一种吡哌酸的ELISA检测方法及应用转让专利
申请号 : CN201510351080.X
文献号 : CN105044333B
文献日 : 2017-07-11
发明人 : 雷红涛 , 陈佳虹 , 卢蓝蓝 , 孙远明 , 徐振林 , 杨金易 , 沈玉栋 , 王弘 , 肖治理
申请人 : 华南农业大学
摘要 :
本发明公开了一种吡哌酸的ELISA检测方法及其应用。该ELISA检测方法是利用吡哌酸抗体和包被原组合的ELISA检测体系建立的；所述包被原为吡哌酸包被原或喹诺酮类包被原；具体是采用异源模式，以吡哌酸抗体和包被原洛美沙星‑OVA为最优组合建立的一种更加灵敏有效的吡哌酸的ELISA检测方法。本发明的ELISA检测方法高效、方便、高灵敏和高特异性，检测的线性范围（IC20～IC80）为0.9～38.5 ng/mL，半抑制浓度(IC50)为5.99 ng/mL，最低检测限为0.31 ng/mL；而且前处理方法操作简单，能够满足残留检测的要求，可应用于快速检测食品中非法添加的吡哌酸，具有广阔的应用前景。
权利要求 :
1.一种吡哌酸的ELISA检测方法，其特征在于，是利用吡哌酸抗体和包被原组合的ELISA检测体系建立的；所述包被原为喹诺酮类包被原；所述喹诺酮类为洛美沙星。
2.根据权利要求1所述吡哌酸的ELISA检测方法，其特征在于，所述吡哌酸抗体是利用吡哌酸免疫原制备得到，所述吡哌酸免疫原是以吡哌酸为半抗原与载体蛋白偶联得到；所述喹诺酮类包被原是以洛美沙星为半抗原与载体蛋白偶联得到。
3.根据权利要求2所述吡哌酸的ELISA检测方法，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。
4.根据权利要求2所述吡哌酸的ELISA检测方法，其特征在于，所述吡哌酸免疫原是以吡哌酸为半抗原，通过碳二亚胺法与牛血清白蛋白偶联得到；所述喹诺酮类包被原是以洛美沙星为半抗原，通过碳二亚胺法与卵清蛋白偶联得到。
5.根据权利要求1～4任一项所述吡哌酸的ELISA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.待测样品前处理；
S2.利用权利要求1所述吡哌酸抗体和包被原组合的ELISA检测体系进行检测；
步骤S1所述待测样品前处理的具体步骤为：
当待测样品为牛奶时，样品前处理方法具体步骤如下：吸取待测样品牛奶，按照吡哌酸标准品：待测样品为30～400 ng/g的比例，加入吡哌酸标准品，以10000 r/min离心10 min，拨去脂肪层，吸取上层清液，用PBS稀释20倍后进行检测；
当待测样品为鸡蛋时，样品前处理方法具体步骤如下：取鸡蛋蛋液充分匀浆，按照吡哌酸标准品：待测样品为30～400 ng/g的比例，加入吡哌酸标准品，再加入体积比1：1的pH7.4 PBS缓冲液和甲醇混合液作为提取液，混匀，涡旋30 s后振荡30 min；以4000 r/min离心10 min，取上层清液稀释10倍后进行检测；若不能及时检测，可将得到的上层清液置于4℃冰箱保存，在检测前将样品取出，以4000 r/min离心10 min后，取上层清液稀释10倍后进行检测；
当待测样品为鸡肉或猪肉时，样品前处理方法具体步骤如下：将鸡肉或猪肉匀浆后，按照吡哌酸标准品：待测样品为30～400 ng/g的比例，加入吡哌酸标准品，再加入体积比为9：
1的pH7.4 PBS缓冲液和0.1 mol/L NaOH溶液的混合液作为提取液，混匀，涡旋1 min后以
8000 r/min离心10 min，吸取上层清液，沉淀用提取液重复提取一次，步骤同上，合并上清液用PBS稀释5倍后进行检测。
6.权利要求1～5任一项所述吡哌酸的ELISA检测方法在检测吡哌酸中的应用或在构建吡哌酸检测试剂盒中的应用。
