长寿/防衰老SIRT1蛋白的激活剂核纤层蛋白A

摘要

本发明提供通过经由相互作用改进化合物调节核纤层蛋白A与SIRT1的结合亲和力来调节SIRT1的脱乙酰酶活性的方法。本发明还提供根据核纤层蛋白A和SIRT1蛋白之间的相互作用和核纤层蛋白A的SIRT1激活性质来筛选SIRT1调节化合物的方法。本发明另公开了SIRT1激活性化合物治疗患有代谢和/或衰老相关变性疾病的患者的用途和SIRT1抑制性化合物治疗人类恶性肿瘤的用途。

权利要求

1.一种增加哺乳动物细胞中的SIRT1的脱乙酰酶活性的体外方法，所述方法包括使细胞与有效增加SIRT1的脱乙酰酶活性的量的核纤层蛋白A肽接触。

2.权利要求1的方法，其中所述核纤层蛋白A肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其类似物。

3.权利要求1的方法，其中所述核纤层蛋白A肽包含核纤层蛋白A的羧基结构域或其类似物。

4.权利要求1的方法，其中所述核纤层蛋白A肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸567-646或其片段。

5.权利要求4的方法，其中所述片段的长度为3个氨基酸-50个氨基酸。

6.权利要求5的方法，其中所述片段是类似物。

7.调节SIRT1脱乙酰酶活性的作用剂在制备用于治疗其中受调节的SIRT1脱乙酰酶活性是有益的疾病或病况的药物中的用途，其中所述作用剂是核纤层蛋白A的羧基末端肽或其类似物。

8.权利要求7的用途，其中所述作用剂增加SIRT1脱乙酰酶活性。

9.权利要求8的用途，其中所述增加的SIRT1脱乙酰酶活性导致骨髓基质细胞数增加。

10.权利要求8的用途，其中所述增加的SIRT1脱乙酰酶活性导致造血干细胞数增加。

11.权利要求7的用途，其中所述作用剂降低SIRT1脱乙酰酶活性。

12.权利要求11的用途，其中所述待治疗的疾病或病况是瘤形成。

13.一种筛选调节SIRT1脱乙酰酶活性的作用剂的方法，其中所述方法包括：使候选分子与试验样品中表达SIRT1的细胞接触；

测定试验样品中的脱乙酰酶活性；和

如果候选分子改变试验样品中SIRT1脱乙酰酶活性的水平，则选择所述分子作为调节SIRT1脱乙酰酶活性的作用剂，其中所述候选分子是核纤层蛋白A羧基结构域的片段或其类似物。

14.权利要求13的方法，其中所述候选分子是提高核纤层蛋白A与SIRT1结合的化合物。

15.权利要求13的方法，其中所述候选分子是调节核纤层蛋白A蛋白水平的化合物。

说明书

长寿/防衰老SIRT1蛋白的激活剂核纤层蛋白A

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2012年11月12日提交的美国临时申请顺序号61/725,252的权益，其通过引用以其整体结合到本文中。

[0003] 发明背景

[0004] Sirtuin (沉默交配型信息调节2同源物(silent mating type information +
regulation 2 homolog))，含有NAD依赖性蛋白质脱乙酰酶和ADP核糖基转移酶活性的III类HDAC，调节各种代谢途径(Denu，2005；Donmez和Guarente，2010；Finkel等，2009；Haigis和Sinclair，2010)。

[0005] 7种哺乳动物的sirtuin中，SIRT1 (NAD依赖性脱乙酰酶sirtuin-1)是30年前鉴定的酿酒酵母(Saccharomyces cerevesiae) Sir2 (沉默信息调节因子2)的最接近的同源物(Klar等，1979)。SIRT1丢失引起缺陷型配子发生、心脏和视网膜异常、基因组不稳定、小体型和小鼠存活期缩短(Cheng等，2003；McBurney等，2003；Wang等，2008)；并破坏许多饮食限制的有益作用(Chen等，2005)。虽然在酿酒酵母、秀丽隐杆线虫(C.elegans)和果蝇属(Drosophila)中通过异位Sir2引起寿命延长仍有争议(Burnett等，2011；Lombard等，2011；
Tissenbaum和Guarente，2001；Viswanathan和Guarente，2011；Viswanathan等，2005)，但是具有额外拷贝的SIRT1的转基因小鼠显示类似于饮食限制的表型，并且与健康寿命
(healthspan)改善一致(Alcendor等，2007；Banks等，2008；Bordone等，2007；Herranz等，
2010；Pfluger等，2008)。

[0006] SIRT1使包括KU70、Nbs1、p53、NF-κB、PPARγ、PGC-1α、FOXO和SUV39H1在内的各种蛋白质脱乙酰化，并调节基因组完整性、炎性反应、脂肪形成、线粒体生物发生和胁迫抗性(Lavu等，2008)。例如，SIRT1催化肿瘤抑制物蛋白p53的脱乙酰作用，因此通过抑制p53介导的细胞凋亡提高生存(Cheng等，2003)。SIRT1还与PPAR-γ和PGC-1α直接相互作用，由此调节代谢反应(Picard等，2004；Rodgers等，2005)。

[0007] 另外，SIRT1使Foxo3a脱乙酰化以通过Foxo3a靶(例如MnSOD、过氧化氢酶和Gadd45α)提高胁迫抗性(Brunet等，2004)。SIRT1在胚胎干细胞(ESC)中高表达，但其表达在分化的细胞中通过被miRNA介导的过程而被降低(Saunders等，2010)。SIRT1是通过调节p53细胞分布和Nanog表达以保持ESC自我更新所必需的(Han等，2008)。在SIRT1-/-和SIRT1+/-小鼠中，ESC的造血分化有缺陷，且造血祖细胞的数目和功能下降(Lee等，2011)。当在5%氧下培养时，与野生型细胞相比，SIRT1-/-和SIRT1+/-造血祖细胞两者显示有缺陷的增殖(Mantel等，2008)。

[0008] SIRT1是物种间最保守的防衰老/促长寿蛋白之一。SIRT1脱乙酰酶活性的增加赋予模拟人代谢或变性疾病(例如肥胖症、糖尿病和阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease))的各种小鼠模型许多有益作用。因此，SIRT1激活性化合物可有益于患有各种代谢和衰老相关变性疾病的人类患者。另一方面，发现SIRT1蛋白在各种人类癌症中增量调节，并且抑制SIRT1活性可有助于消除癌干细胞(Li等，2012)。

[0009] 已证实SIRT1活性增加在许多疾病模型和人类患者中是有益的；因此，被广泛接受的是，SIRT1激活性化合物可为各种代谢和变性疾病提供治疗益处(Baur，2010)。另一方面，SIRT1在p53凋亡活性中的抑制作用表明SIRT1的促肿瘤性质(Luo等，2001)。实际上，据报道在许多类型的瘤形成中，包括前列腺癌、急性髓性白血病、结肠癌和各种非黑素瘤皮肤癌，SIRT1蛋白升高(Deng，2009)。据最新报道，抑制SIRT1激活p53，因此有利于清除白血病干细胞(Li等，2012)。因此，SIRT1抑制性化合物为各种人恶性肿瘤提供治疗潜力。据报道，白藜芦醇，一种在筛选SIRT1激活剂时鉴定的化合物，延长酵母、蠕虫和蝇的寿命，并增强啮齿动物的健康寿命(Agarwal和Baur，2011；Baur等，2006；Howitz等，2003；Milne等，2007；Wood等，2004)。已报道了白藜芦醇对衰老相关性白内障、骨密度减少、神经退行性疾病、肥胖症和糖尿病的有益作用。白藜芦醇诱导多基因表达改变，模拟了由热量限制(CR)所诱导的多基因表达改变(Pearson等，2008)。摄食ResVida® (一种含有白藜芦醇的组合物)，在胖人个体中提供类似于CR的显著代谢变化(Timmers等，2011)。有关另一种含有白藜芦醇的营养品®Longevinex 的研究显示，短期摄食该营养品会再现CR的长期作用(Barger等，2008)。

[0010] 由LMNA基因座编码的A型核核纤层蛋白是V型中间丝蛋白质。两种最著名的A型核纤层蛋白，核纤层蛋白A和C，只在C端不同，其中CaaX基序规定一系列加工事件，包括短暂的异戊二烯化(Rusinol和Sinensky，2006)。LMNA中新生G608G突变促进可变剪接，产生部分加工的前核纤层蛋白A (prelamin A) (亦称为progerin)，这是Hutchinson-Gilford早老综合征(一种严重形式的早发性早衰)的主要原因(Eriksson等，2003)。Zmpste24 (一种负责前核纤层蛋白A成熟的金属蛋白酶)缺陷型小鼠，出现类似于Hutchinson-Gilford早老综合征(HGPS)患者的许多早衰样特征(progeroid features) (Pendas等，2002)。

[0011] 本发明人和其它研究者表明，HGPS皮肤成纤维细胞和来源于Zmpste24-/-胚胎的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)经历归因于基因组不稳定和p53途径过度活化的早衰，且通过Lmna杂合性降低Zmpste24-/-小鼠的前核纤层蛋白A水平改善早衰样表型并且显著延长寿命(Fong等，2004；Liu等，2005；Varela等，2005)。经改造以表达progerin的人细胞显示有缺陷的增殖和早衰(Candelario等，2008；Kudlow等，2008)。

[0012] 核纤层蛋白A/C是核基质(NM)的主要组分，核基质是不同于染色质且对维持核结构是重要的丝状核骨架(Fey等，1991)。染色质和其它蛋白质与NM动态相关以调节各种核活动，包括复制、基因转录、DNA修复和染色质组构(Blencowe等，1994；Kruhlak等，2000；Phair和Misteli，2000)。例如，NM与大多数核组蛋白脱乙酰酶(HDAC)活性共纯化(Downes等，
2000；Hendzel等，1991；Li等，1996)。HGPS和Zmpste24-/-细胞的标志之一是畸形核，这导致无序的异染色质(Liu等，2005；Pendas等，2002；Scaffidi和Misteli，2005)和错定位的核蛋白质，例如ATR、SKIP、XPA和Mof (Krishnan等，2011；Liu等，2005；Liu等，2008；Manju等，
2006；Pendas等，2002；Scaffidi和Misteli，2005，2006，2008)。通过经由用法呢基转移酶抑制剂(FTI)处理降低来自核被膜的未加工的前核纤层蛋白A或progerin以挽救核形状异常
显著改善HGPS细胞和小鼠模型两者中的早衰样特征(Capell等，2005；Fong等，2006；Glynn和Glover，2005；Toth等，2005；Varela等，2008)。

[0013] 野生型LMNA基因座上的可变剪接事件可导致低水平progerin的表达，这可影响正常的老化过程(Scaffidi和Misteli，2006)。发现在正常的个体中，在老化期间表达progerin的细胞数增加(McClintock等，2007)，且端粒缩短或功能障碍激活progerin产生(Cao等，2011)。这些研究结果表明progerin可能通过调节参与老化的蛋白质的活性，促进正常的老化过程(Burtner和Kennedy，2010)。

[0014] 在过去几年内，白藜芦醇和SIRT1蛋白的热量限制(CR)模拟性质在寻找白藜芦醇模拟物和SIRT1激活剂中吸引了众多努力。已鉴定出显示比白藜芦醇显著较高的SIRT1激活潜力的化合物，这些化合物可诱导与白藜芦醇类似的模拟CR的有益作用。另外，据报道，白藜芦醇特异性地提高针对荧光团缀合的合成肽(Ac-Arg-His-Lys-LysAc-AMC) (SEQ ID NO:
1)而非未修饰的合成肽的SIRT1活性(Borra等，2005；Kaeberlein等，2005)。这一发现后来得到其它研究者的证实，表明白藜芦醇和SRT1720不提供针对其全长天然靶蛋白(包括p53和PGC-1α)的任何SIRT1活化(Beher等，2009；Dai等，2010；Pacholec等，2010)。因此，尽管白藜芦醇和模拟物的各种有益作用，但是基本机制仍不清楚。

[0015] 发明简述

[0016] 在一个实施方案中，本发明提供通过经由相互作用改进化合物改进核纤层蛋白A与SIRT1的结合亲和力而在一种或多种细胞中调节SIRT1的脱乙酰酶活性的方法。SIRT1的脱乙酰酶活性可通过核纤层蛋白A与SIRT1的结合亲和力提高而提高，并且通过核纤层蛋白A与SIRT1的结合亲和力降低而降低。相互作用改进化合物的实例包括但不限于白藜芦醇。
在本文所述实施方案中，白藜芦醇提高核纤层蛋白A与SIRT1的结合亲和力。在本发明的一些实施方案中，经由相互作用改进化合物通过提高核纤层蛋白A蛋白的羧基端与SIRT1蛋白的结合能力来调节SIRT1脱乙酰酶活性。

[0017] 在一个实施方案中，本发明提供根据核纤层蛋白A和SIRT1蛋白间的相互作用和核纤层蛋白A的SIRT1激活/抑制性质筛选调节SIRT1脱乙酰酶活性的作用剂的方法。一些方法包括使候选分子与试验样品中表达SIRT1的细胞接触；测定试验样品中的脱乙酰酶活性；如果分子改变试验样品中SIRT1脱乙酰酶活性的水平，则选择该候选分子为调节SIRT1脱乙酰酶活性的作用剂。激活或提高SIRT1脱乙酰酶活性的候选分子包括但不限于核纤层蛋白A的肽片段，包括核纤层蛋白A的羧基结构域的肽片段；核纤层蛋白A的类似物，包括所述类似物的肽片段；提高核纤层蛋白A与SIRT1结合的化合物；提高或诱导核纤层蛋白A表达的化合物；及其组合。抑制或降低SIRT1脱乙酰酶活性的候选分子包括但不限于核纤层蛋白A的肽片段，包括核纤层蛋白A肽的羧基结构域；核纤层蛋白A的类似物，包括所述类似物的肽片段；抑制核纤层蛋白A活性的作用剂或化合物；抑制核纤层蛋白A表达的作用剂或化合物；及其组合。

[0018] 在一个实施方案中，本发明提供用于治疗其中调节SIRT1脱乙酰酶活性是有益的疾病或病况的方法。所述方法包括给予需要所述治疗的受试者有效量的调节SIRT1脱乙酰酶活性的作用剂。在一些实施方案中，所给予的作用剂提高SIRT1脱乙酰酶活性。SIRT1激活性化合物的实例包括但不限于核纤层蛋白A的肽片段，包括核纤层蛋白A的羧基结构域的片段；核纤层蛋白A的类似物或其片段；提高核纤层蛋白A与SIRT1结合的化合物；及其组合。在其它实施方案中，所给予的作用剂降低SIRT1脱乙酰酶活性。所述作用剂包括但不限于核纤层蛋白A的羧基末端肽和核纤层蛋白A的羧基末端肽的类似物。

[0019] 导致SIRT1脱乙酰酶活性提高的本发明方法的实施方案可用于治疗其中增加骨髓基质细胞和/或造血干细胞的数目和/或功能是有益的疾病或病况，例如但不限于代谢和/或衰老相关变性疾病。因此，例如可发生骨密度的增加和骨丢失的防止。此外，导致SIRT1脱乙酰酶活性降低的本发明方法的实施方案可用于治疗瘤形成和其它恶性肿瘤。

[0020] 在一个实施方案中，本发明提供用于提高一种或多种细胞的SIRT1脱乙酰酶活性的方法。所述方法包括以有效提高SIRT1的脱乙酰酶活性的量将核纤层蛋白A肽、核纤层蛋白A肽的类似物或其功能片段给予或接触表达SIRT1并需要提高的SIRT1脱乙酰酶活性的一种或多种细胞。在一个实施方案中，本发明的有用的核纤层蛋白A肽是人源的，具有(SEQ ID NO:2；GenBank登录号NP_733821)的氨基酸序列或其类似物。在一个实施方案中，提高SIRT1脱乙酰酶活性的核纤层蛋白A肽的功能片段包含核纤层蛋白A的羧基结构域或其类似物。核纤层蛋白A肽的羧基结构域可包括SEQ ID NO:2的氨基酸567-646或其一个或多个片段。特别有用的片段长度为约3个氨基酸-约50个氨基酸。

