在繁殖、调理和发酵期间用酒花酸提取物和有机酸处理微生物的方法

摘要

本发明涉及降低非期望的微生物浓度的方法，该方法包括(a)将一定量的可发酵碳水化合物、糖或纤维素引入含水系统中，(b)将一定量的所期望的微生物引入所述含水系统中，(c)将酒花酸提取物引入所述含水系统，及(d)将有机酸溶液引入所述系统中。

权利要求

1.控制在发酵过程中使用的水溶液中非期望的微生物浓度的方法，该方法包括以下步骤：(a)将可发酵碳水化合物引入所述水溶液中；

(b)将至少一种酵母引入所述溶液中；

(c)将酒花酸提取物引入所述溶液中；及(d)将至少一种选自以下组中的有机酸或其盐引入所述溶液中：柠檬酸、苯甲酸、丙酸或它们的盐；及其中所述非期望的微生物是乳酸生成菌。

2.控制在发酵过程中使用的含水系统中非期望的微生物浓度的方法，该方法包括以下步骤：(a)将可发酵碳水化合物引入所述含水系统中；

(b)将至少一种能够发酵碳水化合物的期望的微生物引入所述含水系统中；

(c)将至少一种酒花酸提取物引入所述含水系统中；及(d)将至少一种选自以下组中的有机酸或其盐引入所述含水系统中：柠檬酸、苯甲酸、丙酸或它们的盐；及其中所述非期望的微生物是乳酸生成菌。

3.根据权利要求1或2的方法，其中相继地实施所述步骤。

4.根据权利要求2的方法，其中所述有机酸或其盐是柠檬酸或其盐。

5.根据权利要求2的方法，其中在该水溶液中酒花酸提取物的量为由1ppm至100ppm。

6.根据权利要求2的方法，其中在该水溶液中酒花酸提取物的量为由2ppm至70ppm。

7.根据权利要求2的方法，其中在该水溶液中酒花酸提取物的量为由5至50ppm。

8.根据权利要求2的方法，其中在该水溶液中酒花酸提取物的量为由5至45ppm。

9.根据权利要求2的方法，其中所述酒花酸提取物的剂量为至少5ppm。

10.根据权利要求2的方法，其中所述有机酸或其盐的剂量为至少100ppm。

11.根据权利要求2的方法，其中所述有机酸或其盐的剂量为至少200ppm。

12.根据权利要求2的方法，其中所述有机酸或其盐的剂量为至少300ppm。

13.根据权利要求1的方法，其中所述有机酸或其盐是柠檬酸或其盐，酒花酸提取物与柠檬酸或其盐的重量比为由1:10至1:6500。

14.根据权利要求1的方法，其中所述有机酸或其盐是柠檬酸或其盐，酒花酸提取物与柠檬酸或其盐的重量比为由1:20至1:6400。

15.根据权利要求1的方法，其中所述有机酸或其盐是柠檬酸或其盐，酒花酸提取物与柠檬酸或其盐的重量比为由1:10至1:200。

16.根据权利要求1的方法，其中所述有机酸或其盐是柠檬酸或其盐，酒花酸提取物与柠檬酸或其盐的重量比为由1:25至1:100。

17.根据权利要求2的方法，其中所述期望的微生物选自以下组中：酵母、真菌、细菌或其组合。

18.减少发酵过程中抗生素的残余副产物的方法，该方法包括以下步骤：(a)将可发酵碳水化合物引入水溶液中；

(b)将至少一种酵母引入所述溶液中；

(c)将酒花酸提取物引入所述溶液中；及(d)将有机酸引入所述溶液中，其中所述有机酸选自：柠檬酸、苯甲酸、丙酸或它们的盐。

说明书

在繁殖、调理和发酵期间用酒花酸提取物和有机酸处理微生

物的方法

技术领域

[0001] 本发明技术主要涉及发酵过程中的微生物防治。具体而言，本发明技术涉及减少或控制非期望的微生物的浓度的方法。

背景技术

[0002] 微生物，如酵母，真菌和细菌，用于生产许多种发酵产品，如工业级乙醇、白酒、啤酒、葡萄酒、药物和保健食品(提供健康益处的食品、如强化食品和膳食补充剂)、烘焙工业和工业化学品。