7.吡哌酸人工抗原为免疫原用于免疫，和洛美沙星人工抗原为包被原的组合在检测吡哌酸或在建立吡哌酸检测方法及试剂盒中的应用，其特征在于，所述吡哌酸人工抗原的结构式如式（I）所示，所述洛美沙星人工抗原的结构式如式（Ⅱ）所示：， 。
说明书 :
一种吡哌酸的ELISA检测方法及应用
技术领域
[0001] 本发明属于食品安全技术领域。更具体地，涉及一种吡哌酸的ELISA检测方法及应用。
背景技术
[0002] 吡哌酸（Pipemidic Acid，简称PPA），为微黄色或淡黄色的结晶性粉末，无臭，味苦，是人工合成的第二代喹诺酮类抗菌药。该药由2,4-二氯嘧啶-5-羧酸乙酯与β-乙氨基丙酸乙酯缩合环化为2-氯-5-羟基-7,8-二氢-8-乙基吡啶[2,3-d]嘧啶-6-羧酸酯，然后溴化后与哌嗪缩合、水解、中和而得。吡哌酸分子式为C14H17N5O3，分子量：303.32，其结构式如式（III）所示：
[0003] 。
[0004] 吡哌酸对绿脓杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌等革兰阴性杆菌有较强的抗菌作用，用于治疗泌尿道感染及耳鼻喉科干扰等病症。吡哌酸作为一种喹诺酮类（QNs）药物，因其能抑制细菌DNA螺旋酶、抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强，抗菌作用是磺胺类药的近千倍，且其为化学合成药物，价格低廉，故在医学和兽医学很快取得广泛应用，尤其在水产养殖中成为最重要的抗感染药物之一。QNs药物对动物体以及人体的绝大部分器官和组织都有不同程度的不良反应：由于QNs药物呈脂溶性，可通过血脑屏障进入脑组织，抑制γ-氨基丁酸（GABA）与其受体结合而产生神经系统反应。故以神经系统的损伤最为常见，其次是皮肤及其附件的损伤。多数不良反应症状较轻，且可逆，但也有较重甚至危及生命的。动物实验表明，QNs药物可引起幼畜关节炎、跟腱炎、也能引起过敏性休克，恶心呕吐，静脉炎等症状以及某些潜在的致癌性质，同时由于致病菌产生的耐药性，吡哌酸药物的残留问题引起广泛关注。我国农业部规定大部分喹诺酮类药物的最高残留限量为100 μg/ L，欧盟也规定喹诺酮类药物的最高残留限量大多为100 μg/ kg。
[0005] 目前，国内外对食品中吡哌酸的常用检测方法是液相色谱-质谱/质谱法、共振散射光谱法和电化学法。
[0006] 但是由于色谱法的样品前处理复杂繁琐，并且仪器昂贵，成本高，不能实现对吡哌酸进行快速、高效的检测和监测。而共振散射光谱法和电化学法的检测灵敏度较低，对试剂、环境要求高，无法满足吡哌酸的检测要求。如陈珍珊等采用反相离子对高效液相色谱法测定吡哌酸片的含量，所建方法线性范围为1.069～8.552 μg/mL，药品样品回收率为99.5%。然而该法的仪器昂贵，成本高，耗时长，不能实现对吡哌酸高效快速的检测和监控。
Shi-Lu Chen 等采用流动注射化学发光法测定尿液和药片中的吡哌酸，所建方法检测范围-9 -7 -10
为3.0×10 ～8.0×10 mol/L，检测限为6.7×10 mol/L，然而该法的选择性不高，有时需和分离方法结合，对试剂、环境要求高，且对食品样品的前处理复杂繁琐，无法满足吡哌酸的快速检测要求。Solangi等采用溶出伏安法同时检测药品中的吡哌酸和氧氟沙星，所建方法的检测范围均为10～100 μg/mL，检出限为50 ng/mL和1 μg/mL，该法也可用于人尿的检测，然而，该法的检测灵敏度较低，无法满足吡哌酸的快速检测要求。专利《用共振散射光谱测定吡哌酸的方法》（申请号：201210108204.8），利用吡哌酸与四苯硼钠在pH 3.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中形成离子缔合物微粒，该微粒在480 nm波长处产生一个共振散射光谱峰，且共振散射强度与吡哌酸浓度呈线性关系，据此建立的一个测定吡哌酸含量的共振散射光谱分析方法，该法测定吡哌酸的线性范围为1.0～95 μg/mL，检出限为0.5 μg/mL。这种方法的检测限较高，未能满足吡哌酸检测要求。