[0021] 在一个实施方案中，本发明提供用于降低或抑制一种或多种细胞的SIRT1脱乙酰酶活性的方法。所述方法包括将核纤层蛋白A蛋白或肽的抑制剂给予表达SIRT1并需要
SIRT1脱乙酰酶活性降低的一种或多种细胞。本发明实施方案的有用的核纤层蛋白A抑制剂包括但不限于抑制核纤层蛋白A活性的作用剂；和降低或抑制核纤层蛋白A表达的作用剂，例如抑制核纤层蛋白A的转录、翻译和/或加工的作用剂。

[0022] 附图简述

[0023] 图1显示SIRT1与核纤层蛋白A相互作用，且前核纤层蛋白A/progerin的形成损害SIRT1-核纤层蛋白A相互作用。(A) FLAG-SIRT1和核纤层蛋白A在HEK293细胞中异位表达。
通过蛋白质印迹法，在抗FLAG免疫沉淀中检出核纤层蛋白A；在抗核纤层蛋白A/C免疫沉淀中检出FLAG-SIRT1。(B)在HEK293细胞的总细胞裂解物中，通过抗核纤层蛋白A/C免疫沉淀检出内源SIRT1，相反地，通过抗SIRT1免疫沉淀检出内源核纤层蛋白A。(C)人成纤维细胞中SIRT1和核纤层蛋白A/C的免疫荧光染色和共焦显微术。大部分的核SIRT1与核纤层蛋白A在核内(箭头)共定位。比例尺为5 µm。(D)共焦显微术显示异位EGFP-SIRT1和DsRed-核纤层蛋白A在人成纤维细胞细胞中共定位。比例尺为10 µm。(E)在含有rhSIRT1和重组人核纤层蛋白A (rhLamin A)的试管中，通过抗核纤层蛋白A免疫沉淀检出重组人SIRT1 (rhSIRT1)。
(F)在HEK293细胞中，在抗FLAG-SIRT1免疫沉淀中检出核纤层蛋白A，而非核纤层蛋白C。(G)将HEK293细胞用FLAG-SIRT1连同A型核纤层蛋白(即野生型核纤层蛋白A)、未加工的前核纤层蛋白A和progerin之一瞬时转染。进行蛋白质印迹法以测定抗FLAG免疫沉淀中A型核纤层蛋白的水平。注意与野生型核纤层蛋白A相比，通过抗FLAG抗体检出显著较少的前核纤层蛋白A/progerin。(H) (G)的定量。数据表示均值± SEM，n = 3。**P< 0.01。

[0024] 图2显示早衰样细胞中SIRT1的错定位和脱乙酰酶活性降低。(A)显示核(Nu，P1)和核基质(NM，P2’)级分中各种蛋白质的代表性免疫印迹。NM缔合的SIRT1在Zmpste24-/- BMSC中显著降低，而在NM级分中，野生型和Zmpste24-/- BMSC间的Sirt6、CBP、Foxo3a、组蛋白H3和β-肌动蛋白的水平相当。总的SIRT1核水平不改变。(B) (A)的定量。数据表示均值± SEM，n = 3。**P< 0.01。(C)核纤层蛋白A、未加工的前核纤层蛋白A或progerin在HEK293细胞中稳定表达。进行亚细胞分级分离和蛋白质印迹法以测定NM缔合的SIRT1。虽然与野生型核纤层蛋白A相比，在前核纤层蛋白A-和progerin转染的细胞中NM缔合的SIRT1降低，但是Foxo3a和β-联蛋白的水平保持不变。(D) (C)的定量。数据表示均值± SEM，n = 3。**P< 0.01。(E)抗Foxo3a免疫沉淀中通过用抗乙酰赖氨酸抗体的蛋白质印迹法测定的
Zmpste24-/-BMSC中Foxo3a的高度乙酰化。(F) (E)的定量。数据表示均值± SEM，n = 3。*P< 
0.05，**P< 0.01。(G)上图，在抗Foxo3a免疫沉淀中通过用抗乙酰赖氨酸抗体的蛋白质印迹法测定的表达异位核纤层蛋白A或前核纤层蛋白A或progerin的HEK293细胞中Foxo3a的乙
酰化；下图，输入中的过氧化氢酶、MnSOD和GADD45α的表达。

[0025] 图3显示白藜芦醇以核纤层蛋白A依赖性方式直接激活SIRT1。(A)在rhLamin A存在或不存在时通过BioMol® SIRT1 Fluorimetric Drug Discovery Kit (BSDK)测定
RhSIRT1脱乙酰酶活性。数据表示均值± SEM，n = 3。*P< 0.05，**P< 0.01，rhLamin A + rhSIRT1与仅rhSIRT1。*** rhLamin A与rhSIRT1的摩尔比率分别为0.5、1.0、2.0和4.0。(B)在白藜芦醇存在或不存在时将乙酰FLAG-p53与rhSIRT1和rhLamin A一起温育。通过用抗乙®
酰赖氨酸抗体的蛋白质印迹法测定FLAG-p53乙酰化。通过Image J 量化乙酰化p53的相对水平。*rhLamin A与rhSIRT1的摩尔比率分别为0.5、1.0和2.0。(C)通过蛋白质印迹法评价在白藜芦醇存在或不存在时通过抗核纤层蛋白A/C抗体检出的rhSIRT1水平。(D)将FLAG-
SIRT1和核纤层蛋白A共转染至HEK293细胞中。将细胞用白藜芦醇处理接着抗FLAG免疫沉
淀。蛋白质印迹法显示，白藜芦醇处理以剂量依赖性方式增加SIRT1和核纤层蛋白A间的相互作用。(E) (D)的定量。数据表示均值± SEM，n = 3。*P< 0.05。(F)用不同剂量的白藜芦醇处理的野生型、无SIRT1和无Lmna细胞的代表性免疫印迹。(G)用或未用白藜芦醇处理的野生型和无Lmna细胞中H3K9ac的免疫荧光染色。(H)在试管中白藜芦醇提高rhSIRT1与NM的缔合。按与进行SIRT1脱乙酰酶活性测定法类似的方式，将重组hSIRT1在白藜芦醇(10 μM)存在或不存在时与由野生型或Zmpste24-/- BMSC制备的NM级分一起温育。不溶性NM和反应缓冲液通过离心分离。进行蛋白质印迹法和考马斯蓝染色测定rhSIRT1的水平。

[0026] 图4显示在Zmpste24-/-小鼠中白藜芦醇以SIRT1依赖性方式挽救骨髓基质细胞(BMSC)的减少。(A)白藜芦醇(10 μM)提高Zmpste24-/-BMSC的集落形成能力。在白藜芦醇存在和不存在时在10 cm培养皿中对新分离的骨髓细胞进行集落形成测定法。(B)集落数计
数。数据显示，白藜芦醇(RSV)以剂量依赖性方式(2 μM和10 μM)提高Zmpste24-/-BMSC的集落形成能力。数据表示均值± SEM，n = 4。*P < 0.05，白藜芦醇与溶媒。(C)左图，在用或未用白藜芦醇(2 μM)处理的BMSC中通过抗SIRT1免疫沉淀检出的前核纤层蛋白A的水平通过免疫印迹法测定；右图，通过免疫印迹法评价白藜芦醇中乙酰化Foxo3a的水平。(D)通过蛋白质印迹法测定的在白藜芦醇(10 μM)存在或不存在时SIRT1或杂乱siRNA处理的
Zmpste24-/-BMSC中过氧化氢酶和Gadd45α的水平。(E)在白藜芦醇存在或不存在时SIRT1或杂乱敲减(scramble knocking down)引起的Zmpste24-/- BMSC的集落形成能力。白藜芦醇处理(10 μM)提高Zmpste24-/- BMSC中的集落形成能力(左)，通过敲减SIRT1集落形成能力被完全破坏(右)。在6孔板中对新分离的细胞进行集落形成测定法。(F) (E)的定量。数据表示均值± SEM，n = 5。*P< 0.05，“杂乱 + 白藜芦醇”与“杂乱 + Veh”。(G)通过蛋白质印迹法评价野生型和无Zmpste24的BMSC中在有或没有异位SIRT1时H3K9ac和IR诱导的-H2AX的
-/-
水平。(H)异位SIRT1提高Zmpste24 和野生型BMSC的集落形成能力。在6 cm培养皿中对新分离的细胞进行集落形成测定法。(I)  (H)的定量。数据表示均值± SEM，n = 5。*P < 
0.05，SIRT1与模拟品。

[0027] 图5显示白藜芦醇在Zmpste24-/-小鼠中挽救ASC下降、改善早衰样特征并延长寿-/-
命。(A)用溶媒或白藜芦醇(20 μg/ml，在饮用水中)治疗的Zmpste24 小鼠中BMSC的集落形成能力。在10 cm培养皿中对新分离的骨髓细胞进行集落形成测定法。(B) (A)的定量。数据表示BMSC的平均集落数± SEM，n=3。*P < 0.05。(C)自溶媒治疗和白藜芦醇治疗的
Zmpste24-/-小鼠分离的BMSC中过氧化氢酶、乙酰化p53和H3K9ac的水平。(D)用白藜芦醇饲喂Zmpste24-/-小鼠增加HSC群。每个点代表个体小鼠的总的骨髓单核细胞中HSC群的百分比。*P < 0.05，溶媒治疗的Zmpste24-/-小鼠相对于野生型，和白藜芦醇治疗(20 μg/m1，在饮用水中)相对于溶媒治疗的Zmpste24-/-小鼠。(E)野生型小鼠和用白藜芦醇(20 μg/ml，在饮用水中)或溶媒治疗的Zmpste24-/-小鼠中骨小梁结构的微CT检查。(F)白藜芦醇治疗增加Zmpste24-/-小鼠的骨矿物密度。数据表示均值± SEM，n = 3。*P < 0.05，溶媒治疗的
Zmpste24-/-小鼠相对于野生型，和白藜芦醇治疗(20 μg/ml，在饮用水中)相对于溶媒治疗-/- -/-
的Zmpste24 小鼠。(G)白藜芦醇治疗和溶媒治疗的雄性Zmpste24 小鼠的体重。数据表示均值± SEM，n = 10。*P < 0.05。(H)白藜芦醇治疗和溶媒治疗的雌性Zmpste24-/-小鼠的体重。数据表示均值± SEM，n = 10。*P< 0.05。(I)白藜芦醇治疗和溶媒治疗的Zmpste24-/-小鼠的存活率。P< 0.0001。(J)白藜芦醇治疗和溶媒治疗的Zmpste24-/-小鼠的最大寿命。数据表示均值± SEM。**P< 0.01。

[0028] 图6显示核纤层蛋白A与SIRT1相互作用。(A)通过免疫共沉淀测定BMSC中核纤层蛋白A和SIRT1间的内源相互作用。(B)通过免疫共沉淀测定野生型和无Lmna小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中核纤层蛋白A和SIRT1间的内源相互作用。(C)通过抗GFP免疫共沉淀评价GFP-核纤层蛋白A和SIRT1、SIRT2和SIRT5间的相互作用。

[0029] 图7显示早衰细胞中SIRT1的错定位和脱乙酰酶活性降低以及在核纤层蛋白A存在时通过白藜芦醇对SIRT1的激活。(A)不同的亚细胞级分中Kap-1和Mcm3的表达。将细胞分级分离，通过蛋白质印迹法测定Kap-1和Mcm3的亚细胞分布。(B) SIRT1-/-和野生型MEF被分级分离成胞质(Cyto，S1)、核质/染色质(Np+Chr，S2’)和核基质(NM，P2’)级分。显示NM缔合的SIRT1的代表性免疫印迹。(C)在来源于健康个体和具有不同LMNA基因突变的患者的真皮成纤维细胞中通过蛋白质印迹法测定的核和NM级分中的SIRT1表达。注意，与来自健康个体或具有非早衰LMNA突变的患者的细胞中的相比，在HGPS细胞中NM缔合的SIRT1被显著减量调节。在HGPS细胞中总的SIRT1核水平也降低。(D)人细胞中SIRT1的定量。与来自非早衰核纤层蛋白病(laminopathy)患者和健康个体的真皮成纤维细胞中的相比，HGPS成纤维细胞中NM缔合的SIRT1相对于总的核SIRT1显著减量调节。(E)在胞质或NM级分存在时测定RhSIRT1脱乙酰酶活性。在将rhSIRT1加入测定缓冲液、胞质或NM中后，测定脱乙酰酶活性的相对增加并作图。来自野生型BMSC的NM增强rhSIRT1脱乙酰酶活性，而来自Zmpste24-/-BMSC的NM的刺激能力被大大损害。数据表示均值± SEM，n = 3。*P< 0.05。(F)在rhLamin A和白藜芦醇存在或不存在时将乙酰FLAG-p53与rhSIRT1一起温育。通过用抗乙酰赖氨酸抗体的蛋白质印迹法检测FLAG-p53乙酰化。(G)通过蛋白质印迹法测定的野生型和Zmpste24-/- BMSC中白藜芦醇提高的SIRT1的NM缔合。(H) (G)的定量。数据表示均值± SEM，n = 3。*P< 0.05。(I)核基质(NM)级分保持SIRT1脱乙酰酶活性。在核基质级分存在或不存在时，通过BioMol® SIRT1 Fluorimetric Drug Discovery Kit测定重组人SIRT1 (rhSIRT1)脱乙酰酶活性。苏拉明钠被用作SIRT1的抑制剂。对相对rhSIRT1脱乙酰酶活性作图。数据表示均值± SEM，n = 3。*P < 0.05。

[0030] 图8显示白藜芦醇对Zmpste24-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的作用。(A)在用白藜芦醇治疗的Zmpste24-/- MEF中通过衰老相关β-半乳糖苷酶测定法测定的细胞衰老。(B)通过蛋白质印迹法测定的白藜芦醇处理的MEF细胞中p16ink4a的水平。

[0031] 图9显示Zmpste24-/-小鼠中ASC下降加快。(A)在12天培养后BMSC集落的数目。在10 cm培养皿中用来自4月龄野生型和Zmpste24-/-小鼠的新分离的骨髓细胞进行集落形成测定法。数据表示均值± SEM，n = 5。*P< 0.01。(B)在12天培养后来自10 cm培养皿中野生型或突变型小鼠的磁富集BMSC的集落。(C)来自1个月和5个月野生型和Zmpste24-/-小鼠的富集BMSC的增殖能力。数据表示均值± SEM，n = 3。**P< 0.001。(D)来自1月龄野生型和Zmpste24-/-小鼠的富集BMSC中的衰老相关β-半乳糖苷酶测定法。数据表示均值± SEM，n = 
3。**P< 0.001。(E)来自4月龄野生型和Zmpste24-/-小鼠的股骨和胫骨中的单核细胞总数。
-/-
数据表示均值± SEM，n =6。*P< 0.05。(F)来自4月龄Zmpste24 和野生型小鼠骨髓中HSC的代表性FACS概况。门R4代表HSC群(谱系-Flt3-Sca-1+c-Kit高)。注意Zmpste24-/-小鼠中HSC群减少。(G) 1月龄、2月龄和4月龄野生型和Zmpste24-/-小鼠的骨髓的总单核细胞中HSC群的百分比。*P < 0.01。(H)将来自1月龄野生型或Zmpste24-/-小鼠的HSC植入致死照射的接受者中。在野生型移植接受者中，B细胞分化在1、4或6个月时不受影响；在重新移入
Zmpste24-/-供体的接受者中，在移植后4个月，B细胞谱系大大减少。**P<  0.001，
Zmpste24-/-相对于Zmpste24+/+。