[0003] 酵母通常用于发酵过程。一种常用的酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、主要用于烘焙和发酵的物种。非酵母菌属酵母也称作非传统酵母，也用于生产许多种商业产品。

[0004] 其他微生物也可用于生产发酵产品。例如，纤维素乙醇生产，由纤维素生物质生产乙醇，是使用真菌和细菌。这些分解纤维素真菌的例子包括里氏木霉(Trichoderma reesei)和绿色木霉(Trichoderma viride)。用于纤维素乙醇生产的细菌的一个例子是永达尔梭菌(Clostridium Ijungdahlii)。

[0005] 大多数用于酿酒厂和燃料乙醇厂的酵母购自特殊酵母的生产商。该酵母是通过繁殖过程生产的。繁殖涉及由小实验室酵母培养生长大量的酵母。在繁殖期间，向酵母供应通过有氧呼吸最佳生长所需或所期望的氧、氮、糖、蛋白质、脂质和离子。

[0006] 以前在酿酒厂，可以对酵母进行调理(conditioning)。调理与繁殖的区别在于其不涉及由小实验室培养大量生长。在调理期间，提供条件以使酵母再水合，将其由冬眠唤醒，并允许最大的生长和增殖。繁殖和调理的目的均是以高的存活率、高的出芽率及低水平的被其他微生物的侵染向发酵罐供应大体积的酵母。

[0007] 在繁殖和/或调理之后，酵母进入发酵过程。酵母在水溶液中与可发酵糖相结合。酵母消耗糖，将其转化成脂肪醇，如乙醇。

[0008] 发酵过程以可发酵碳水化合物的制备开始。在乙醇生产中，玉米是可发酵碳水化合物的一种可能的来源。也可以代替其他碳水化合物来源，包括谷粒和含有纤维素-淀粉的材料，如小麦或西非高粱。也可以使用纤维素生物质，如麦秆和玉米秸秆。近年来，纤维素乙醇生产受到关注，因为其使用容易获得的非食物生物质以形成有价值的燃料。

[0009] 繁殖、调理和发酵过程可以采用分批或连续方法实施。分批过程用于小规模生产。每个批次完成后，开始一个新的批次。连续发酵法用于大规模生产，因为其实现连续供应，无需每次重启。酒花酸和有机酸混合物可以分批或连续法使用。

[0010] 在繁殖、调理或发酵过程中，醪液或发酵混合物可能变得被其他微生物如腐败菌污染。这些微生物与期望种的酵母竞争可发酵糖，及延缓所期望的生物化学反应，由此降低产率。它们还会产生非期望的化学副产物，其会导致整个发酵批次酸败。

[0011] 乙醇生产者尝试增加由一蒲式耳谷粒(约56磅(25.4千克))产生乙醇的量。被微生物污染会降低酵母的功效，从而难以达到或超过每蒲式耳2.8至2.9加仑乙醇(0.42至0.44升每千克)的所期望的水平。降低微生物的浓度会促进酵母繁殖和/或调理及提高酵母功效，从而能够达到和超过这些所期望的水平。

[0012] 在这三个过程任一期间，酵母会变得被非期望的酵母，细菌或其他非期望的微生物污染。这会在用于繁殖、调理或发酵的许多容器之一中发生。其包括但不限于繁殖罐、调理罐、发酵剂罐、发酵罐以及在这些单元之间的管线和热交换器。

[0013] 细菌或微生物污染以三种主要的方式降低发酵产率。首先，可用于酵母生产酒精的糖被细菌或其他非期望的微生物消耗及偏离酒精生产，降低产率。其次，细菌代谢的最终产物如乳酸和乙酸抑制酵母生长及酵母发酵/呼吸，这导致较低效率的酵母生产。最后，细菌或其他非期望的微生物与酵母竞争除糖以外的营养素。