Shi-Lu Chen 等采用流动注射化学发光法测定尿液和药片中的吡哌酸，所建方法检测范围-9 -7 -10
为3.0×10 ～8.0×10 mol/L，检测限为6.7×10 mol/L，然而该法的选择性不高，有时需和分离方法结合，对试剂、环境要求高，且对食品样品的前处理复杂繁琐，无法满足吡哌酸的快速检测要求。Solangi等采用溶出伏安法同时检测药品中的吡哌酸和氧氟沙星，所建方法的检测范围均为10～100 μg/mL，检出限为50 ng/mL和1 μg/mL，该法也可用于人尿的检测，然而，该法的检测灵敏度较低，无法满足吡哌酸的快速检测要求。专利《用共振散射光谱测定吡哌酸的方法》（申请号：201210108204.8），利用吡哌酸与四苯硼钠在pH 3.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中形成离子缔合物微粒，该微粒在480 nm波长处产生一个共振散射光谱峰，且共振散射强度与吡哌酸浓度呈线性关系，据此建立的一个测定吡哌酸含量的共振散射光谱分析方法，该法测定吡哌酸的线性范围为1.0～95 μg/mL，检出限为0.5 μg/mL。这种方法的检测限较高，未能满足吡哌酸检测要求。
[0007] 因此，为了实现吡哌酸快速检测，有必要研制建立一种更加简单快捷方便、高灵敏度和高特异性的吡哌酸检测方法。
发明内容
[0008] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术中吡哌酸检测方法的的缺陷和不足，提供一种用于快速简便检测吡哌酸的免疫检测方法。所述免疫检测方法是采用异源模式，利用吡哌酸抗体与非吡哌酸包被原组合的，利用最优组合建立的吡哌酸ELISA检测方法可方便、快捷、准确、特异地检测出食品中是否含有吡哌酸。
[0009] 本发明的目的是提供一种吡哌酸的人工抗原。
[0010] 本发明另一目的是提供一种吡哌酸的ELISA检测方法及应用。
[0011] 本发明的再一目的是提供上述吡哌酸的ELISA检测方法的应用。
[0012] 本发明还提供了检测吡哌酸的几种样品的前处理方法。
[0013] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：
[0014] 一种吡哌酸的ELISA检测方法，是采用异源模式，利用吡哌酸抗体和包被原组合的ELISA检测体系建立的；所述包被原为吡哌酸包被原或喹诺酮类包被原。
[0015] 其中，所述吡哌酸抗体是利用吡哌酸免疫原制备得到，所述吡哌酸免疫原是以吡哌酸为半抗原与载体蛋白偶联得到；所述吡哌酸包被原是以吡哌酸为半抗原与载体蛋白偶联得到；所述喹诺酮类包被原是以喹诺酮类为半抗原与载体蛋白偶联得到。
[0016] 优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA）。
[0017] 更优选地，所述吡哌酸免疫原是以吡哌酸为半抗原，通过碳二亚胺法（EDC法）与牛血清白蛋白（BSA）偶联得到；所述吡哌酸包被原是以吡哌酸为半抗原，通过碳二亚胺法（EDC法）与卵清蛋白（OVA）偶联得到；所述喹诺酮类包被原是以喹诺酮类为半抗原，通过碳二亚胺法（EDC法）与卵清蛋白（OVA）偶联得到。
[0018] 更进一步优选地，所述喹诺酮类是环丙沙星、帕珠沙星、加替沙星、洛美沙星、沙拉沙星或格林沙星。