[0032] 图10显示Zmpste24-/-小鼠中N-乙酰半胱氨酸饲养挽救ASC下降和延长寿命。(A)在H2O2存在或不存在时测定的富集BMSC的集落形成单位-成纤维细胞(CFU-F)。数据表示均值± SEM，n = 3。*P< 0.05。(B)与野生型HSC中的相比新分离的Zmpste24-/- HSC中的ROS水平升高(左)和通过N-乙酰半胱氨酸(NAC，1 mg/ml，在饮用水中)挽救的ROS水平(右)。(C)用溶媒或NAC (1 mg/ml，在饮用水中)治疗的Zmpste24-/-小鼠中BMSC的集落形成效率。在10 cm培养皿中对新分离的骨髓细胞进行集落形成测定法。数据表示均值± SEM，n = 3。*P< 0.05。(D)溶媒治疗和NAC治疗的Zmpste24-/-小鼠中骨髓HSC群的百分比。*P< 0.05，溶媒治疗的Zmpste24-/-小鼠相对于野生型，和NAC治疗相对于溶媒治疗的Zmpste24-/-小鼠。(E) 4月龄时溶媒治疗和NAC治疗的Zmpste24-/-小鼠的体重。数据表示均值± SEM，n =12。*P< 
0.05，NAC治疗相对于溶媒治疗。(F)溶媒治疗和NAC治疗的Zmpste24-/-小鼠的存活率。P< 
0.0001。

[0033] 图11 (A)在含有rhSIRT1和重组人核纤层蛋白A (rhLamin A)的试管中通过抗核纤层蛋白A免疫沉淀检出重组人SIRT1 (rhSIRT1)。(B)在rhLamin A存在或不存在时通过
BioMol® SIRT1 Fluorimetric Drug Discovery Kit (BSDK)测定RhSIRT1脱乙酰酶活性。
数据表示均值± SEM，n = 3。*P<0.05，**P< 0.01，rhLamin A + rhSIRT1相对于仅
rhSIRT1。***rhLamin A与rhSIRT1的摩尔比率分别为0.5、1.0、2.0和4.0。(C)在rhLamin A存在或不存在时将乙酰FLAG-p53与rhSIRT1一起温育。通过用抗乙酰赖氨酸抗体的蛋白质印迹法检测FLAG-p53乙酰化。通过Image J®量化乙酰化p53的相对水平。*rhLamin A与
rhSIRT1的摩尔比率分别为0.5和1.0。(D)在LA-80 (核纤层蛋白A的羧基80 aa的合成肽)存在或不存在时，通过BioMol® SIRT1 Fluorimetric Drug Discovery Kit (BSDK)测定
rhSIRT1脱乙酰酶活性。数据表示均值± SEM，n = 3。**P< 0.01，LA-80 + rhSIRT1相对于仅rhSIRT1。(E)在不同量的LA-80存在下将乙酰FLAG-p53与rhSIRT1一起温育。通过用抗乙®
酰赖氨酸抗体的蛋白质印迹法测定FLAG-p53乙酰化(左)。通过Image J 量化乙酰化p53的相对水平(右)。

[0034] 序列简述

[0035] SEQ ID NO:1是依据本发明使用的氨基酸序列。

[0036] SEQ ID NO:2是人核纤层蛋白A蛋白的氨基酸序列。

[0037] 发明的详细内容

[0038] 在一个实施方案中，本发明提供根据核纤层蛋白A和SIRT1蛋白间的相互作用和核纤层蛋白A的SIRT1激活性质筛选SIRT1激活/抑制性化合物的方法。在另一个实施方案中，本发明提供SIRT1激活性化合物治疗患有代谢和/或衰老相关变性疾病的患者/受试者的用途和SIRT1抑制性化合物治疗人恶性肿瘤的用途。在另一个实施方案中，本发明提供通过经由相互作用改进化合物改变核纤层蛋白A与SIRT1的结合亲和力来调节SIRT1的脱乙酰酶活性的方法。

[0039] SIRT1脱乙酰酶活性被核纤层蛋白A激活

[0040] 鉴于核基质(NM)在保存HDAC活性中的基本作用和白藜芦醇的延寿性质，测定了核纤层蛋白A对SIRT1的可能作用。结果显示，在NM中核纤层蛋白A与SIRT1直接相互作用并用作SIRT1的激活剂；前核纤层蛋白A和progerin显示与SIRT1的结合能力显著降低，因此使SIRT1从NM错定位，导致Zmpste24-/-小鼠中ASC快速下降。白藜芦醇在体外和体内都增加SIRT1与A型核纤层蛋白的结合，因此在Zmpste24-/-小鼠中，可提高SIRT1的脱乙酰酶活性，恢复ASC群，改善早衰样特征，并延长寿命。

[0041] 本发明显示，核纤层蛋白A是SIRT1的激活剂；白藜芦醇通过增加其与核纤层蛋白A的相互作用而激活SIRT1；白藜芦醇以SIRT1依赖性方式挽救ASC下降；且白藜芦醇治疗在早衰小鼠中减轻早衰样特征并延长寿命。

[0042] 本发明显示，核核纤层蛋白A蛋白在体内与长寿/防衰老SIRT1蛋白形成复合物。核纤层蛋白A蛋白与SIRT1蛋白直接结合。核纤层蛋白A激活针对荧光团缀合的合成肽(Ac-Arg-His-Lys-LysAc-AMC)和全长乙酰化FLAG-p53蛋白(一种已知的SIRT1蛋白的靶标)两者的SIRT1脱乙酰酶活性。含有核纤层蛋白A蛋白的羧基端的80个氨基酸的合成肽，赋予SIRT1针对荧光团缀合的合成肽(Ac-Arg-His-Lys-LysAc-AMC)和全长乙酰化FLAG-p53蛋白两者的高得多的激活潜力。

[0043] 在一个实施方案中，本发明提供筛选激活SIRT1脱乙酰酶活性的核纤层蛋白A蛋白的小肽的方法。在另一个实施方案中，本发明提供用于鉴定激活或抑制SIRT1蛋白的核纤层蛋白A-肽-模拟化合物的方法。在一个实施方案中，本发明提供用于鉴定调节核纤层蛋白A蛋白和SIRT1蛋白间的相互作用从而激活或抑制SIRT1的脱乙酰酶活性的化合物的方法。在又一个实施方案中，本发明提供用于治疗患有各种代谢疾病例如肥胖症、心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病、早衰综合征和衰老的患者的方法。还提供使用SIRT1抑制性化合物治疗人类癌症的方法，所述癌症包括前列腺癌、急性髓性白血病、结肠癌和各种非黑素瘤皮肤癌。

[0044] 本发明人发现，核核纤层蛋白A蛋白与延寿/防衰老SIRT1蛋白相互作用。在一个实施方案中，本发明提供筛选SIRT1激活剂或抑制剂的方法。在另一个实施方案中，本发明提供提高或抑制SIRT1活性以治疗人类代谢和变性疾病以及瘤形成的方法。

[0045] 在一个实施方案中，本发明提供使用核纤层蛋白A蛋白的小的羧基末端肽提高SIRT1蛋白活性的方法。针对其体外提高针对荧光团缀合的合成肽(Ac-Arg-His-Lys-LysAc-AMC)和全长乙酰化FLAG-p53蛋白(一种已知的SIRT1蛋白的靶标)两者的SIRT1脱乙酰酶活
性的能力，确定位于成熟核纤层蛋白A蛋白的G567-Y646区的范围为3 mer-20 mer的合成肽。
在又一个实施方案中，使用直接使靶标(例如p53和PGC-1α)脱乙酰的乙酰化状态的SIRT1，测试细胞中SIRT1的合成的3 mer-20 mer肽的作用，作为读出。在再一个实施方案中，通过上述体外和体内测定法，测试共价修饰的上述3 mer-20 mer核纤层蛋白A肽提高SIRT1脱乙酰酶活性的能力。

[0046] 在一个实施方案中，本发明提供筛选模拟上述3 mer-20 mer核纤层蛋白A肽的结构的化合物的方法，其中在试管中通过荧光团缀合的合成肽(Ac-Arg-His-Lys-LysAc-AMC)和全长乙酰化FLAG-p53蛋白，测定提高的SIRT1的脱乙酰酶活性。在又一个实施方案中，使用直接使靶标(例如p53和PGC-1 α)脱乙酰的乙酰化状态的SIRT1，在细胞中测试核纤层蛋白A-肽-模拟物对SIRT1的作用，作为读出。

[0047] 在一个实施方案中，本发明提供鉴定能够通过增加核纤层蛋白A和SIRT1蛋白间的相互作用来提高SIRT1脱乙酰酶活性的化合物的方法。在核纤层蛋白A蛋白和受测化合物存在时，测定针对荧光团缀合的合成肽(Ac-Arg-His-Lys-LysAc-AMC)和全长乙酰化FLAG-p53蛋白两者的SIRT1脱乙酰酶。可通过免疫共沉淀、蛋白质印迹法和GST-检出测定法(GST-pull down assay)，测定受测化合物在含有重组核纤层蛋白A和重组SIRT1的试管中和在细胞中提高核纤层蛋白A和SIRT1间的相互作用的能力。可通过分析乙酰化p53和乙酰化PGC-1α的水平，测试细胞中受测化合物激活SIRT1的能力。

[0048] 在一个实施方案中本发明提供使用上述SIRT1激活性分子式(包括小核纤层蛋白A肽、肽-模拟物和核纤层蛋白A-SIRT1相互作用增强性化合物)治疗人类代谢和衰老相关变性疾病的方法。在一个实施方案中，可在重现代谢和衰老相关变性疾病的动物(例如小鼠)模型(例如饲喂高脂肪饮食的小鼠、类似Hutchinson-Gilford早老综合征(HGPS)的小鼠模型、db/db糖尿病小鼠等)中，测试候选化合物/肽。

[0049] 在另一个实施方案中，本发明提供使用SIRT1抑制性化合物(包括小核纤层蛋白A肽、肽-模拟物和核纤层蛋白A-SIRT1相互作用抑制性化合物)治疗人类恶性肿瘤的方法。另外，本发明提供通过给予SIRT1激活性化合物以治疗代谢疾病包括肥胖症、糖尿病、神经退行性疾病、心血管疾病、早衰络合征和衰老的方法。

[0050] 核纤层蛋白A与SIRT1直接相互作用，且核纤层蛋白A的羧基结构域的最后80个氨基酸用作SIRT1的激活剂。在一个实施方案中，本发明提供用于提高SIRT1脱乙酰酶活性的方法，其中所述方法包括将核纤层蛋白A肽、核纤层蛋白A肽的类似物或其功能片段给予表达SIRT1且需要SIRT1脱乙酰酶活性提高的细胞。

[0051] 各类核纤层蛋白A蛋白的氨基酸序列是公众已知的，本领域技术人员可通过例如GenBank数据库容易地获取。在一个实施方案中，根据本发明使用的核纤层蛋白A肽是人源的，具有SEQ ID NO:2；GenBank登录号NP_733821的氨基酸序列。

[0052] 在一个实施方案中，提高SIRT1脱乙酰酶活性的核纤层蛋白A肽的功能片段包含核纤层蛋白A肽的羧基结构域。在一个实施方案中，提高SIRT1脱乙酰酶活性的核纤层蛋白A肽的功能片段包含SEQ ID NO:2的氨基酸570-664。

[0053] SIRT1脱乙酰酶活性的抑制

[0054] 在一个实施方案中，本发明提供用于降低或抑制SIRT1脱乙酰酶活性的方法，其中所述方法包括将核纤层蛋白A蛋白或肽的抑制剂给予表达SIRT1且需要SIRT1脱乙酰酶活性降低的细胞。

[0055] 依据本发明使用的核纤层蛋白A抑制剂包括但不限于抑制核纤层蛋白A活性的作用剂；和降低或抑制核纤层蛋白A表达的作用剂，例如抑制核纤层蛋白A的转录、翻译和/或加工的作用剂。

[0056] 抑制核纤层蛋白A活性的作用剂包括但不限于抗核纤层蛋白A抗体、适体、核纤层蛋白A结合配偶体和核纤层蛋白A的小分子抑制剂。

[0057] 在一个实施方案中，核纤层蛋白A抑制剂是与核纤层蛋白A结合的抗体、适体或结合配偶体。在一个具体实施方案中，核纤层蛋白A抑制剂是与核纤层蛋白A特异性结合的抗体、适体或结合配偶体。在又一个具体实施方案中，核纤层蛋白A抑制剂是与人核纤层蛋白A特异性结合的抗体、适体或结合配偶体。在又一个具体实施方案中，核纤层蛋白A抑制剂是与SEQ ID NO:2的人核纤层蛋白A特异性结合的抗体、适体或结合配偶体。

[0058] 在某些实施方案中，核纤层蛋白A抑制剂是与非人动物物种的核纤层蛋白A蛋白特异性结合的抗体、适体或结合配偶体，所述动物包括但不限于类人猿、黑猩猩、猩猩、猴、狗、猫、马、猪、绵羊、山羊、鸡、小鼠、大鼠和豚鼠。与核纤层蛋白A蛋白特异性结合的抗体是市购可获得的。技术人员可容易地制备与公众已知的核纤层蛋白A蛋白特异性结合的抗体、适体或结合配偶体。在另一个实施方案中，核纤层蛋白A抑制剂是包含与核纤层蛋白A蛋白(例如人核纤层蛋白A)特异性结合的抗体、适体或结合配偶体的融合构建体。

[0059] “特异性结合”或“特异性”是指蛋白质可检测地结合存在于目标蛋白质或多肽分子中的表位，同时与其它蛋白质或结构具有相对小的可检出反应性的能力。可采用例如Biacore仪，通过结合测定法或竞争结合测定法，相对地测定特异性。可通过例如在与特定靶分子结合相对于与其它无关分子非特异性结合中，亲和力/亲合力的比率约10:1、约20:
1、约50:1、约100:1、10.000:1或更大来表示特异性。

[0060] 本发明的抗核纤层蛋白A抗体可以是各种形式的任一种，包括完整的免疫球蛋白分子、免疫球蛋白的片段例如Fv、Fab和类似片段；免疫球蛋白分子的多聚体(例如本领域已知的双抗体、三抗体和二特异性和三特异性抗体；参见例如Hudson和Kortt, J. Immunol. Methods 231:177 189, 1999)；含有抗体或抗体片段的融合构建体；和人或人源化免疫球蛋白分子或其片段。

[0061] 本发明范围内的抗体可以具有任何同种型，包括IgG、IgA、IgE、IgD和IgM。IgG同种型抗体可进一步细分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型。IgA抗体可进一步细分为IgA1和IgA2亚型。

[0062] 本发明的抗体包括多克隆和单克隆抗体。本文所用术语“单克隆抗体”是指获自基本均质的抗体或抗体片段群的抗体或抗体片段(即群中的各个抗体是相同的，可存在于少量抗体分子子集中的可能的天然存在的突变除外)。

[0063] 单克隆抗体组合物通常由称为杂交瘤的单细胞克隆产生的抗体组成，所述杂交瘤只分泌(产生)一种类型的抗体分子。通过使产抗体细胞和骨髓瘤或其它自身永生细胞系融合形成杂交瘤细胞。所述抗体最早描述于Kohler和Milstein，Nature，1975，256:495-497，其公开内容通过引用结合到本文中。Niman等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1983, 80:4949-4953描述了示例性的杂交瘤技术。产生单克隆抗体、杂交瘤细胞或杂交瘤细胞培养物的其它方法也是众所周知的。参见例如Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow等, Cold Spring Harbor Laboratory,1988；或从Sasatry等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 
1989, 86:5728-5732所描述的免疫库分离单克隆抗体的方法；以及Huse等, Science, 
1981, 246:1275-1281。所引用的参考文献通过引用结合到本文中。

[0064] 在一些实施方案中，依据本发明使用的核纤层蛋白A抑制剂是降低或抑制核纤层蛋白A表达的作用剂，例如抑制核纤层蛋白A的转录、翻译和/或加工的作用剂。

[0065] 在一个实施方案中，核纤层蛋白A抑制剂是核纤层蛋白A反义多核苷酸。在一个实施方案中，核纤层蛋白A抑制剂是靶向人核纤层蛋白A mRNA的反义多核苷酸。在一些实施方案中，核纤层蛋白A反义多核苷酸靶向非人动物的核纤层蛋白A mRNA，所述动物包括但不限于类人猿、黑猩猩、猩猩、猴、狗、猫、马、猪、绵羊、山羊、鸡、小鼠、大鼠和豚鼠。技术人员应容易认识到，可设计反义多核苷酸以靶向公众已知的任何核纤层蛋白A mRNA。