[0014] 在发酵系统或容器变得被细菌或其他非期望的微生物污染之后，这些细菌或其他微生物的生长可以远远快于所期望的酵母。该细菌或其他微生物与酵母竞争可发酵糖，及延缓所期望的生物化学反应，由此降低产率。细菌还产生非期望的化学副产物，其会导致整个发酵批次酸败。去除这些细菌或其他非期望的微生物允许所期望的酵母茁壮成长，这产生更高的生产效率。

[0015] 乙醇产率仅降低百分之一也是对燃料乙醇工业特别重要的。在较大的设备中，这样的效率下降会导致每年1百万至3百万美元的收入减少。

[0016] 在繁殖、调理和发酵期间减少细菌或其他非期望的微生物的一些方法的优点在于酵母相对于其他微生物具有更高的温度和pH耐受性。这是通过施加热量或降低酵母溶液的pH实现的。然而，这些方法对于延缓细菌生长不是完全有效的。此外，所期望的酵母微生物在存活期间被压制，不被认为是有活力或健康的。因此，酵母也不能发挥作用。

[0017] 在乙醇工业中主要趋势是在发酵开始时降低醪液(原料)的pH至小于4.5。降低醪液的pH会减少一些种的细菌的种群数量。然而减少成问题的细菌的功效明显更低，如乳酸生成菌。由于用于乙醇生产的酵母被压制，也显然降低乙醇产率。

[0018] 另一个方法涉及用磷酸洗涤酵母。该方法不能有效地杀灭细菌及其他微生物。也会压制用于乙醇生产的酵母，从而降低其功效。

[0019] 另一个方法是在批次之间通过加热或使用苛性化学品以对工艺设备进行杀菌。这在生产期间对于杀灭酵母混合物中的细菌和其他微生物是无效的。

[0020] 在另一个方法中，将抗生素添加至酵母繁殖、调理或发酵批次，以使细菌失效。发酵工业典型地将抗生素用于调理、繁殖和发酵过程。抗生素剂量率在0.1至3.0mg/L之间的范围内，一般不超过6mg/L。然而，在调理、繁殖和发酵中使用抗生素仍然存在问题。抗生素价格昂贵，并且会大幅增加大规模生产的成本。此外，抗生素并不是对所有的细菌菌株都有效，如细菌的抗生素耐药性菌株。过度使用抗生素会导致产生细菌的抗生素耐药性菌株的额外的变体。

[0021] 抗生素残留及产生抗生素耐药性菌株是全球性的问题。这些考虑可能会导致将来出台反对使用抗生素的监管行动。一个方面的考虑是用于动物饲料的酒糟。酒糟是发酵过程的粮渣。欧洲国家不允许乙醇厂的副产物作为动物饲料销售，若在设备中使用抗生素。酒糟销售占乙醇厂收益的高达20％。副产物中的抗生素浓度可以在由1至3重量％的范围内，因此丧失了这一重要的收入来源。

[0022] 此外，在使用抗生素时还要考虑其他问题。抗生素的混合物应当频繁地加以平衡和改变，以避免单独使用，这会导致抗生素耐药性菌株。有时不能将有效量的抗生素添加至发酵混合物。例如，使用超过2mg/L的维吉尼霉素会抑制发酵，但是要求超过25mg/L以抑制融合魏斯氏菌(Weisella confusa)的生长，其是新出现的成问题的细菌菌株。过度剂量或过度使用抗生素会压制酵母，及损害功效，或导致不符合规定。

[0023] 将发酵用于饮料的工业在历史上将酒花酸用于繁殖和发酵以防治与酵母竞争营养素的非期望的微生物。随着近年来燃料乙醇的扩展，以较低的程度使用酒花酸，以针对非期望的微生物。在酵母与非期望的微生物之间的竞争导致燃料乙醇的产率损失，这是因为非期望的微生物主要是乳杆菌(Lactobacillus)及醋杆菌(Acetobacter)降低发酵的功效。在饮料生产中，竞争微生物不仅降低功效，而且可以改变最终产品的美观和味道。