[0019] 具体地，本发明上述吡哌酸 ELISA检测方法，是利用吡哌酸抗体分别与7种包被原（同源包被原和异源包被原）组合，优选出特异性、灵敏度最高的组合，并以此为基础，建立ELISA检测方法。
[0020] 所优选出来的最佳方案为异源模式，即利用吡哌酸抗体与异源包被原组合，最佳组合为以吡哌酸免疫原制备的吡哌酸抗体与异源包被原洛美沙星-OVA的组合；所述吡哌酸免疫原是以吡哌酸为半抗原，通过碳二亚胺法（EDC法）与牛血清白蛋白（BSA）偶联得到；所述异源包被原洛美沙星-OVA是以洛美沙星为半抗原，通过碳二亚胺法（EDC法）与卵清蛋白（OVA）偶联得到。该最佳组合建立的吡哌酸 ELISA检测方法的特异性、灵敏度最高。
[0021] 另外，优选地，上述采用碳二亚胺法制备吡哌酸免疫原的具体步骤如下：
[0022] S1.将吡哌酸（半抗原）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）溶于加入了一定量氢氧化钠的磷酸盐缓冲溶液中，记为A液，载体蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，记为B液；
[0023] S2.将A液加入B液中，常温搅拌反应20～40 min；
[0024] S3.待步骤S2反应完成后，将反应后混合液装入透析袋，用磷酸盐缓冲溶液透析即得目的产物吡哌酸-BSA或吡哌酸-OVA。
[0025] 上述采用碳二亚胺法制备喹诺酮类的人工抗原的具体步骤如下：
[0026] S1.将喹诺酮类（半抗原）溶于磷酸盐缓冲溶液中，并加入载体蛋白OVA；
[0027] S2.将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺加入S1所述溶液中，室温搅拌反应20～40 min；
[0028] S3.待步骤S2反应完成后，将反应后混合液分别装入透析袋，用磷酸盐缓冲溶液透析即得目的产物环丙沙星-OVA、帕珠沙星-OVA、加替沙星-OVA、洛美沙星-OVA、沙拉沙星-OVA、格林沙星-OVA。
[0029] 具体应用时，利用本发明上述吡哌酸的ELISA检测方法进行吡哌酸检测的操作包括如下步骤：
[0030] S1.待测样品前处理；
[0031] S2.利用权利要求1所述吡哌酸抗体和包被原组合的ELISA检测体系进行检测。
[0032] 其中，所述待测样品优选为牛奶、鸡蛋、鸡肉或猪肉。
[0033] 优选地，当待测样品为牛奶时，样品前处理方法具体步骤如下：吸取待测样品牛奶，按照吡哌酸标准品：待测样品为30～400 ng/g的比例，加入吡哌酸标准品，以10000 r/min离心10 min，拨去脂肪层，吸取上层清液，用PBS稀释20倍后进行检测。
[0034] 当待测样品为鸡蛋时，样品前处理方法具体步骤如下：取鸡蛋蛋液充分匀浆，按照吡哌酸标准品：待测样品为30～400 ng/g的比例，加入吡哌酸标准品，再加入提取液混匀（提取液为体积比1：1的pH7.4 PBS缓冲液和甲醇混合液），涡旋30 s后振荡30 min；以4000 r/min离心10 min，取上层清液稀释10倍后进行检测（如果不能及时检测，可将得到的上层清液置于4℃冰箱保存，在检测前将样品取出，以4000 r/min离心10 min后，取上层清液稀释10倍后进行检测）。
[0035] 当待测样品为鸡肉或猪肉时，样品前处理方法具体步骤如下：将鸡肉或猪肉匀浆后，按照吡哌酸标准品：待测样品为30～400 ng/g的比例，加入吡哌酸标准品，再加入提取液混匀（提取液为体积比为9：1的pH7.4 PBS缓冲液和0.1 mol/L NaOH溶液的混合液），涡旋1 min后以8000 r/min离心10 min，吸取上层清液，沉淀用提取液重复提取一次，步骤同上，合并上清液用PBS稀释5倍后进行检测。