[0066] 在一些实施方案中，核纤层蛋白A抑制剂是具有与靶核纤层蛋白A mRNA序列充分互补以指导靶特异性RNA干扰(RNAi)的序列的siRNA。在一些实施方案中，核纤层蛋白A抑制剂是具有与靶人核纤层蛋白A mRNA序列充分互补以指导靶特异性RNA干扰的序列的siRNA。

[0067] 反义多核苷酸的实例包括但不限于与互补靶核纤层蛋白A mRNA结合并抑制翻译和/或诱导靶转录物的RNaseH介导的降解的单链DNA和RNA；靶向或介导核纤层蛋白A mRNA降解的siRNA寡核苷酸；切割核纤层蛋白A mRNA转录物的核酶；和核酸适体和诱杀剂，其是以类似于小分子药物的方式结合并阻断核纤层蛋白A蛋白靶的非天然存在的寡核苷酸。

[0068] 术语“核苷酸”是指具有以酯键与糖部分连接的一个或多个磷酸基团的核苷。示例性的核苷酸包括核苷一磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸。术语“多核苷酸”和“核酸分子”在本文可互换使用，是指在5'和3'碳原子间通过磷酸二酯键连接在一起的核苷酸的聚合物。术语“核酸”或“核酸序列”包括寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或这些的任一种的片段、可为单链或双链且可表示有义或反义链的基因组或合成源的DNA或RNA、肽核酸(PNA)或起源为天然或合成的任何DNA样或RNA样物质。如本领域技术人员应了解的一样，当核酸为RNA时，脱氧核苷酸A、G、C和T分别被核糖核苷酸A、G、C和U置换。

[0069] 本文所用术语“RNA”或“RNA分子”或“核糖核酸分子”一般是指核糖核苷酸的聚合物。术语“DNA”或“DNA分子”或“脱氧核糖核酸分子”一般是指脱氧核糖核苷酸的聚合物。DNA和RNA分子可以是天然合成的(例如分别通过DNA复制或DNA转录)。RNA分子可以经转录后修饰。DNA和RNA分子还可为化学合成的。DNA和RNA分子可以是单链(即分别为ssRNA和ssDNA)或多链的(例如双链，即分别为dsRNA和dsDNA)。然而，根据本发明的性质，术语“RNA”或“RNA分子”或“核糖核酸分子”也可指主要包含(即大于80%或优选大于90%)核糖核苷酸但任选包括至少一个非核糖核苷酸分子(例如至少一个脱氧核糖核苷酸和/或至少一个核苷酸类似物)的聚合物。

[0070] 本文所用术语“核苷酸类似物”，本文亦称为“改变的核苷酸”或“修饰的核苷酸”，是指非标准核苷酸，包括非天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。优选的核苷酸类似物在任何位置被修饰使得改变核苷酸的某些化学性质但仍保持核苷酸类似物执行其预期功能的能力。

[0071] 本文所用术语“RNA干扰” (“RNAi”)是指RNA的选择性胞内降解。RNAi天然发生在细胞中以除去外来RNA (例如病毒RNA)。天然RNAi通过从游离dsRNA (其指导其它类似的RNA序列的降解机制)切割的片段进行。或者，例如可借助人工启动RNAi以使内源靶基因(例如核纤层蛋白A)的表达沉默。

[0072] 本文所用术语“小干扰RNA” (“siRNA”) (本领域亦称为“短干扰RNA”)是指包含能够指导或介导RNA干扰的大约10-50个核苷酸(或核苷酸类似物)的RNA (或RNA类似物)。

[0073] 如本文所用，具有“与靶mRNA序列充分互补以指导靶特异性RNA干扰(RNAi)的序列”的siRNA意指siRNA具有通过RNAi手段或过程足以引发靶mRNA (例如核纤层蛋白A 
mRNA)破坏的序列。“mRNA”或“信使RNA”或“转录物”是规定一种或多种多肽的氨基酸序列的单链RNA。在蛋白质合成期间当核糖体与mRNA结合时，该信息被翻译。

[0074] 本发明还预期包含可用于抑制核纤层蛋白A表达和/或活性的核酸分子的载体(例如病毒载体)和表达构建体。在一个实施方案中，载体包含靶向核纤层蛋白A mRNA的siRNA。
在另一个实施方案中，载体包含编码抗核纤层蛋白A抗体的核酸分子。

[0075] 本文所用术语“表达构建体”是指提供有效连接的核酸序列的转录的核酸序列的组合。本文所用术语“有效连接的”是指所述组分的毗邻，其中各组分处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系。一般来说，有效连接的组分处于邻接关系。

[0076] 本发明的表达构建体一般还将包括在其中表达构建体有待表达的预期宿主细胞中起作用的调节元件。因此，本领域普通技术人员可选择用于例如细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、哺乳动物宿主细胞和人宿主细胞的调节元件。调节元件包括启动子、转录终止序列、翻译终止序列、增强子和聚腺苷酸化元件。

[0077] 本发明的表达构建体可包含与编码本发明的肽的多核苷酸序列有效连接的启动子序列。可采用本领域已知的标准技术将启动子掺入多核苷酸中。多拷贝的启动子或多个启动子可用于本发明的表达构建体。在一个优选的实施方案中，启动子可位于与在其天然遗传环境中距离转录起始位点大致相同的自转录起始位点的距离。在不显著降低启动子活性的情况下允许该距离的某些变化。表达构建体中通常包括转录起始位点。

[0078] 药物筛选测定法

[0079] 在一个实施方案中，本发明涉及用于筛选提高或降低SIRT1脱乙酰酶活性的治疗剂的方法。该治疗剂可以是药物、化学品、化合物、蛋白质或肽或核酸分子(例如DNA、RNA例如siRNA)。

[0080] 在一个实施方案中，本发明提供用于筛选提高SIRT1脱乙酰酶活性的作用剂的方法，所述方法包括使候选分子与试验样品中表达SIRT1的细胞接触；测定试验样品中的脱乙酰酶活性；如果所述分子提高试验样品中SIRT1脱乙酰酶活性的水平，则选择候选分子作为提高SIRT1脱乙酰酶活性的作用剂。

[0081] 在提高SIRT1脱乙酰酶活性的作用剂的筛选测定法的一个实施方案中，候选分子选自核纤层蛋白A肽的片段(例如SEQ ID NO:2的核纤层蛋白A肽的片段)；模拟核纤层蛋白A活性的化合物的类似物，例如肽模拟物；或提高核纤层蛋白A-SIRT1相互作用的化合物。

[0082] 核纤层蛋白A肽的功能片段的长度可为5-600个氨基酸或之间的任何长度，包括但不限于长度为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550和600个氨基酸。

[0083] 在另一个实施方案中，提高SIRT1脱乙酰酶活性的作用剂的筛选测定法还包括测定候选分子与SIRT1的结合，如果所述分子与SIRT1结合或提高核纤层蛋白A (或其功能片段)与SIRT1的结合，则选择该候选分子。

[0084] 在一个实施方案中，本发明提供用于筛选降低或抑制SIRT1脱乙酰酶活性的作用剂的方法，所述方法包括使候选分子与试验样品中表达SIRT1的细胞接触；测定试验样品中的脱乙酰酶活性；如果所述分子降低或抑制试验样品中SIRT1脱乙酰酶活性的水平，则选择该候选分子作为降低或抑制SIRT1脱乙酰酶活性的作用剂。

[0085] 在降低或抑制SIRT1脱乙酰酶活性的作用剂的筛选测定法的一个实施方案中，候选分子选自抑制核纤层蛋白A活性的作用剂；和降低或抑制核纤层蛋白A表达的作用剂，例如抑制核纤层蛋白A的转录、翻译和/或加工的作用剂。

[0086] 在一个实施方案中，降低或抑制SIRT1脱乙酰酶活性的作用剂的筛选测定法还包括测定候选分子与SIRT1的结合，且如果所述分子抑制核纤层蛋白A与SIRT1结合，则选择该候选分子。

[0087] 在某些实施方案中，筛选测定法检查SIRT1使选自KU70、Nbs1、p53、NF-κB、PPARγ、PGC-1α、FOXO和SUV39H1的蛋白质脱乙酰的体外活性。在某些实施方案中，筛选测定法检查SIRT1使选自Ac-Arg-His-Lys-LysAc-AMC (SEQ ID NO:1)或全长乙酰化FLAG-p53蛋白的蛋白质脱乙酰的体外活性。

[0088] 脱乙酰活性可通过以下方法测定：包括但不限于免疫共沉淀、蛋白质印迹法、ELISA、免疫荧光、放射免疫测定法、免疫细胞化学及其组合。

[0089] 在某些实施方案中，本发明提供包括在SIRT1重组蛋白的动力学(V max和K m)上测定SIRT1激活性肽或模拟物的方法；测定在肽激活剂存在或不存在时SIRT1的结构；和测定肽激活剂对培养的人细胞和早衰小鼠模型的生物作用。

[0090] 疾病的治疗

[0091] 在一个实施方案中，本发明提供用于治疗其中SIRT1脱乙酰酶活性提高是有益的疾病或病况的方法，所述方法包括给予需要所述治疗的患者或受试者有效量的核纤层蛋白A肽、提高SIRT1脱乙酰酶活性的核纤层蛋白A的类似物或其功能片段。

[0092] 在不同的实施方案中，其中SIRT1脱乙酰酶活性提高可能是有益的且可按照本发明治疗的疾病或病况包括但不限于代谢疾病，例如肥胖症、糖尿病；神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病；和衰老相关疾病。

[0093] 在一个实施方案中，本发明提供用于治疗其中SIRT1脱乙酰酶活性降低是有益的疾病或病况的方法，所述方法包括给予需要所述治疗的患者或受试者有效量的核纤层蛋白A肽的抑制剂。在一个实施方案中，其中SIRT1脱乙酰酶活性降低可能是有益的疾病或病况包括但不限于瘤形成。

[0094] 本文所用术语“受试者”或“患者”描述可向其提供用本发明的组合物治疗的生物，包括哺乳动物，例如灵长类动物。可获益于所公开的治疗方法的哺乳动物种类包括但不限于类人猿、黑猩猩、猩猩、人、猴；驯养动物，例如狗和猫；家畜，例如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；和其它动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。

[0095] 本文所用术语“治疗”或其任何语法变化(例如treat、treating和treatment等)包括但不限于缓解疾病或病况的症状；和/或减轻、压制、抑制、减缓或影响疾病或病况的进展、严重性和/或范围。

[0096] 本文所用术语“有效量”是指能够治疗、预防或改善疾病或病况或以别的方式能够产生预期的治疗作用的量。

[0097] 治疗组合物和制剂

[0098] 本发明还提供包括呈可与药学上可接受的载体组合的形式的本发明的化合物的治疗或药物组合物。在这种情况下，化合物可以是例如分离的或基本纯的。

[0099] 术语“载体”是指化合物与其一起给予的稀释剂、辅助剂、赋形剂或溶媒。所述药用载体可以是无菌的液体，例如水和油，包括石油(例如矿物油)、植物油(例如花生油、大豆油和芝麻油)、动物油或合成源的油的那些。盐溶液和葡萄糖和甘油水溶液也可用作液体载体，特别用于注射溶液剂。用于治疗或改善中枢神经系统炎症的特别优选的药用载体是可穿透血/脑屏障的载体。本文所用载体不包括在自然界存在的天然植物材料。

[0100] 合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如有需要，治疗组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可呈以下形式：溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等。组合物可用传统的粘合剂和载体(例如甘油三酯)配制。合适的药用载体的实例描述于E. W. Martin的“Remington's 
Pharmaceutical Sciences”。所述组合物含有治疗有效量的治疗组合物以及适量的载体以提供适当给予患者的形式。制剂应适于给药方式。

[0101] 在一个实施方案中，本发明提供适于局部注射给予人类的药物组合物。通常，用于局部注射给药的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液剂。需要时，组合物还可包括增溶剂和局部麻醉药(例如利多卡因)以舒缓注射部位的疼痛。一般而言，各成分单独施用或在单位剂型中混合在一起，例如作为标明活性剂的量的密封容器(例如安瓿或小袋)中的冻干粉或无水浓缩物。在组合物通过注射给予时，可提供一安瓿的注射用无菌水或盐水，使得可在给药前将所述成分混合。

[0102] 本发明的治疗或药物组合物可配成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与游离氨基形成的盐，例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及与游离羧基形成的盐，例如来源于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。

[0103] 本发明还提供药包或药盒，其包含一个或多个装有本发明的药物组合物的一种或多种成分(例如化合物、载体)的容器。

[0104] 给药途径

[0105] 可将本发明的化合物和组合物通过标准途径给予正治疗的受试者，所述途径包括口服、吸入或胃肠外给药，包括静脉内、皮下、局部、经皮、皮内、跨黏膜、腹膜内、肌内、囊内、眶内、心内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射、输注和电穿孔以及作为待(临时或永久地)插入受试者中的任何医疗装置或物体的组分共同给予。

[0106] 在治疗特定疾病、病况或病症中是有效的本发明的治疗或药物组合物的量将取决于给药途径和疾病、病况或病症的严重性，并且应按照从业医师的判断和各患者的情况决定。一般来说，剂量范围为约0.001 mg/kg-约3 g/kg。例如，合适的单位剂量可介于约0.01-约3 g、约0.01-约1 g、约0.01-约500 mg、约0.01-约400 mg、约0.01-约300 mg、约0.01-约200 mg、约0.01-约100 mg、约0.01-约50 mg、约0.01-约30 mg、约0.01-约20 mg、约0.01-约
10 mg、约0.01-约5 mg、约0.01-约3 mg、约0.01-约1 mg或约0.01-约0.5 mg之间。可以一天一次以上(例如一天两次或三次)给予所述单位剂量。

[0107] 可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据病况的类型和待治疗的受试者而变化。一般来说，治疗组合物含有约5%-约95%活性成分(w/w)。更具体地讲，治疗组合物含有约20% (w/w)-约80%或约30%-约70%活性成分(w/w)。

[0108] 一旦患者病况发生改善，则需要时给予维持剂量。随后，可随症状而变将剂量或给药频率或两者减至保持病况改善的水平。当症状已减轻到所需水平，则应终止治疗。然而根据疾病症状的任何复发，患者可能长期需要间断性治疗。

[0109] 另外，体外测定法可任选用于辅助鉴定最佳剂量范围。待用于制剂中的精确剂量也将取决于给药途径及疾病、病况或病症的严重性，并且应按照从业医师的判断和各患者的情况决定。可以从来源于体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线推算有效剂量。

[0110] 材料与方法

[0111] 细胞系、构建体和抗体

[0112] 使HEK293细胞、MEF和人真皮成纤维细胞维持在补充10% FBS的DMEM中。来源于HGPS患者的HGADFN143、HGADFN188、HGADFN164和HGADFN122皮肤成纤维细胞由早衰研究基金会(Progeria Research Foundation)提供。人健康真皮成纤维细胞PH和带有LMNA突变
(即R453W、R482W和R401C)的细胞由Manfred Wehnert教授(Institute of Human 
Genetics, University of Greifswald, Greifswald, Germany)提供。无SIRT1的MEF由
Chu-Xia Deng教授(NIDDK，National Institutes of Health，USA)提供。别处描述了F2-S人成纤维细胞和来自小鼠胚胎的MEF的制备(Liu等，2005)。

[0113] 按照生产商的程序，用Lipofectamine2000® (Invitrogen，USA)进行转染。SIRT1 siRNA寡聚物购自Invitrogen，USA。先前已描述了核纤层蛋白A和未加工的前核纤层蛋白A构建体(Liu等，2005)。progerin构建体通过基于核纤层蛋白A构建体的细菌重组工程产生。Flag-FOXO3A (Addgene质粒8360)获自Dr M. E Greenberg (Brunet等，2004)。腺病毒
SIRT1构建体(Addgene质粒8438) (Rodgers等，2005)由Dr P Puigserver提供。EGFP-SIRT1构建体(Sun等，2007)由Prof Qiwei Zhai (Shanghai Institutes for Biological 
Sciences，China)提供。加Flag标签的SIRT1突变体、Flag-p53和p300构建体是来自Dr. Zhenkun Lou (Mayo Clinic College of Medicine，USA)的惠赠。