[0024] 有机酸具有许多应用，包括用作酸化剂、缓冲剂、抗氧剂、螯合剂、增效剂、膳食补充剂、调味剂、防腐剂和抗微生物剂。有机酸由于其对细菌的作用而用作防腐剂。有机酸的作用模式是不溶解的酸通过被动扩散渗透穿过细菌细胞壁，及以两种方式破坏细胞的正常生理：酸溶解，因此降低内部pH，其在正常情况下接近中性，损害细菌的功能。酸的阴离子部分无法以其溶解形式离开细胞，在其中累积，破坏代谢功能及提高渗透压。

[0025] 因为乙醇产率的小幅下降也是对燃料乙醇工业特征重要的，所以乙醇生产者总是寻找提高功效的途径。使用抗微生物剂以消除、减少或控制含水系统中微生物的数量。然而，使用抗微生物剂总是会增加运行和产品的成本，因此寻找实现微生物防治的更有效的途径。此外，一些抗微生物剂可能在其抗微生物作用范围方面具有缺陷或者在其施用方式方面具有操作限制，如缺乏温度稳定性或者易于由于环境或化学因素而灭活。

附图说明

[0026] 图1为显示在添加抗微生物剂之后及发酵结束(64小时)的时刻的细菌浓度的图。

[0027] 图2为显示处理的平均乙醇产率的图，表示为每克干玉米的乙醇克数。

[0028] 图3为显示在工厂试验条件下在不同的发酵中乙酸的对照图。

[0029] 图4为显示在工厂试验条件下在不同的发酵中乳酸的对照图。

[0030] 图5为显示在工厂试验条件下在不同的发酵中甘油的对照图。

具体实施方式

[0031] 对于在调理、繁殖和发酵中有机酸和酒花酸的组合，可以确定的是，不仅酒花酸与有机酸相容，而且在同时采用这两种技术时是协同的。这些产品的组合提供强有力的非抗生素的抗微生物处理。本发明可以在含水系统中用于降低非期望的微生物浓度、促进所期望的微生物繁殖及提高所期望的微生物功效。

[0032] 作为在此使用的ppm是作为单位体积的重量测量的，或者1ppm等于每升1mg(活性物质)。剂量定义为在所处理的系统中组分的浓度。

[0033] 作为在此使用的术语“有机酸”还涉及其盐。例如，在使用术语柠檬酸时，其包括柠檬酸的盐的形式。任何涉及的有机酸均包括其盐。

[0034] 术语“酒花酸”和“酒花酸提取物”可以交换使用。

[0035] 在本发明的一个方面，公开了用于控制在发酵过程中使用的含水系统中非期望的微生物浓度的方法。该方法包括以下步骤：

[0036] (a)将可发酵碳水化合物引入含水系统中；

[0037] (b)将至少一种酵母引入所述系统中；

[0038] (c)将酒花酸提取物引入所述系统中；及

[0039] (d)将至少一种有机酸引入所述系统中。

[0040] 在本发明的一个方面，公开了用于控制在发酵过程中使用的流体水溶液中非期望的微生物浓度的方法。该方法包括以下步骤：

[0041] (a)将可发酵碳水化合物引入含水系统中；

[0042] (b)将至少一种能够发酵碳水化合物的期望的微生物引入所述含水系统中；

[0043] (c)将至少一种酒花酸提取物引入所述含水系统中；及

[0044] (d)将至少一种有机酸引入所述含水系统中。

[0045] 通过采用在此所述的本发明方法可以减少在发酵过程中抗生素的残余副产物。在采用本发明方法时，在发酵过程中可以使用较少的或者不使用抗生素，从而产生较少的副产物。