[0036] 另外，上述吡哌酸的ELISA检测方法在检测吡哌酸中的应用，以及在构建吡哌酸检测试剂盒中的应用，也都应在本发明的保护范围之内。
[0037] 一种吡哌酸人工抗原（吡哌酸-载体蛋白）也应在本发明的保护范围之内，其结构式如式（Ⅰ）所示：
[0038]
[0039] 优选地，式中的载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA）。
[0040] 该吡哌酸人工抗原在检测吡哌酸或建立吡哌酸检测方法及其试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。
[0041] 由该吡哌酸人工抗原制备得到的吡哌酸抗体，以及所制备的吡哌酸抗体在检测吡哌酸或建立吡哌酸检测方法及其试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。
[0042] 一种洛美沙星人工抗原（洛美沙星-载体蛋白）也应在本发明的保护范围之内，其结构式如式（Ⅱ）所示：
[0043]
[0044] 优选地，式中的载体蛋白为卵清蛋白（OVA）。
[0045] 该洛美沙星人工抗原在检测吡哌酸或建立吡哌酸检测方法及其试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。
[0046] 具体是，以上述吡哌酸人工抗原为免疫原制备的抗体，以上述洛美沙星人工抗原为包被原的组合在检测吡哌酸或在建立吡哌酸检测方法中的应用，在本发明的保护范围之内。
[0047] 本发明具有以下有益效果：
[0048] 本发明采用异源模式，利用吡哌酸抗体和非吡哌酸包被原组合，选取吡哌酸抗体和包被原洛美沙星-OVA为最优组合，建立了一种更加灵敏的检测模式，提供了一种检测吡哌酸的有效方法，建立了一种高效、方便、简洁、高灵敏和高特异性的ELISA检测方法。
[0049] 本发明所建ELISA检测方法检测的线性范围（IC20～IC80）为0.9～38.5 ng/mL，半抑制浓度(IC50)为5.99 ng/mL，最低检测限为0.31 ng/mL。
[0050] 本发明所建ELISA检测方法检测食品中的吡哌酸的前处理方法操作较为简单，使用较低的稀释倍数便可实现检测，减少处理过程中吡哌酸样品的损失，添加回收率在78.64～109.59%之间，相对标准偏差（RSD）为3.8～16.04%，说明所建立的ELISA检测方法完全能够满足残留检测的要求，可应用于快速检测食品中非法添加的吡哌酸，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0051] 图1为人工抗原（免疫原吡哌酸-BSA和包被原吡哌酸-OVA）、BSA、OVA、吡哌酸的200400 nm紫外扫描鉴定曲线。
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[0052] 图2为人工抗原（包被原环丙沙星-OVA）、OVA、环丙沙星的200 400 nm紫外扫描鉴~定曲线。
[0053] 图3为人工抗原（包被原帕珠沙星-OVA）、OVA、帕珠沙星的200 400 nm紫外扫描鉴~定曲线。
[0054] 图4为人工抗原（包被原加替沙星-OVA）、OVA、加替沙星的200 400 nm紫外扫描鉴~定曲线。
[0055] 图5为人工抗原（包被原洛美沙星-OVA）、OVA、洛美沙星的200 400 nm紫外扫描鉴~定曲线。
[0056] 图6为人工抗原（包被原沙拉沙星-OVA）、OVA、沙拉沙星的200 400 nm紫外扫描鉴~定曲线。
[0057] 图7为人工抗原（包被原格林沙星-OVA）、OVA、格林沙星的200 400 nm紫外扫描鉴~定曲线。