[0114] 兔抗SIRT6、抗SIRT1、抗CBP和抗乙酰赖氨酸抗体获自Abcam (Cambridge，UK)。兔抗H3K9ac和小鼠抗γ-H2AX抗体购自Millipore (Bedford，MA，USA)。抗SIRT1、抗核纤层蛋白A/C、抗过氧化氢酶、抗MnSOD和抗Gadd45α抗体购自Santa Cruz (Santa Cruz，CA，USA)。兔抗Foxo3a购自BioVision (Mountain View，CA，USA)。生物素标记的谱系标志物购自BD Biosciences (San Jose，CA，USA)。PE抗小鼠CD105抗体购自eBioscience (San Diego，CA，USA)。

[0115] Zmpste24-/-小鼠的白藜芦醇治疗

[0116] 先前已描述了Zmpste24-/-小鼠(Pendas等，2002)。小鼠实验按照香港大学教学与研究活动物使用委员会(Committee on the Use of Live Animals in Teaching and -/-
Research, CULATR)的准则进行。给新生的Zmpste24 小鼠和野生型对照饲喂含白藜芦醇
(20 µg/ml)或N-乙酰半胱氨酸(1 mg/ml)的饮用水。记录白藜芦醇治疗、NAC治疗或溶媒治疗的Zmpste24-/-小鼠的存活，并每周监测其体重。通过微CT测定骨小梁组构和骨矿物密度。
通过Kaplan-Meier方法分析存活率，通过Log-rank (Mantel-Cox)检验进行统计比较。

[0117] 骨髓基质细胞和造血干细胞

[0118] 按照修改方案(使用MesenCuilt®的小鼠间充质祖细胞计数和扩增，Stemcell Technologies，Canada)，分离并培养骨髓基质细胞。简单地说，用补充20% FBS的α-MEM (Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)从股骨和胫骨冲洗出骨髓细胞，并铺于培养皿中。在第3天除去未贴壁细胞，每3天更换培养基。BMSC集落用甲醇固定，并在规定日用结晶紫溶液染色。
对于磁富集，按照生产商说明书，使用MidiMACS™磁性细胞分选试剂盒(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)除去CD11b阳性群。统计含有超过50个细胞的集落。BMSC集落形成效率计算为由107个骨髓有核细胞形成的集落的数目。

[0119] 为了分析造血干细胞，通过用染色培养基(补充2% FBS的HBSS)冲洗股骨和胫骨来收集单核细胞，用生物素偶联的谱系标志物生物素-Flt3、PE-Sca-1、APC-c-Kit且然后用SAv-PerCP染色。采用BD FACSCalibur进行FACS概况分析。

[0120] 为了纯化HSC，在表面标志物染色前，使用NH4Cl溶解红细胞，然后用BD FACSVantage SE分选HSC。将分选的HSC与5 µM DCF-DA在37℃下温育30分钟，通过FACS以
488-nm激发和525-nm发射进行分析以测定ROS水平。

[0121] 对于造血重构，使用Gammacell 3000 Elan辐照器，用9 Gy的剂量对接受者小鼠(B6SJL/BoyJ)进行致死照射，将500个纯化的供体HSC通过尾静脉给接受者注射。在再增殖后，收集外周血，针对细胞表面标志物染色，并通过FACS分析。

[0122] SA-β-半乳糖苷酶测定法

[0123] 按照生产商说明书，采用Cellular  Senescence Assay Kit  (Chemicon International，CA，USA)进行SA-β-半乳糖苷酶测定法。对于MEF，在第4次传代时在完全培养基中补充白藜芦醇，在第6次传代时，进行SA-β-半乳糖苷酶测定法。为了量化SA-β-半乳糖苷酶染色，用100 µl DMSO提取染成蓝色的沉淀，在415 nm下记录吸光度。

[0124] 免疫荧光染色

[0125] 使BMSC在腔室载玻片上生长，在4%低聚甲醛中固定，然后在含5%正常血清的1% BSA/PBS中在4℃下封闭过夜，然后与稀释于1% BSA/PBS中的第一抗体一起在4℃下在潮湿箱中温育过夜。将载玻片用PBS洗涤3次，与稀释于1% BSA/PBS中的FITC-或TRITC-偶联的第二抗体一起在室温下温育40分钟，用PBS洗涤3次除去未结合的抗体，用含DAPI 
(Invitrogen，USA)的SlowFade®Gold antifade试剂封片，用指甲油密封，并进行显微镜分析。照片用Photoshop CS®处理。

[0126] 蛋白质提取、分级分离、蛋白质印迹法和免疫共沉淀

[0127] 通过将细胞悬浮于5体积的悬液缓冲液(0.1 M NaCl、10 mM Tris-HCl，pH 7.5、1 mM EDTA、1mM DTT，pH 8.0、蛋白酶抑制剂)中，然后加入5体积的Laemmli缓冲液(0.1 M Tris-HCl，pH 7.0、4% SDS、20%甘油、1 mM DTT、蛋白酶抑制剂)，煮沸5分钟，来制备完整细胞裂解物。

[0128] 如所述将细胞分级分离(Mendez和Stillman，2000)。简单地说，将细胞悬浮于100 µl冰冷的缓冲液A (10 mM HEPES，pH 7.9、10 mM KCl、1.5 mM MgCl2、0.34 M蔗糖、10%甘油、1 mM DTT、蛋白酶抑制剂)中。在加入0.1% Triton X-100后，将细胞悬液轻轻混合，在冰上温育5分钟，在4℃下以1300 x g离心4分钟。将上清液(S1)转移到新的管中，通过高速离心(12000 x g，10分钟，4℃)澄清。剩余的核沉淀(P1)用100 µl缓冲液A洗涤一次，然后重新悬浮于补充1 mM CaCl2和2单位的微球菌核酸酶的100 µl缓冲液A中，在37℃下温育15分钟。通过加入1 mM EGTA终止反应，然后在4℃下将悬液以1300 x g离心4分钟。将所得沉淀重新悬浮于100 µl缓冲液B (3 mM EDTA、0.2 mM EGTA、1 mM DTT)中，在4℃下以1700 x g离心4分钟。将含有核质和染色质结合的蛋白质的全部可溶性组分的上清液(S2’)转移到另一个管中；将含有全部核基质组分的剩余的沉淀(P2’)悬浮于100 µl Laemmli缓冲液中，煮沸5分钟。

[0129] 如前所述进行蛋白质印迹法(Liu等，2005)。通过Image J®测量相对条带强度，并按标示，归一化至相应的野生型或未治疗对照。

[0130] 对于统计学分析，使至少3个独立的免疫印迹量化，对于P值采用斯氏(student) T检验。

[0131] 对于免疫共沉淀，使细胞裂解入预冷却的含有300 mM或500 mM NaCl和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中。将第一抗体或合适的对照IgG加入裂解液中，在摇床上在4℃下温育2小时后，加入琼脂糖珠粒，并温育O/N。将珠粒用RIPA缓冲液洗涤两次，重新悬浮于Laemmli缓冲液中，并煮沸，通过离心收集蛋白质悬液，保存待进一步分析。

[0132] 体外SIRT1脱乙酰测定法

[0133] 按照生产商说明书，用SIRT1 Fluorimetric Drug Discovery Kit (Biomol，Hamburg，Germany)对荧光团缀合的合成p53肽进行SIRT1脱乙酰测定法。如上所述对细胞进行分级分离，只是不包括蛋白酶抑制剂，将核基质级分悬浮于供应商提供的测定缓冲液中。
在SIRT1 Fluorimetric Drug Discovery Kit的反应混合物中加入不同的细胞级分或重组人核纤层蛋白A (rhLamin，Diatheva，Italy)，在37℃下温育20分钟，然后终止反应，检测荧光信号。使用得自Sigma (USA)的SIRT1测定试剂盒，测定对天然靶标的SIRT1脱乙酰酶活性。将编码FLAG-p53和HA-p300的构建体共转染至HEK293细胞中；通过抗FLAG M2琼脂糖
(Sigma)使FLAG-p53免疫沉淀，接着用FLAG肽(Sigma)洗脱。在rhLamin A或白藜芦醇存在或不存在时，将纯化的乙酰FLAG-p53与重组人SIRT1 (rhSIRT1)和NAD+一起在37℃下温育30分钟。用泛抗乙酰基赖氨酸抗体，通过蛋白质印迹法测定FLAG-p53的乙酰化水平。
实施例

[0134] 下面是说明用于实施本发明的实施方案和程序的实施例。实施例不应解释为限制性的。所有百分比以重量计算，所有溶剂混合物比例以体积计算，除非另有说明。

[0135] 实施例1—SIRT1与核纤层蛋白A相互作用而前核纤层蛋白A或progerin破坏所述相互作用

[0136] 为了确定SIRT1可能参与早衰，在表达异位加Flag标签的SIRT1的HEK293细胞中，通过免疫共沉淀检测核纤层蛋白A和SIRT1之间可能的相互作用。

[0137] 在抗FLAG免疫沉淀中检出核纤层蛋白A，而在抗核纤层蛋白A/C免疫沉淀中检测到FLAG-SIRT1 (图1A)。在HEK293细胞、骨髓基质细胞(BMSC)和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中证实了内源SIRT1和核纤层蛋白A/C间的相互作用，其中在抗SIRT1免疫沉淀中检出核纤层蛋白A，反之亦然(图1B，6A，6B)。

[0138] 免疫荧光共焦显微术显示，大多数核SIRT1与核质核纤层蛋白A/C共定位于人成纤维细胞中的核内(图1C)。异位EGFP-SIRT1和DsRed-核纤层蛋白A始终共存在于核内(图1D)。这种相互作用似乎对核SIRT1有特异性，因为在抗GFP-核纤层蛋白A免疫沉淀中既未检测到胞质SIRT1也未检测到线粒体SIRT5 (图6C)。另外，SIRT1与核纤层蛋白A物理相互作用，因为在试管中通过重组人核纤层蛋白A (rhLamin A)检出重组人SIRT1 (rhSIRT1) (图1E)。

[0139] LMNA的可变剪接产生不同的A型核纤层蛋白，其中核纤层蛋白A和C最丰富(Lin和Worman，1993)。核纤层蛋白A和C共有前566个氨基酸；核纤层蛋白A具有特定的98个氨基酸羧基尾，核纤层蛋白C具有独特的6个氨基酸羧基尾(Liu和Zhou，2008)。

[0140] 虽然在HEK293细胞中核纤层蛋白C的水平比A高得多，但是在抗SIRT1免疫沉淀中几乎检不到核纤层蛋白C (图1B)，表明了核纤层蛋白A可能通过其C端结构域与SIRT1相互作用。这通过表达FLAG-SIRT1连同核纤层蛋白A或核纤层蛋白C的HEK293细胞的免疫共沉淀得到进一步证实。如图1F所示，在抗FLAG-SIRT1免疫沉淀中检测到核纤层蛋白A，而核纤层蛋白C可忽略。

[0141] 被广泛公认的是，progerin或前核纤层蛋白A中未加工的C端尾负责HGPS和早衰小鼠模型中的早衰样特征。鉴于核纤层蛋白A与SIRT1通过其C端结构域相互作用，该实施例研究了与核纤层蛋白A相比，SIRT1和前核纤层蛋白A或progerin间的相互作用是否减弱。在表达FLAG-SIRT1连同A型核纤层蛋白(即野生型核纤层蛋白A)、前核纤层蛋白A或progerin之一的HEK293细胞中进行了免疫共沉淀。

[0142] 如图1G、1H所示，与核纤层蛋白A相比，通过抗FLAG抗体检出显著较少的前核纤层蛋白A和progerin，尽管输入中存在相当或较高水平的FLAG-SIRT1和前核纤层蛋白A/progerin。结果表明，SIRT1优先与核纤层蛋白A相互作用，而前核纤层蛋白A或progerin与SIRT1的缔合显著减少。

[0143] 实施例2—SIRT1在早衰细胞中错定位

[0144] 核纤层蛋白A是NM的主要组分之一。该实施例通过亚细胞分级分离研究了SIRT1与NM的缔合。使用SIRT1-/-细胞作为SIRT1蛋白特异性染色的阴性对照。KAP-1 (KRAB相关蛋白1，亦称为Trim28或Tif1β)和MCM3蛋白质用作亚细胞分级分离纯化的阳性对照。

[0145] KAP-1是一种异染色质因子，据报道与核中的大部分抗微球菌核酸酶级分缔合(Goodarzi等，2008；Ryan等，1999)。MCM3蛋白质在防止在S期内的过量DNA复制中是重要的，并且主要与染色质缔合(Mendez和Stillman，2000)。

[0146] 正如预期的一样，Kap-1是抗MNase消化的，并保留在NM级分(P2’)中，而大部分Mcm3在MNase处理后释放到核质和染色质级分(S2’)中(图7A)。与其与核纤层蛋白A的相互作用一致，在MEF中，NM级分(P2’)富含SIRT1蛋白(图7B)。

[0147] 因为与核纤层蛋白A相比，前核纤层蛋白A与SIRT1具有较低的结合能力，且SIRT1在干细胞中高表达(Saunders等，2010)，所以该实施例还在多能BMSC中通过亚细胞分级分离研究了SIRT1在Zmpste24-/-细胞中的定位。

[0148] 与野生型对照相比，在Zmpste24-/- BMSC中NM缔合的SIRT1大大减少，尽管SIRT1的总的核比例不相上下(图2A，2B)。NM缔合的SIRT1的减少显得是特异性的，因为在-/-
Zmpste24 细胞中Sirt6、CBP乙酰转移酶和Foxo3a不受显著影响。

[0149] 与健康F2-S成纤维细胞或带有非早衰LMNA突变的真皮成纤维细胞相比，NM缔合的SIRT1在HGPS真皮成纤维细胞(包括HGADFN143、HGADFN188、HGADFN164和HGADFN122)中也减少，所述突变即Emery Dreifuss肌营养不良(EDMD)中的R453W、家族性脂肪营养不良(FLPD)中的R482W和EDMD中的R401C (Liu和Zhou，2008) (图7C、7D)。

[0150] 虽然总的SIRT1核水平在不同的HGPS细胞系中是可变的，但NM缔合的SIRT1的百分比始终下降。此外，前核纤层蛋白A和progerin的异位表达引起SIRT1自NM上显著解离，同时在HEK293细胞中SIRT1的核水平几乎不受影响(图2C，2D)。结果表明，前核纤层蛋白A或progerin损害SIRT1的适当NM定位。

[0151] 为了进一步评价SIRT1错定位的功能重要性，本实施例研究了早衰细胞中的SIRT1下游途径。SIRT1使Foxo3a脱乙酰化，并且增量调节其转录活性，因此在响应氧化应激时促进例如MnSOD和过氧化氢酶等抗氧化酶的表达(Brunet等，2004)。

[0152] 与SIRT1的错定位一致，Foxo3a在Zmpste24-/-BMSC中高乙酰化，且与野生型对照相比，Zmpste24-/-小鼠中过氧化氢酶和Gadd45α的水平降低约40% (图2E-F)。Foxo3a乙酰化的-/-增加可能是体内SIRT1脱乙酰酶活性降低的结果，因为在Zmpste24 BMSC中，总的核SIRT1水平和NM缔合的CBP (Foxo3a的乙酰转移酶)都不改变(图2A-B)。在HEK293细胞中，前核纤层蛋白A或progerin的异位表达增加FOXO3A的乙酰化，并降低过氧化氢酶、MnSOD和GADD45α的表达(图2G)。

[0153] 实施例3—白藜芦醇提高Sirt1与核纤层蛋白A的结合并以核纤层蛋白A依赖性方式刺激其脱乙酰酶活性

[0154] SIRT1的NM定位和NM与HDAC脱乙酰酶活性的关联(Fey等，1991)表明，NM可含有可能的SIRT1激活剂。为了检验这一假设，在来源于野生型或Zmpste24-/-BMSC的NM存在或不存在时，通过BioMol® SIRT1 Fluorimetric Drug Discovery Kit (BSDK)量化rhSIRT1的体外脱乙酰酶活性。