[0046] 在含水系统中用于降低非期望的微生物浓度、促进所期望的微生物繁殖及提高所期望的微生物功效的本发明方法的一个非限制性的实施方案包括(a)将可发酵碳水化合物引入含水系统中，(b)将至少一种酵母或所期望的微生物引入所述含水系统中，及(c)使酒花酸提取物和有机酸与可发酵碳水化合物和/或酵母接触。优选的有机酸是柠檬酸。

[0047] 本发明的这些步骤可以相继地实施或以不同的顺序实施。酒花酸和有机酸可以与酵母或者与发酵碳水化合物接触，或者可以将酵母和可发酵碳水化合物组合，然后将酒花酸和有机酸引入酵母和碳水化合物的组合。酒花酸提取物和至少一种有机酸可以混合在一起，然后添加至含水系统，或者可以将它们分离地添加至含水系统。该含水系统可以在连续过程中，或者在分批过程的情况下可以是一个罐。

[0048] 在含水系统中用于降低非期望的微生物浓度、促进酵母繁殖及提高酵母功效的本发明方法的另一个非限制性的实施方案包括(a)将一定量的可发酵碳水化合物引入含水系统中，(b)将一定量的酵母引入所述含水系统中，及(c)使酒花酸提取物和至少一种有机酸与可发酵碳水化合物和/或酵母接触。这些步骤可以相继地实施或以不同的顺序实施。酒花酸提取物及有机酸可以混合在一起，然后添加至含水系统，或者可以将它们分离地添加至含水系统。

[0049] 在前述方法中，有意要减少的“非期望的”微生物与促进所期望的发酵过程的所期望的微生物竞争营养素。在发酵中不需要或非期望的微生物包括乳酸生成菌(LAB)及乙酸生成菌，其中乳杆菌(Lactobacillus)及醋杆菌(Acetobacter)是突出的代表。任何竞争可发酵培养基、导致其无法用于发酵有机体及因此降低产率的微生物都可以被认为是非期望的。在此，在本发明方法中使用的酒花酸提取物和有机酸不会不利地影响所期望的促进发酵的微生物的生长和存活率，但是要消除或抑制干扰发酵过程的非期望的微生物的生长。此外，非期望的微生物的消除或抑制有利地影响所期望的微生物的生长和存活率。

[0050] 待处理的含水系统的pH一般为由3至11，或由3至7，或由4至9，或由4至8，或由4至6.5，或由4.5至6。一般而言，有机酸在如下系统中功效最大，其中该系统的pH小于该酸或其盐的至少一个pKa值。

[0051] 适当地，可用于本发明的有机酸的非限制性例子包括但不限于柠檬酸、苯甲酸、丙酸、酒石酸、乙酸、苯磺酸、草酸、苹果酸、水杨酸、乳酸葡萄糖酸、羟基乙酸及它们的盐。出于本发明的目的，所述有机酸不是酒花酸。柠檬酸、苯甲酸、丙酸是优选的酸。对于本发明，柠檬酸是更优选的酸。

[0052] 可用于本发明的酒花酸的非限制性例子包括β-酸化合物、α-酸、异构化的α-酸、ρ-异构化的α-酸、四异构化的α-酸、六异构化的α-酸及啤酒花叶。在所处理的含水系统中至少0.5ppm且小于120ppm、或在1ppm与100ppm之间、或在2与70ppm之间、或在5与50ppm之间、或在5与45ppm之间的酒花酸提取物剂量可用于本发明。至少0.5ppm、或在2与15ppm之间、或在
5与15ppm之间、或在5与10ppm之间的酒花酸提取物剂量可用于本发明。

[0053] 在一些非限制性的实施方案中，所述协同溶液包含酒花酸提取物及柠檬酸或其盐，比例为1:10至1:6500，或1:15至1:6400，或1:20至1:6400，或1:20至1:1600，或由1:25至1:500，或由1:25至1:100，或由1:10至1:200。