[0058] 图8为间接竞争酶联免疫吸附法（ELISA）测定吡哌酸的标准曲线 。
[0059] 图9为以牛奶为样品的吡哌酸ELISA法与HPLC法的比较。
[0060] 图10为以鸡蛋为样品的吡哌酸ELISA法与HPLC法的比较。
[0061] 图11为以鸡肉为样品的吡哌酸ELISA法与HPLC法的比较。
[0062] 图12为以猪肉为样品的吡哌酸ELISA法与HPLC法的比较。
具体实施方式
[0063] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0064] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0065] 实施例1 吡哌酸免疫原的合成及鉴定
[0066] 1、称取5.2 mg的吡哌酸和20 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）溶于1mL加入20 μL氢氧化钠的磷酸盐缓冲溶液中，记为A液；称取15 mg 牛血清白蛋白（BSA）溶于1mL磷酸盐缓冲液中，记为B液；将A液加入B液中，，室温搅拌30～40 min，将反应后溶液装于透析袋，用磷酸盐缓冲溶液于室温透析3天，期间换透析液6次，即得到目的产物吡哌酸-BSA(免疫原)。
[0067] 2、免疫原的鉴定
[0068] 分别将吡哌酸、BSA、人工抗原，在紫外（200～400 nm）下扫描，发现人工抗原与BSA、吡哌酸相比，吸收曲线（如附图1所示）有明显变化，可以确定免疫原制备成功。
[0069] 实施例2 吡哌酸包被原的合成及鉴定
[0070] 1、大致方法与实施例1相同，但采用卵清蛋白（OVA）作载体蛋白，得到目的产物吡哌酸-OVA（包被原）。
[0071] 2、包被原的鉴定
[0072] 分别将吡哌酸、OVA、人工抗原，在紫外（200～400 nm）下扫描，发现人工抗原与OVA、吡哌酸相比，吸收曲线（如附图1所示）有明显变化，可以确定包被原制备成功。
[0073] 实施例3 喹诺酮类包被原的合成及鉴定
[0074] 1、分别称取5.2 mg的喹诺酮类药物（环丙沙星、帕珠沙星、加替沙星、洛美沙星、沙拉沙星和格林沙星）分别溶于1mL磷酸盐缓冲溶液中，并加入15mg卵清蛋白（OVA）。将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺加入上述溶液中，室温搅拌反应20～40 min。将反应后溶液装于透析袋，用磷酸盐缓冲溶液于室温透析3天，期间换透析液6次，即得到目的产物环丙沙星-OVA、帕珠沙星-OVA、加替沙星-OVA、洛美沙星-OVA、沙拉沙星-OVA和格林沙星-OVA。
[0075] 2、包被原的鉴定
[0076] 分别将喹诺酮类、OVA、人工抗原，在紫外（200～400 nm）下扫描，发现人工抗原与OVA、吡哌酸相比，吸收曲线（如附图2～7所示）有明显变化，可以确定喹诺酮类包被原制备成功。
[0077] 实施例4吡哌酸多克隆抗体的制备及鉴定
[0078] 1、吡哌酸抗体的制备
[0079] 本实施例选用2只7周龄、体重2公斤左右、健康的新西兰大白兔，分别编号。实验免疫剂量为0.5 mg/只，在兔背部皮下多点免疫，每三周加强免疫1次。初次免疫选用完全佐剂与免疫原等体积混合乳化后免疫，加强免疫则选用不完全佐剂。
[0080] 2、吡哌酸抗体效价的测定
[0081] 从第3次加强免疫开始，每次第8天采血，经放置、离心后得到血清，血清适当稀释后用间接竞争ELISA法测定效价。四免后，兔子获得高效价的抗体。免疫原1所获得的抗体1效价最高为1:128000，免疫原2所获得的抗体2效价最高为1:64000。基于此，选用抗体1进行免疫检测方法的建立。