[0155] 出乎意料的是，与没有NM或有胞质级分的对照相比，在来自野生型BMSC的NM存在下，rhSIRT1的脱乙酰酶活性提高约3倍(图7E)，表明了在NM中潜在SIRT1激活剂的存在。相比之下，来自Zmpste24-/-BMSC的NM显示对rhSIRT1脱乙酰酶活性的刺激作用显著降低。

[0156] 该实施例进一步研究了核纤层蛋白A是否起SIRT1的激活剂的作用。在哺乳动物细胞中，赖氨酸乙酰转移酶p300和SIRT1介导在残基K382上对p53的乙酰化和脱乙酰化(Gu和Roeder，1997)。BSDK使用荧光团缀合的乙酰基p53肽作为靶标(参见材料与方法)。如图3A所示，在rhLamin A存在下，rhSIRT1对乙酰基p53肽的脱乙酰酶活性以剂量依赖性方式增加。核纤层蛋白A刺激的SIRT1脱乙酰酶活性被SIRT1抑制剂苏拉明完全破坏。

[0157] 为了进一步测试rhLamin A对SIRT1的天然靶标的作用，在异位表达FLAG-p53和p300的HEK293细胞中通过抗FLAG免疫沉淀纯化乙酰基p53，并如材料与方法中所述进行
SIRT1脱乙酰测定法。

[0158] 如图3B和S2F所示，与仅rhSIRT1相比，在rhLamin A-rhSIRT1复合物存在下观察到FLAG-p53乙酰化水平约20%降低，表明核纤层蛋白A用作SIRT1的激活剂。

[0159] 据报道，白藜芦醇(可能是潜在的SIRT1激活剂)在各种年龄相关性疾病中延长健康寿命。然而几个独立研究发现，白藜芦醇针对荧光团缀合的合成p53肽而非非缀合的天然靶标激活SIRT1 (Borra等，2005；Burnett等，2011；Dai等，2010；Kaeberlein等，2005；
Pacholec等，2010)。

[0160] 该实施例显示使用天然全长FLAG-p53作为底物，白藜芦醇不直接激活SIRT1脱乙酰酶活性(图7F)。出乎意料的是，在rhLamin A存在下，白藜芦醇以核纤层蛋白A剂量依赖性方式激活SIRT1 (图3B、7F)。通过免疫共沉淀的进一步的研究显示，白藜芦醇在试管中提高rhSIRT1与rhLamin A的结合(图3C)，在HEK293细胞中提高FLAG-SIRT1与核纤层蛋白A的结合(图3D、3E)。

[0161] 除乙酰基p53以外，H3K9ac是SIRT1脱乙酰酶的另一种底物(Wang等，2008)。该实施例进一步研究了在野生型、SIRT1-/-或无Lmna的细胞中白藜芦醇对H3K9ac的作用。如图3F所示，在野生型细胞中，用白藜芦醇处理以剂量依赖性方式减量调节H3K9ac的水平，而在-/- -/-
SIRT1 或Lmna 细胞中这种作用被完全破坏。抗H3K9ac免疫荧光染色进一步证实了通过
白藜芦醇的核纤层蛋白A依赖性激活SIRT1 (图3G)。

[0162] 由于SIRT1与核纤层蛋白A相互作用，并因此与NM缔合且白藜芦醇增加核纤层蛋白A和SIRT1的结合，所以本实施例还检查了白藜芦醇是否提高SIRT1的NM缔合。如图7G-H所-/-示，在与不同浓度的白藜芦醇温育的野生型和Zmpste24 BMSC中，与未处理对照相比，NM缔合的SIRT1增加。在试管中也观察到白藜芦醇刺激SIRT1的NM缔合的能力。当将等量的
rhSIRT1与来自悬浮于BSDK测定缓冲液中的野生型或Zmpste24-/-细胞的不溶性NM级分一起温育时，发现在白藜芦醇不存在时，与野生型NM沉淀相比，来自Zmpste24-/-NM的沉淀中显著较少的NM结合的rhSIRT1 (图3H)。值得注意的是，白藜芦醇的存在提高rhSIRT1与来源于野生型和Zmpste24-/-细胞两者的NM的缔合。始终如一的是，上清液中的rhSIRT1水平经受代偿性降低(图3H)。总的来说，这些数据表明，白藜芦醇可提高核纤层蛋白A和SIRT1的相互作用以增加SIRT1的NM缔合，并因此激活SIRT1。

[0163] 实施例4—在Zmpste24-/-小鼠中白藜芦醇治疗挽救ASC下降

[0164] 由于白藜芦醇通过增加其与核纤层蛋白A结合而提高SIRT1脱乙酰酶活性，因此本实施例研究了Zmpste24-/-MEF中白藜芦醇处理对早衰的作用。然而，在白藜芦醇处理和盐水处理的Zmpste24-/-MEF间未观察到β-半乳糖苷酶活性的明显差异(图8A)，且在Zmpste24-/-MEF中白藜芦醇不降低升高的p16lnk4a水平(图8B)。由于SIRT1在干细胞中比在体细胞分化细胞中更高地表达，且这在维持干细胞自我更新和功能上是至关重要的(Han等，2008；Lee等，2011；Saunders等，2010)，因此我们随后测试了白藜芦醇对BMSC的作用。

[0165] 之前把Progerin和前核纤层蛋白A与Zmpste24-/-小鼠中的间充质干细胞(MSC)和毛囊祖细胞中的缺陷相关联(Espada等，2008；Scaffidi和Misteli，2008)。与4月龄的野生型对照相比，BMSC的数目在Zmpste24-/-小鼠中始终显著降低(图9A)。培养中的Zmpste24-/-BMSC显示集落形成能力受损(图9B)、增殖降低(图9C)和细胞衰老显著增加(图9D)。同样，在Zmpste24-/-小鼠中观察到单核细胞(MNC)和造血干细胞(HSC，谱系-Flt3-Sca-l+cKit高)的早期下降(图9E-G)，使得到4月龄时HSC水平下降到低于野生型对照的一半。HSC移植实验显-/-
示，自我更新缺陷是细胞内在的(图9H)。引人关注的是，在Zmpste24 BMSC中白藜芦醇以剂量依赖性方式提高集落形成能力(图4A-B)。所述处理还增加SIRT1与前核纤层蛋白A的结合和Gadd45α和过氧化氢酶的表达(图4C-D)。此外，白藜芦醇的挽救作用是SIRT1依赖性的，因为敲减SIRT1减弱其对Zmpste24-/-BMSC的作用(图4D-F)。敲减SIRT1破坏白藜芦醇对Gadd45α和过氧化氢酶表达的刺激作用(图4D)。另外，SIRT1的敲减降低集落形成能力(图4E-F)，异位SIRT1提高Zmpste24-/-BMSC的集落形成能力至与野生型BMSC相当的水平(图4G-I)。这些数据表明，在Zmpste24-/-小鼠中BMSC下降可归因于SIRT1功能受损，这可被白藜芦醇挽救。

[0166] 实施例5—Zmpste24-/-小鼠中白藜芦醇减轻早衰样特征并延长寿命

[0167] 因为体外BMSC集落形成能力的SIRT1依赖性挽救，所以本实施例研究白藜芦醇是否可体内挽救Zmpste24-/-小鼠的BMSC缺陷。

[0168] 简单地说，以20 µg/ml的浓度在饮用水中补充白藜芦醇。在治疗后4个月，收集BMSC用于白藜芦醇治疗和溶媒治疗的Zmpste24-/-小鼠间的研究和比较。

[0169] 如图5A和5B所示，在白藜芦醇治疗组中，BMSC集落形成效率显著提高。同时，白藜芦醇治疗提高过氧化氢酶的水平，但是降低BMSC中的乙酰基p53和H3K9的水平(图5C)。白藜-/-芦醇治疗还挽救HSC的早期下降(图5C)。此外白藜芦醇治疗改善Zmpste24 小鼠的早衰样
特征。如通过微CT分析显示，Zmpste24-/-小鼠的小梁似乎更薄且间隙更大。在4个月治疗后，白藜芦醇增加小梁厚度、改进结构性组织并增加骨矿物密度(图5D-E)。另外，与溶媒治疗的对照相比，白藜芦醇治疗还显著减缓体重减轻(图5F-G)。更重要的是，生存中值从溶媒治疗-/- -/-
的Zmpste24 小鼠的20周延长到白藜芦醇治疗的Zmpste24 小鼠的27周(图5H)。出生后26
周时，95%的Zmpste24-/-小鼠死亡，而几乎60%的白藜芦醇治疗的动物仍存活。最大寿命(最长存活的10%的动物的平均寿命)从溶媒治疗的27.5周延长到白藜芦醇治疗Zmpste24-/-小鼠的33.5周(图5I)。

[0170] 白藜芦醇挽救成熟干细胞数的SIRT1依赖性下降，并减轻基于核纤层蛋白病的早衰的早衰样特征。缺乏Zmpste24 (一种负责前核纤层蛋白A加工的金属蛋白酶)的小鼠再现许多HGPS特征，包括细胞衰老加快和功能障碍性成熟干细胞(ASC)。SIRT1与核纤层蛋白A直接相互作用，并因此定位于核基质(NM)。SIRT1与核纤层蛋白A和NM的缔合提高其脱乙酰酶活性。

[0171] 与核纤层蛋白A相比，前核纤层蛋白A和progerin显著降低体内与SIRT1的相互作用，并降低SIRT1脱乙酰酶活性的活化，在基于核纤层蛋白病的早衰小鼠中引起ASC快速耗尽。白藜芦醇通过增加SIRT1与A型核纤层蛋白结合并提高其NM缔合来激活SIRT1。白藜芦醇治疗以SIRT1依赖性方式挽救ASC下降，减缓体重减轻，改进骨小梁结构和矿物密度，并且显著延长Zmpste24-/-小鼠的寿命。本发明显示，核纤层蛋白A是SIRT1的激活剂，而白藜芦醇以核纤层蛋白A依赖性方式直接激活SIRT1。此外，保守的SIRT1长寿途径和早衰之间的关系表明，基于干细胞和SIRT1途径依赖性治疗策略可用于治疗早衰。

[0172] SIRT1与核纤层蛋白A相互作用且与NM缔合；核纤层蛋白A用作SIRT1的激活剂。SIRT1与前核纤层蛋白A或progerin弱相互作用，且在早衰细胞中NM中的SIRT1丰度和活性显著降低。白藜芦醇通过提高SIRT1和A型核纤层蛋白间的结合并增加SIRT1与NM的缔合直接激活SIRT1，这进而挽救有缺陷的BMSC，改善早衰样表型，并延长Zmpste24-/-小鼠的寿命。

[0173] 本发明显示，核纤层蛋白A与SIRT1直接相互作用，因此使用AMC缀合的合成肽或天然全长乙酰基p53提高SIRT1的脱乙酰酶活性。推测核纤层蛋白A通过其C端与SIRT1相互作用，因为核纤层蛋白C和SIRT1间的相互作用最小。前核纤层蛋白A或progerin中未加工的C端可干扰其与SIRT1结合，因此，降低NM上的SIRT1缔合，导致早衰细胞中脱乙酰酶活性受损。白藜芦醇提高SIRT1与A型核纤层蛋白结合，因此激活SIRT1脱乙酰酶活性。

[0174] 虽然白藜芦醇的许多体内益处是SIRT1依赖性的(Baur，2010)，但是新出现的证据表明它还不依赖SIRT1地激活AMPK (Canto等，2009；Gledhill等，2007；Hawley等，2010；Park等，2012)。已显示，低剂量的白藜芦醇(≤ 25 µM)以SIRT1依赖性方式激活AMPK，而高剂量(≥ 50 µM)不依赖SIRT1地激活AMPK (Baur等，2006；Price等，2012；Sun等，2007)。在本发明中，使用低剂量(2-10 µM)的白藜芦醇，未观察到AMPK的激活；因此，推测白藜芦醇对BMSC的有益作用主要归于SIRT1的激活。引人关注的是，虽然白藜芦醇以SIRT1依赖性方式挽救BMSC下降，改善早衰样表型，并延长Zmpste24-/-小鼠的寿命，但是它在Zmpste24-/-MEF中不挽救细胞衰老，这表明了白藜芦醇处理可不同地影响体细胞和ASC。

[0175] 因此，已经报道，白藜芦醇抑制不同起源的体细胞和不同癌细胞系的增殖(Sgambato等，2001)。因为白藜芦醇的作用是多向性的(Harikumar和Aggarwal，2008)，并包括sirtuin依赖性和非依赖性途径两者，因此白藜芦醇在ASC和体细胞中可不同地影响
sirtuin途径和非sirtuin途径似乎是可能的。

[0176] 鉴于SIRT1表达在干细胞中比在体细胞中高得多(Saunders等，2010)，白藜芦醇对BMSC和MEF的不同作用还可能在于SIRT1表达水平的差异。实际上，在野生型和Zmpste24-/-BMSC两者中，白藜芦醇对BMSC的作用是SIRT1依赖性的，且异位SIRT1提高集落形成能力。很可能Zmpste24-/-小鼠中白藜芦醇引起的寿命延长至少部分可归于SIRT1依赖性ASC下降的挽救，例如BMSC和HSC等。因为SIRT1影响多个途径(Lavu等，2008；Smith等，2008)，不清楚SIRT1的哪个下游靶标影响Zmpste24-/-小鼠中BMSC的维持。然而，Foxo3a介导的氧化解毒可能是一个潜在的候选，因为通过N-乙酰半胱氨酸(NAC)直接清除ROS水平挽救BMSC和HSC的下降，并延长寿命至与白藜芦醇所延长的类似程度(图10)。虽然秀丽隐杆线虫和果蝇属中的异位Sir2所致的寿命延长最近受到质疑，但哺乳动物中的SIRT1缺乏可影响在响应应激时生命所必需的代谢和转录适应(Burnett等，2011；Chalkiadaki和Guarente，2012；Houtkooper等，2012；Lombard等，2011；Viswanathan和Guarente，2011)。在这一方面，应当强调的是，白藜芦醇所致早衰样小鼠的寿命延长可能是Zmpste24-/-小鼠中严重受损的健康寿命所必需的SIRT1依赖性生理和代谢功能升高的结果。在短寿的鱼品系中，白藜芦醇延长寿命，并延迟衰老相关表型(Valenzano等，2006)。

[0177] 本发明显示，(i)白藜芦醇通过增加其与核纤层蛋白A的结合激活SIRT1；(ii) SIRT1和A型核纤层蛋白间受干扰的相互作用损害SIRT1功能，导致ASC群受损，这至少部分造成与HGPS有关的一些表型；(iii)白藜芦醇促进SIRT1和A型核纤层蛋白间的相互作用以激活SIRT1，因此，挽救ASC下降，改善早衰样表型，并延长早衰小鼠模型的寿命。本发明显示，白藜芦醇直接靶向SIRT1。此外，白藜芦醇和其它SIRT1激活剂可用于治疗HGPS。

[0178] 本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均通过引用结合到本文中，其程度与每个参考文献具体而单独指明通过引用予以结合且在本文以其整体予以阐述一样。

[0179] 在描述本发明的情况下使用的术语“a”和“an”和“the”和类似所指物要解释为涵盖单数和复数，除非本文中另有说明或上下文有明显抵触。

[0180] 数值范围的引用在本文中仅仅旨在用作单独提及落入该范围的每个单独值的简写方法，除非文中另有说明，而且每个单独值结合到本说明书中，就像在本文中单独引述一样。除非另有说明，否则本文提供所有精确值代表相应的近似值(例如关于特定因子或测量提供的所有精确的示例性值可视为也提供相应的近似测量，适当时被“约”修饰)。

[0181] 本文提供的任何和全部实例或示例性用语(如“例如”)的使用，仅仅旨在更好地说明本发明，并非限制本发明的范围，除非另有说明。本说明书中的任何言语都不应解释为说明任何要素是本发明实践中所必需的，除非同样有明确说明。

