分配了药效权重系数，系数越大，则该成分对黄连抗痢疾杆菌效应的代表性越强。在临床使用评控黄连品质时，可直接通过检测成分含量去体现该批黄连之“效”，不增加质量标准的施行难度，实现中药质量评控模式的简单易行、科学有效。同时，效应当量因子可在一定程度指导临床用药，指数高的药材在临床使用时可适当降低用量，指数低的药材可增加临床用量，以保证效应当量的一致性。综上，基于效应当量一致性的黄连用量调适方法，使综合量化集成地评控中药品质和指导临床用药成为可能。

[0050] 本发明的方法还可对黄连中不同活性成分进行效应当量因子构建，还可采用不同目标剂量的用量调适，以上仅为说明发明内容所列举的实例，一切基于本发明实质内容所做出的黄连批次、成分、目标用量等简单的变化，均应落在本发明的保护范围内。