[0082] 实施例5吡哌酸抗体和包被原组合模式选择及免疫检测方法的建立
[0083] 1、分别将吡哌酸抗体和7种包被原组合，采用方阵滴定法确定最优包被原的种类和工作浓度，以及吡哌酸抗体稀释倍数（如表1所示）。
[0084] 2、用不同浓度的吡哌酸标准品溶液做实验溶液，其浓度如下：0.0048 ng/mL、0.038 ng/mL、0.31 ng/mL、2.44 ng/mL、19.53 ng/mL、156.25 ng/mL、1250 ng/mL、10000 ng/mL、采用3组平行实验（n=3）。
[0085] 3、间接竞争ELISA方法：将包被抗原用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释到0.5 μg/mL包被酶标板，100 μL/孔，置于37 ℃过夜；倾去孔内液体，每孔加洗涤液300 μL，洗涤2次，然后甩净洗涤液；每孔加入120 μL封闭液，37℃封闭3h，然后甩净洗涤液，37℃烘1h。从第一孔开始依次加入配好的吡哌酸标准溶液，然后每孔加入50 μL稀释好的抗血清，37℃孵育40min，倾去孔内液体，每孔加洗涤液200 μL，洗涤5次，然后甩净洗涤液。每孔加入100 μL HRP-羊抗兔 IgG （5000倍稀释），37℃ 孵育30min，洗涤同上。每孔加入100 μL底物TMB-过氧化氢溶液，置于37℃显色10min，然后每孔加入50 μL的10%的H2SO4以终止反应。
[0086] 4、用酶联免疫检测仪测定各孔A450nm的吸收值，以吸光值为纵坐标，以标准品溶液浓度的对数值（Log）为横坐标，应用OriginPro 8.5 软件四参数对数函数进行曲线拟合。
[0087] 四参数对数函数按下式计算：
[0088] y=(A-D)/ [1+(x/C)B]+D
[0089] 其中A和D分别代表吡哌酸标准品浓度最小和最大时的吸光值，C为中点浓度；当标准品浓度等于C时的吸光值为（A+D）/2，正处于曲线的拐点处，半抑制浓度为IC50，B表示曲线的陡峭程度，称斜率因子；以10%的抑制浓度为最低检测限（LOD），以20%-80%的抑制浓度（IC20–IC80）为检测范围。
[0090] 5、吡哌酸抗体和7种包被原的组合所得结果如表1所示，选择抑制率较高的组合，吡哌酸抗体和同源包被原吡哌酸-OVA组合和吡哌酸抗体和异源包被原洛美沙星-OVA，同源组合包被原吡哌酸星-OVA的工作浓度为1 μg/mL，吡哌酸抗体稀释倍数为32000倍。异源组合包被原洛美沙星-OVA的工作浓度为0.5 μg/mL，吡哌酸抗体稀释倍数为8000倍。分别建立ELISA的标准曲线，由公式计算得吡哌酸抗体和洛美沙星-OVA包被原在缓冲溶液中的最低检测限（LOD值）为0.31 ng/mL，半抑制浓度（IC50值）为5.99 ng/mL，检测范围为0.9～38.5 ng/mL。标准曲线结果如附图8所示。结果表明标准曲线具有完整的反S形状，并且有上平台和下平台，标准曲线的平行测定次数为3次，实验重复性良好，相对标准偏差在11.09%以内。该组合具有最低检测限和最高灵敏度，为最优组合。
[0091] 表1 吡哌酸抗体和包被原组合的性能比较
[0092]
[0093] 注：ND， 表示无反应活性，无法检测，不能拟合获取此参数。
[0094] 实施例6吡哌酸抗体的特异性检测
[0095] 1、抗体的特异性是指它同特异性抗原的结合能力与该抗原类似物的结合能力的比较。常用交叉反应率来作为评价的重要标准。交叉反应率越小，抗体特异性越好。
[0096] 2、将吡哌酸18种类似物进行系列稀释，然后与上述所得抗体进行反应，制作标准曲线。通过曲线分别计算出各类似物的IC50，计算抗体与吡哌酸类似物的交叉反应率。