[0182] 有关一个或多个要素使用术语例如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”的本发明的任何方面或实施方案中的本文的描述旨在为“由”、“基本由”该特定的一种或多种要素“组成”或“基本包含”该特定的一种或多种要素的本发明的类似方面或实施方案提供支持，除非另有说明或上下文中明确抵触(例如在本文描述为包含特定要素的组合物应理解为还描述由该要素组成的组合物，除非另有说明或上下文中明确抵触)。

[0183] 应理解的是，本文所述实施例和实施方案仅用于说明目的，可对本领域技术人员提议根据其的各种修改或变动，且本申请的精神和范围内包括所述修改或变动。

[0184] 参考文献

[0185] Agarwal, B.和Baur, J.A. (2011). Resveratrol and life extension (白藜芦醇和寿命延长). Ann N Y Acad Sci 1215, 138-143。

[0186] Alcendor, R.R., Gao, S., Zhai, P., Zablocki, D., Holle, E., Yu, X., Tian, B., Wagner, T., Vatner, S.F.和Sadoshima, J. (2007). Sirt1 regulates 
aging and resistance to oxidative stress in the heart (Sirt1调节衰老和在心脏
中抵抗氧化应激). Circ Res 100, 1512-1521。

[0187] Banks, A.S., Kon, N., Knight, C., Matsumoto, M., Gutierrez-Juarez, R., Rossetti, L., Gu, W.和Accili, D. (2008). SirT1 gain of function increases energy efficiency and prevents diabetes in mice (小鼠中SirT1功能获得提高能量
效率和防止糖尿病). Cell Metab 8, 333-341。

[0188] Barger, J.L., Kayo, T., Pugh, T.D., Prolla, T.A.和Weindruch, R. (2008). Short-term consumption of a resveratrol-containing nutraceutical 
mixture mimics gene expression of long-term caloric restriction in mouse 
heart (短期摄食含有白藜芦醇的营养混合物模拟小鼠心脏中的长期热量限制的基因表
达). Experimental gerontology 43, 859-866。

[0189] Deng, C.X. (2009). SIRT1, is it a tumor promoter or tumor suppressor (SIRT1是肿瘤促进剂还是肿瘤抑制剂)? International journal of biological 
sciences 5, 147-152。

[0190] Baur, J.A. (2010). Biochemical effects of SIRT1 activators (SIRT1激活剂的生物化学作用). Biochim Biophys Acta 1804, 1626-1634。

[0191] Baur, J.A., Pearson, K.J., Price, N.L., Jamieson, H.A., Lerin, C., Kalra, A., Prabhu, V.V., Allard, J.S., Lopez-Lluch, G., Lewis, K等(2006). 
Resveratrol improves health and survival of mice on a high-calorie diet (白藜芦醇改进高热量饮食小鼠的健康和存活). Nature 444, 337-342。

[0192] Beher, D., Wu, J., Cumine, S., Kim, K.W., Lu, S.C., Atangan, L.和Wang, M. (2009). Resveratrol is not a direct activator of SIRT1 enzyme 
activity  (白藜芦醇不是SIRT1酶活性的直接激活剂). Chemical biology & drug 
design 74, 619-624。

[0193] Blencowe, B.J., Nickerson, J.A., Issner, R., Penman, S.和Sharp, P.A. (1994). Association of nuclear matrix antigens with exon-containing splicing complexes (核基质抗原与含有外显子的剪接复合物的缔合). J Cell Biol 127, 593-
607。

[0194] Bordone, L., Cohen, D., Robinson, A., Motta, M.C., van Veen, E., Czopik, A., Steele, A.D., Crowe, H., Marmor, S., Luo, J.等(2007). SIRT1 
transgenic mice show phenotypes resembling calorie restriction (SIRT1转基因小鼠显示类似于热量限制的表型). Aging Cell 6, 759-767。

[0195] Borra, M.T., Smith, B.C.和Denu, J.M. (2005). Mechanism of human SIRT1 activation by resveratrol (通过白藜芦醇的人SIRT1活化的机制). J Biol Chern 280, 17187-17195。

[0196] Brunet, A., Sweeney, L.B., Sturgill, J.F., Chua, K.F., Greer, PL.,Lin, Y., Tran, H., Ross, S.E., Mostoslavsky, R., Cohen, H.Y.等(2004). Stress-dependent regulation of FOXO transcription factors by the SIRT1 deacetylase 
(FOXO转录因子受SIRT1脱乙酰酶的应激依赖性调节). Science 303,2011-2015。

[0197] Burnett, C., Valentini, S., Cabreiro, F., Goss, M., Somogyvari, M., Piper, M.D., Hoddinott, M., Sutphin, GL., Leko, V., McElwee, J.1.等(2011). 
Absence of effects of Sir2 overexpression on lifespan in C. elegans and 
Drosophila (缺乏Sir2过量表达对秀丽隐杆线虫和果蝇寿命的作用). Nature 477, 482-
485。

[0198] Burtner, C.R.和Kennedy, B.K (2010). Progeria syndromes and ageing: what is the connection (早老综合征和老化：什么是连接点)? Nat Rev Mol Cell Biol 
11,567-57。

[0199] Candelario, J., Sudhakar, S., Navarro, S., Reddy, S.和Comai, L. (2008). Perturbation of wild-type lamin A metabolism results in a progeroid 
phenotype (干扰野生型核纤层蛋白A代谢导致早衰样表型). Aging Cell 7, 355-367。

[0200] Canto, C., Gerhart-Hines, Z., Feige, J.N., Lagouge, M., Noriega, L., Milne, J.C., Elliott, P.J., Puigserver, P.和Auwerx, J. (2009). AMPK regulates energy expenditure by modulating NAD+ metabolism and SIRT1 activity (AMPK通过调整NAD+代谢和SIRT1活性调节能量消耗). Nature 458, 1056-1060。

[0201] Cao, K., Blair, C.D., Faddah, D.A., Kieckhaefer, J.E., Olive, M., Erdos, M.R., Nabel, E.G和Collins, F.S. (2011). Progerin and telomere 
dysfunction collaborate to trigger cellular senescence in normal human 
fibroblasts (Progerin和端粒功能障碍联合引发正常人成纤维细胞的细胞衰老). J 
Clin Invest 121, 2833-2844。

[0202] Capell, B.C., Erdos, M.R., Madigan, J.P., Fiordalisi, J.J., Varga, R., Conneely, KN., Gordon, L.B., Der, C.J., Cox, A.D.和Collins, F.S. (2005). Inhibiting farnesylation of progerin prevents the characteristic nuclear 
blebbing of Hutchinson-Gilford progeria syndrome (抑制progerin的法尼基化防止
Hutchinson-Gilford早老综合征特有的核起泡). Proc Natl Acad Sci U S A 102, 
12879-12884。

[0203] Chalkiadaki, A.和Guarente, L. (2012). Sirtuins mediate mammalian metabolic responses to nutrient availability (Sirtuin介导对营养可利用性的哺乳动物代谢反应). Nature reviews Endocrinology。

[0204] Chen, D., Steele, A.D., Lindquist, S.和Guarente, L. (2005). Increase in activity during calorie restriction requires Sirt1 (热量限制期间活性的提高需要Sirt1). Science 310, 1641。

[0205] Cheng, H.L., Mostoslavsky, R., Saito, S., Manis, J.P., Gu, Y., Patel, P., Bronson, R., Appella, E., Alt, F.W.和Chua, K.F. (2003). Developmental defects and p53 hyperacetylation in Sir2 homolog (SIRT1)-deficient mice (Sir2同系物(SIRT1)-缺陷型小鼠中的发育缺陷和p53高度乙酰化). Proc Natl Acad Sci U S A 100, 10794-10799。

[0206] Dai, H., Kustigian, L., Carney, D., Case, A., Considine, T., Hubbard, B.P., Perni, R.B., Riera, T.V., Szczepankiewicz, B., Vlasuk, GP.等(2010). SIRT1 activation by small molecules: kinetic and biophysical evidence for 
direct interaction of enzyme and activator (SIRT1被小分子激活：酶和激活剂的直接相互作用的动力学和生物物理学证据). J Biol Chem 285, 32695-32703。

[0207] Denu, J.M. (2005). The Sir 2 family of protein deacetylases (蛋白质脱乙酰酶的Sir 2家族). Curr Opin Chem Biol 9, 431-440。

[0208] Donmez, G.和Guarente, L. (2010). Aging and disease: connections to sirtuins (衰老与疾病：与sirtuin的联系). Aging Cell 9, 285-290。

[0209] Downes, M., Ordentlich, P., Kao, H.Y., Alvarez, J.G和Evans, R.M. (2000). Identification of a nuclear domain with deacetylase activity (具有脱
乙酰酶活性的核结构域的鉴定). Proc Natl Acad Sci U S A 97, 10330-10335。

[0210] Eriksson, M., Brown, W.T., Gordon, L.B., Glynn, M.W., Singer, J., Scott, L., Erdos, M.R., Robbins, C.M., Moses, T.Y., Berglund, P.等(2003). 
Recurrent de novo point mutations in lamin A cause Hutchinson-Gilford 
progeria syndrome (核纤层蛋白A中反复的新生点突变引起Hutchinson-Gilford早老综
合征). Nature 423, 293-298。

[0211] Espada, J., Varela, I., Flores, I., Ugalde, A.P., Cadinanos, J., Pendas, A.M., Stewart, C.L., Tryggvason, K., Blasco, M.A., Freije, J.M.等
(2008). Nuclear envelope defects cause stem cell dysfunction in premature-
aging mice (核被膜缺陷引起早熟-老化小鼠中的干细胞功能障碍). J Cell Biol 181, 
27-35。

[0212] Fey, E.G, Bangs, P., Sparks, C.和Odgren, P. (1991). The nuclear matrix: defining structural and functional roles (核基质：限定结构和功能作用). Crit Rev Eukaryot Gene Expr 1, 127-143。

[0213] Finkel, T., Deng, C.X.和Mostoslavsky, R. (2009). Recent progress in the biology and physiology of sirtuins (sirtuin的生物学和生理学的最近进展). 
Nature 460, 587-591。

[0214] Fong, L.G, Frost, D., Meta, M., Qiao, X., Yang, S.H., Coffinier, C.和Young, S.G (2006). A protein farnesyltransferase inhibitor ameliorates 
disease in a mouse model of progeria (蛋白质法尼基转移酶抑制剂改善小鼠早衰模
型的疾病). Science 311, 1621-1623。

[0215] Fong, L.G, Ng, J.K, Meta, M., Cote, N., Yang, S.H., Stewart, C.L., Sullivan, T., Burghardt, A., Majumdar, S., Reue, K.等(2004). Heterozygosity 
for Lmna deficiency eliminates the progeria-like phenotypes in Zmpste24-
deficient mice (Lmna缺乏的杂合性清除Zmpste24-缺陷型小鼠中的早衰样表型). Proc Natl Acad Sci U S A 101, 18111-18116。

[0216] Gledhill, J.R., Montgomery, M.G., Leslie, A.G.和Walker, J.E. (2007). Mechanism of inhibition of bovine F1-ATPase by resveratrol and related 
polyphenols (通过白藜芦醇和相关多酚抑制牛F1-ATPase的机制). Proc Natl Acad Sci U S A 104, 13632-13637。

[0217] Glynn, M.W.和Glover, T.W. (2005). Incomplete processing of mutant lamin A in Hutchinson-Gilford progeria leads to nuclear abnormalities, which are reversed by farnesyltransferase inhibition (Hutchinson-Gilford早衰中突变
型核纤层蛋白A的不完全加工导致被法尼基转移酶抑制逆转的核异常). Hum Mol Genet 
14, 2959-2969。

[0218] Goodarzi, A.A., Noon, A.T., Deckbar, D., Ziv, Y, Shiloh, Y, Lobrich, M.和Jeggo, P.A. (2008). ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin (ATM信号转导促进与异染色质缔合的DNA双
链断裂的修复). Molecular cell 31, 167-177。

[0219] Gu, W.和Roeder, R.G. (1997). Activation of p53 sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53 C-terminal domain (通过p53 C端结构域的乙酰
化激活p53序列特异性DNA结合). Cell 90, 595-606。

[0220] Haigis, M.C.和Sinclair, D.A. (2010). Mammalian sirtuins: biological insights and disease relevance (哺乳动物的sirtuin：生物学见解和疾病关联性). 
Annual review of pathology 5, 253-295。

[0221] Han, M.K., Song, E.K., Guo, Y, Ou, X., Mantel, C.和Broxmeyer, H.E. (2008). SIRT1 regulates apoptosis and Nanog expression in mouse embryonic 
stem cells by controlling p53 subcellular localization (SIRT1通过控制p53亚细
胞定位调节小鼠胚胎干细胞的细胞凋亡和Nanog表达). Cell Stem Cell 2, 241-251。

[0222] Harikumar, KB.和Aggarwal, B.B. (2008). Resveratrol: a multitargeted agent for age-associated chronic diseases(白藜芦醇：年龄相关慢性疾病的多靶向
剂). Cell Cycle 7, 1020-1035。

[0223] Hawley, S.A., Ross, FA., Chevtzoff, C., Green, KA., Evans, A., Fogarty, S., Towler, M.C., Brown, L.J., Ogunbayo, O.A., Evans, A.M.等(2010). Use of cells expressing gamma subunit variants to identify diverse mechanisms of AMPK activation (表达γ亚基变体的细胞鉴定AMPK活化的不同机制的用途). Cell 
Metab 11, 554-565。

[0224] Hendzel, M.J., Delcuve, G.P.和Davie, J.R. (1991). Histone deacetylase is a component of the internal nuclear matrix (组蛋白脱乙酰酶是内部核基质的组分). J Biol Chem 266, 21936-21942。

[0225] Herranz, D., Munoz-Martin, M., Canamero, M., Mulero, F, Martinez-Pastor, B., Fernandez-Capetillo, O.和Serrano, M. (2010). Sirt1 improves 
healthy ageing and protects from metabolic syndrome-associated cancer (Sirt1
改进健康老龄化并防止代谢综合征相关癌症). Nature communications 1, 3。

[0226] Houtkooper, R.H., Pirinen, E.和Auwerx, J. (2012). Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan (作为代谢和健康寿命调节剂的Sirtuin). Nat Rev Mol Cell Biol。

[0227] Howitz, K.T., Bitterman, K.J., Cohen, H.Y., Lamming, D.W., Lavu, S., Wood, J.G., Zipkin, R.E., Chung, P., Kisielewski, A., Zhang, L.L.等(2003). 
Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae 
lifespan (sirtuin的小分子激活剂延长酿酒酵母的寿命). Nature 425, 191-196。

[0228] Kaeberlein, M., McDonagh, T., Heltweg, B., Hixon, J., Westman, E.A., Caldwell, S.D., Napper, A., Curtis, R., DiStefano, P.S., Fields, S.等(2005). Substrate-specific activation of sirtuins by resveratrol (sirtuin通过白藜芦醇的底物特异性活化). J Biol Chem 280, 17038-17045。

[0229] Kim, E.J., Kho, J.H., Kang, M.R.和Um, S.J. (2007). Active regulator of SIRT1 cooperates with SIRT1 and facilitates suppression of p53 activity 
(SIRT1的活性调节剂与SIRT1协作并促进p53活性的抑制). Mol Cell 28, 277-290。

[0230] Kim, J.E., Chen, J.和Lou, Z. (2008). DBC1 is a negative regulator of SIRT1 (DBC1是SIRT1的负调节剂). Nature 451, 583-586。

[0231] Klar, A.J., Fogel, S.和Macleod, K (1979). MAR1-a Regulator of the HMa and HMalpha Loci in SACCHAROMYCES CEREVISIAE (酿酒酵母中HMa和HMalpha基因座的MAR1-a 调节剂). Genetics 93, 37-50。

[0232] Krishnan, V., Chow, M.Z., Wang, Z., Zhang, L., Liu, B., Liu, X.和Zhou, Z. (2011). Histone H4 lysine 16 hypoacetylation is associated with 
defective DNA repair and premature senescence in Zmpste24-deficient mice 
(Zmpste24-缺陷型小鼠中组蛋白H4赖氨酸16乙酰化不足与缺陷型DNA修复和早衰有关). 
Proc Natl Acad Sci U S A 108,12325-12330。