[0097] 交叉反应率（%）=IC50（吡哌酸）/IC50（交叉反应物）×100%
[0098] 3、实验设置三次重复，取三次重复的平均值作为实验结果。结果如表2所示，吡哌酸类似物的交叉反应率均低于9.19%，说明所建吡哌酸的ELISA方法的特异性强。
[0099] 表2 吡哌酸抗体的交叉反应
[0100]
[0101] 实施例7食品中吡哌酸添加回收实验
[0102] 1、样品预处理
[0103] 在牛奶、鸡蛋、鸡肉、猪肉中按30、50、100、200、400 ng/g的剂量添加吡哌酸标准品，每个添加水平做3次平行样品。
[0104] （1）牛奶样品是吸取2 g牛奶于10 mL离心管中，按添加浓度添加适量标准品，以10000 r/min离心10 min，拨去脂肪层，吸取上层清液，用PBS稀释20倍后进行检测。
[0105] （2）鸡蛋样品是取鸡蛋一枚，取蛋液充分匀浆，将已配制好的PBS缓冲液（pH7.4）与甲醇以1:1（V:V）混匀配制提取液，取2 g蛋液于10 mL离心管中，按添加浓度添加适量标准品，加入2 mL提取液后混匀，涡旋30 s，后振荡30 min；以4000 r/min离心10 min，取出后吸取上层清液于洁净离心管中，置于4℃冰箱保存，在检测前将样品取出，以4000 r/min离心10 min，取上清液稀释10倍后进行检测。
[0106] （3）鸡肉和猪肉样品是称取2 g匀浆后的肉于10 mL离心管中，按添加浓度添加适量标准品，将已配制好的PBS缓冲液（pH7.4）与0.1 mol/L NaOH溶液以9:1（V:V）混匀配制提取液，加入3 mL提取液后混匀，涡旋1 min；后以8000 r/min离心10 min，吸取上层清液于洁净离心管中，将残渣用3mL提取液重复提取一次，步骤同上，合并上清液用PBS稀释5倍后进行检测。
[0107] 2、结果见表3，从表3可以看出添加回收率在78.64～109.59%之间。相对标准偏差（RSD）为3.8～16.04%，说明已经建立的ELISA检测方法完全能够满足残留检测的要求。
[0108] 表3 食品中吡哌酸的ELISA检测结果
[0109]
[0110] 实施例8吡哌酸ELISA法与HPLC法对比
[0111] 根据国家标准牛奶中喹诺酮类药物多残留的测定 高效液相色谱法（GB 29692-2013）和动物源性食品中14种喹诺酮类药物残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法（GB/T
21312-2007）进行HPLC法的实验，在牛奶、鸡蛋、鸡肉、猪肉中按30、50、100、200、400 ng/g的剂量添加吡哌酸，每添加水平做3次平行样品，以ELISA法检测结果为横坐标，以HPLC法检测结果为纵坐标，进行线性拟合，结果如图9～12所示，两者均成显著的线性关系，决定系数分别为0.9828，0.9604，0.9587和0.9794。说明所述的ELISA法与HPLC法的测定结果具有很好的一致性，检测回收率结果均在较合理的范围内。因此，本发明所述的ELISA法是一种可靠的检测食品中吡哌酸的检测方法。
21312-2007）进行HPLC法的实验，在牛奶、鸡蛋、鸡肉、猪肉中按30、50、100、200、400 ng/g的剂量添加吡哌酸，每添加水平做3次平行样品，以ELISA法检测结果为横坐标，以HPLC法检测结果为纵坐标，进行线性拟合，结果如图9～12所示，两者均成显著的线性关系，决定系数分别为0.9828，0.9604，0.9587和0.9794。说明所述的ELISA法与HPLC法的测定结果具有很好的一致性，检测回收率结果均在较合理的范围内。因此，本发明所述的ELISA法是一种可靠的检测食品中吡哌酸的检测方法。