[0233] Kruhlak, M.J., Lever, M.A., Fischle, W., Verdin, E., Bazett-Jones, D.P.和Hendzel, M.J. (2000). Reduced mobility of the alternate splicing factor (ASF) through the nucleoplasm and steady state speckle compartments (可变剪接因子(ASF)通过核质和稳态核斑区室的移动性降低). J Cell Biol 150, 41-51。

[0234] Kudlow, B.A., Stanfel, M.N., Burtner, C.R., Johnston, E.D.和Kennedy, B.K. (2008). Suppression of proliferative defects associated with processing-defective lamin A mutants by hTERT or inactivation of p53 (通过hTERT或p53的失活所致与加工缺陷型核纤层蛋白A突变体有关的增殖性缺陷的抑制). Mol Biol Cell 19, 
5238-5248。

[0235] Lavu, S., Boss, O., Elliott, P.J.和Lambert, P.D. (2008). Sirtuins--novel therapeutic targets to treat age-associated diseases (Sirtuin--治疗年龄相关疾病的新的治疗靶). Nat Rev Drug Discov 7, 841-853。

[0236] Lee, H., Kim, K.R., Noh, S.J., Park, H.S., Kwon, K.S., Park, B.H., Jung, S.H., Youn, H.J., Lee, B.K., Chung, M.J.等(2011). Expression of DBC1 
and SIRT1 is associated with poor prognosis for breast carcinoma (DBC1和SIRT1的表达与乳腺癌预后差有关). Hum Pathol 42, 204-213。

[0237] Li, L., Wang, L., Wang, Z., Ho, Y., McDonald, T., Holyoake, T.L., Chen, W.和Bhatia, R. (2012). Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances 
elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib (由SIRT1
抑制所致p53的活化与伊马替尼组合提高CML白血病干细胞的清除). Cancer Cell 21, 
266-281。

[0238] Li, W., Chen, H.Y.和Davie, J.R.  (1996). Properties of chicken erythrocyte histone deacetylase associated with the nuclear matrix (与核基质
缔合的鸡红细胞组蛋白脱乙酰酶的性质). Biochem J 314 (Pt 2), 631-637。

[0239] Lin, F.和Worman, H.J. (1993). Structural organization of the human gene encoding nuclear lamin A and nuclear lamin C (编码核核纤层蛋白A和核核纤
层蛋白C的人基因的结构性组织). J Bioi Chem 268, 16321-16326。

[0240] Liu, B., Wang, J., Chan, K.M., Tjia, W.M., Deng, W., Guan, X., Huang, J.D., Li, K.M., Chau, P.Y., Chen, D.J.等(2005). Genomic instability in laminopathy-based premature aging (基于核纤层蛋白病的早衰中的基因组的不稳定
性). Nat Med 11, 780-785。

[0241] Liu, B.和Zhou, Z. (2008). Lamin A/C, laminopathies and premature ageing (核纤层蛋白A/C、核纤层蛋白病和早衰). Histol Histopathol 23, 747-763。

[0242] Liu, Y., Wang, Y., Rusinol, A.E., Sinensky, M.S., Liu, J., Shell, S.M.和Zou, Y (2008). Involvement of xeroderma pigmentosum group A (XPA) in 
progeria arising from defective maturation of prelamin A (A型着色性干皮病
(XPA)参与由前核纤层蛋白A有缺陷的成熟引起的早衰). FASEB J 22, 603-611。

[0243] Lombard, D.B., Pletcher, S.D., Canto, C.和Auwerx, J. (2011). Ageing: longevity hits a roadblock (老化：长寿遇上路障). Nature 477, 410-411。

[0244] Manju, K., Muralikrishna, B.和Parnaik, V.K. (2006). Expression of disease-causing lamin A mutants impairs the formation of DNA repair foci (引
起疾病的核纤层蛋白A突变体的表达损害DNA修复灶的形成). J Cell Sci 119, 2704-
2714。

[0245] Mantel, C.R., Wang, R.H., Deng, C.和Broxmeyer, H.E. (2008). Sirt1, notch and stem cell “age asymmetry” (Sirt1、notch和干细胞“年龄不对称”). Cell Cycle 7, 2821-2825。

[0246] McBurney, M.W., Yang, X., Jardine, K., Hixon, M., Boekelheide, K., Webb, J.R., Lansdorp, P.M.和Lemieux, M. (2003). The mammalian SIR2alpha 
protein has a role in embryogenesis and gametogenesis (哺乳动物SIR2α蛋白在胚胎发生和配子形成中具有作用). Mol Cell Biol 23, 38-54。

[0247] McClintock, D., Ratner, D., Lokuge, M., Owens, D.M., Gordon, L.B., Collins, F.S.和Djabali, K. (2007). The mutant form of lamin A that causes 
Hutchinson-Gilford progeria is a biomarker of cellular aging in human skin 
(引起Hutchinson-Gilford早衰的核纤层蛋白A的突变体形式是人皮肤细胞老化的生物标
志物). PLoS One 2, e1269。

[0248] Mendez, J.和Stillman, B. (2000). Chromatin association of human origin recognition complex, cdc6 and minichromosome maintenance proteins 
during the cell cycle: assembly of prereplication complexes in late mitosis 
(细胞周期期间人源识别复合物cdc6和微染色体维持蛋白的染色质缔合：晚期有丝分裂中预复制复合物的装配). Mol Cell Biol 20, 8602-8612。

[0249] Milne, J.C., Lambert, P.D., Schenk, S., Carney, D.P., Smith, J.J., Gagne, D.J., Jin, L., Boss, O., Perni, R.B., Vu, C.B.等(2007). Small molecule activators of SIRT1 as therapeutics for the treatment of type 2 diabetes (作
为治疗2型糖尿病的治疗剂的SIRT1的小分子激活剂). Nature 450, 712-716。

[0250] Pacholec, M., Bleasdale, J.E., Chrunyk, B., Cunningham, D., Flynn, D., Garofalo, R.S., Griffith, D., Griffor, M., Loulakis, P., Pabst, B.等
(2010). SRT1720, SRT2183, SRT1460和resveratrol are not direct activators of 
SIRT1 (SRT1720、SRT2183、SRT1460和白藜芦醇不是SIRT1的直接激活剂). J Biol Chem 
285, 8340-8351。

[0251] Park, S.J., Ahmad, F., Philp, A., Baar, K., Williams, T., Luo, H., Ke, H., Rehmann, H., Taussig, R., Brown, A.L.等(2012). Resveratrol 
ameliorates aging-related metabolic phenotypes by inhibiting cAMP 
phosphodiesterases (白藜芦醇通过抑制cAMP磷酸二酯酶改善衰老相关代谢表型). Cell 
148, 421-433。

[0252] Pendas, A.M., Zhou, Z., Cadinanos, J., Freije, J.M., Wang, J., Hultenby, K., Astudillo, A., Wernerson, A., Rodriguez, F., Tryggvason, K.等
(2002). Defective prelamin A  processing and muscular and adipocyte 
alterations in Zmpste24 metalloproteinase-deficient mice (Zmpste24金属蛋白酶
缺陷型小鼠中缺陷型前核纤层蛋白A加工及肌肉和脂肪细胞改变). Nat Genet 31, 94-
99。

[0253] Pfluger, P.T., Herranz, D., Velasco-Miguel, S., Serrano, M.和Tschop, M.H. (2008). Sirt1 protects against high-fat diet-induced metabolic damage 
(Sirt1防止高脂肪饮食诱导的代谢损害). Proc Natl Acad Sci U S A 105, 9793-9798。

[0254] Phair, R.D.和Misteli, T. (2000). High mobility of proteins in the mammalian cell nucleus (哺乳动物细胞核中蛋白质的高移动性). Nature 404, 604-
609。

[0255] Picard, F., Kurtev, M., Chung, N., Topark-Ngarm, A., Senawong, T., Machado De Oliveira, R., Leid, M., McBurney, M.W.和Guarente, L. (2004). Sirt1 promotes fat mobilization in white adipocytes by repressing PPAR-gamma (Sirt1通过抑制PPAR-γ促进白脂肪细胞中的脂肪动员). Nature 429, 771-776。

[0256] Price, N.L., Gomes, A.P., Ling, A.J., Duarte, F.V., Martin-Montalvo, A., North, B.J., Agarwal, B., Ye, L., Ramadori, G., Teodoro, J.S.等(2012). 
SIRT1 is required for AMPK activation and the beneficial effects of 
resveratrol on mitochondrial function (SIRT1是AMPK活化和白藜芦醇对线粒体功能
的有益作用所必需的). Cell Metab 15, 675-690。

[0257] Rodgers, J.T., Lerin, C., Haas, W., Gygi, S.P., Spiegelman, B.M.和Puigserver, P. (2005). Nutrient control of glucose homeostasis through a 
complex of PGC-1alpha and SIRT1 (通过PGC-1α和SIRT1的复合物对葡萄糖稳态的营养控制). Nature 434, 113-118。

[0258] Rusinol, A.E.和Sinensky, M.S. (2006). Farnesylated lamins, progeroid syndromes and farnesyl transferase inhibitors (法尼基化核纤层蛋白、早衰样综合征和法呢基转移酶抑制剂). J Cell Sci 119, 3265-3272。

[0259] Ryan, R.F., Schultz, D.C., Ayyanathan, K., Singh, P.B., Friedman, J.R., Fredericks, W.J.和Rauscher, F.J., 3rd (1999). KAP-1 corepressor protein interacts and colocalizes with heterochromatic and euchromatic HP1 proteins: a potential role for Kruppel-associated box-zinc finger proteins in 
heterochromatin-mediated gene silencing (KAP-1协阻遏物蛋白质与异染色质和常染
色质HP1蛋白相互作用和共定位：异染色质介导的基因沉默中Kruppel相关盒-锌指蛋白的潜在作用). Molecular and cellular biology 19, 4366-4378。

[0260] Saunders, L.R., Sharma, A.D., Tawney, J., Nakagawa, M., Okita, K., Yamanaka, S., Willenbring, H.和Verdin, E. (2010). miRNAs regulate SIRT1 
expression during mouse embryonic stem cell differentiation and in adult 
mouse tissues (小鼠胚胎干细胞分化期间和在成年小鼠组织中miRNA调节SIRT1表达). 
Aging (Albany NY) 2, 415-431。

[0261] Scaffidi, P.和Misteli, T. (2005). Reversal of the cellular phenotype in the premature aging disease Hutchinson-Gilford progeria syndrome (早衰疾病Hutchinson-Gilford早老综合征中细胞表型的逆转). Nat Med 11, 440-445。

[0262] Scaffidi, P.和Misteli, T. (2006). Lamin A-dependent nuclear defects in human aging (人衰老时的核纤层蛋白A依赖性核缺陷). Science 312, 1059-1063。

[0263] Scaffidi, P.和Misteli, T. (2008). Lamin A-dependent misregulation of adult stem cells associated with accelerated ageing (与加速老化有关的成熟干细胞的核纤层蛋白A依赖性错误调节). Nat Cell Biol 10, 452-459。

[0264] Sgambato, A., Ardito, R., Faraglia, B., Boninsegna, A., Wolf, F.I.和Cittadini, A. (2001). Resveratrol, a natural phenolic compound, inhibits cell proliferation and prevents oxidative DNA damage (天然酚类化合物白藜芦醇抑制细胞增殖并防止氧化DNA损伤). Mutat Res 496, 171-180。

[0265] Smith, B.C., Hallows, W.C.和Denu, J.M.  (2008). Mechanisms and molecular probes of sirtuins (sirtuin的机制和分子探针). Chern Biol 15, 1002-
1013。

[0266] Sun, C., Zhang, F., Ge, X., Yan, T., Chen, X., Shi, X.和Zhai, Q. (2007). SIRT1 improves insulin sensitivity under insulin-resistant conditions by repressing PTP1B (在胰岛素抵抗条件下SIRT1通过抑制PTP1B改进胰岛素敏感性). 
Cell Metab 6, 307-319。

[0267] Timmers, S., Konings, E., Bilet, L., Houtkooper, R.H., van de Weijer, T., Goossens, G.H., Hoeks, J., van der Krieken, S., Ryu, D., Kersten, S.等(2011). Calorie restriction-like effects of 30 days of resveratrol 
supplementation on energy metabolism and metabolic profile in obese humans 
(30天白藜芦醇补充对胖人的能量代谢和代谢特征的热量限制样作用). Cell Metab 14, 
612-622。

[0268] Tissenbaum, H.A.和Guarente, L. (2001). Increased dosage of a sir-2 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans (升高剂量的sir-2基因延长秀丽
隐杆线虫的寿命). Nature 410, 227-230。

[0269] Toth, J.I., Yang, S.H., Qiao, X., Beigneux, A.P., Gelb, M.H., Moulson, C.L., Miner, J.H., Young, S.G.和Fong, L.G. (2005). Blocking protein farnesyltransferase improves nuclear shape in fibroblasts from humans with 
progeroid syndromes (阻断蛋白质法尼基转移酶改进患有早衰样综合征的人的成纤维细胞的核形状). Proc Natl Acad Sci U S A 102, 12873-12878。

[0270] Valenzano, D.R., Terzibasi, E., Genade, T., Cattaneo, A., Domenici, L.和Cellerino, A. (2006). Resveratrol prolongs lifespan and retards the onset of age-related markers in a short-lived vertebrate (白藜芦醇延长寿命和延迟短
寿脊椎动物中年龄相关标志物的出现). Current biology: CB 16, 296-300。

[0271] Varela, I., Cadinanos, J., Pendas, A.M., Gutierrez-Femandez, A., Folgueras, A.R., Sanchez, L.M., Zhou, Z., Rodriguez, F.J., Stewart, C.L., 
Vega, J.A.等(2005). Accelerated ageing in mice deficient in Zmpste24 protease is linked to p53 signalling activation (Zmpste24蛋白酶缺陷型小鼠的加速老化与
p53信号转导活化有关). Nature 437, 564-568。

[0272] Varela, I., Pereira, S., Ugalde, A.P., Navarro, C.L., Suarez, M.F., Cau, P., Cadinanos, J.,Osorio, F.G., Foray, N., Cobo, J.等(2008). Combined 
treatment with statins and aminobisphosphonates extends longevity in a mouse model of human premature aging (抑制素和氨基二膦酸盐类的联合治疗延长人早衰小
鼠模型的寿命). Nat Med 14, 767-772。

[0273] Villalba, J.M., de Cabo, R.和Alcain, F.J. (2012). A patent review of sirtuin activators: an update (最新的sirtuin激活剂专利综述). Expert opinion 
on therapeutic patents 22, 355-367。

[0274] Viswanathan, M.和Guarente, L. (2011). Regulation of Caenorhabditis elegans lifespan by sir-2.1 transgenes (通过sir-2.1转基因调节秀丽隐杆线虫寿
命). Nature 477, E1-2。

[0275] Viswanathan, M., Kim, S.K., Berdichevsky, A.和Guarente, L. (2005). A role for SIR-2.1 regulation of ER stress response genes in determining C. 
elegans life span (ER应激反应基因的SIR-2.1调节在测定秀丽隐杆线虫寿命中的作
用). Developmental cell 9, 605-615。

[0276] Wang, R.H., Sengupta, K., Li, C., Kim, H.S., Cao, L., Xiao, C., Kim, S., Xu, X., Zheng, Y, Chilton, B.等(2008). Impaired DNA damage response, 
genome instability和tumorigenesis in SIRT1 mutant mice (SIRT1突变型小鼠中受损的DNA损伤反应、基因组不稳定性和肿瘤发生). Cancer Cell 14, 312-323。

[0277] Wood, J.G., Rogina, B., Lavu, S., Howitz, K., Helfand, S.L., Tatar, M.和Sinclair, D. (2004). Sirtuin activators mimic caloric restriction and 
delay ageing in metazoans (Sirtuin激活剂模拟热量限制和延迟后生动物的老化). 
Nature 430, 686-689。

[0278] Zhao, W., Kruse, J.P., Tang, Y., Jung, S.Y., Qin, J.和Gu, W. (2008). Negative regulation of the deacetylase SIRT1 by DBC1 (脱乙酰酶SIRT1被DBC1负调节). Nature 451, 587-590。