[0054] 在一些非限制性的实施方案中，所述协同溶液包含酒花酸提取物及丙酸或其盐，比例为1:12.5至1:800，优选1:12.5至1:400，优选由1:12.5至1:50，或1:10至1:6500，或1:25至1:6400，或1:25至1:1600，或由1:25至1:500。

[0055] 在一些非限制性的实施方案中，所述协同溶液包含酒花酸提取物及苯甲酸或其盐，比例为1:50至1:400，优选1:50至1:200。

[0056] 酒花酸和有机酸可以在发酵过程中的单个或多个位置添加，包括一个或多个浆料罐、烹煮器、醪液冷却器、繁殖器及发酵罐。本领域技术人员也可以确定其他的添加位置。酒花酸和有机酸可以添加至工艺容器，如能够实施液化的可加热的调理罐，或酵母繁殖容器。该工艺容器也可以是发酵罐。

[0057] 在本发明方法中，降低了细菌及其他非期望的微生物的浓度，同时促进所期望的微生物的繁殖和/或调理。

[0058] 本发明的发明人发现，酒花酸提取物连同至少一种有机酸有效地降低了细菌及其他非期望的微生物的浓度，同时促进所期望的微生物的繁殖和/或调理。这些产品的组合提供协同的抗微生物处理，无需使用抗生素。

[0059] 本发明的发明人发现，添加少量的酒花酸提取物，例如约至少0.5ppm且小于120ppm(在所处理的系统中测得)或在1ppm与100ppm之间、或在2与70ppm之间、或在5与
50ppm之间、或在5与45ppm之间、或由5至10ppm，连同至少一种有机酸、优选柠檬酸一起，会产生协同效应。在一些非限制性的实施方案中，酒花酸与有机酸同时添加。在其他的实施方案中，将酒花酸与有机酸分离地添加至所处理的系统。酒花酸提取物的添加连同有机酸的添加一起产生改善的抗微生物功效。

[0060] 通过酵母发酵生产燃料乙醇用作一个例子。然而，这仅是一个示例。可以使用酒花酸和有机酸、优选柠檬酸的组合的其他发酵产品可以包括白酒、啤酒、葡萄酒、药物、药物中间体、烘焙产品、保健食品(提供健康益处的食品、如强化食品和膳食补充剂)、保健食品中间体、化工原料及酶。本发明方法也可用于处理在烘焙工业中使用的酵母。

[0061] 酵母菌属酵母是一种可使用的酵母，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在本发明中也可以使用非酵母菌属酵母。酵母并不是唯一的在发酵中使用的微生物。也可以使用额外的所期望的发酵微生物，并受益于本发明，如典型地用于纤维素乙醇生产的真菌和细菌。所期望的发酵微生物的一些非限制性例子包括但不限于里氏木霉(Trichoderma reesei)、绿色木霉(Trichoderma viride)和永达尔梭菌(Clostridium Ijungdahlii)。

[0062] 酒花酸提取物可用于杀灭细菌，同时允许酵母或其他期望的生产微生物存活和茁壮成长。发酵工业典型地将酒花酸提取物用于繁殖和发酵。

[0063] 酒花酸和有机酸可以在不同位置加入繁殖、调理和/或发酵过程中。酒花酸和有机酸可以添加至烹煮容器、发酵罐、繁殖罐、调理罐、发酵剂罐或者在液化期间。酒花酸和有机酸也可以直接添加至玉米醪。酒花酸和有机酸也可以添加至级间的热交换系统或热交换器。酒花酸和有机酸也可以添加至在这些单元或热交换器之间的管线。

[0064] 酒花酸和有机酸可以直接加入发酵混合物中。这可以例如在SSF(同时糖化和发酵)阶段中通过将酒花酸和有机酸连同酵母或其他期望的微生物和可发酵碳水化合物一起添加而实现。

[0065] 在一个非限制性的实施方案中，至少0.5ppm且小于120ppm、或在1ppm与100ppm之间、或在2与70ppm之间、或在5与50ppm之间、或在5与45ppm之间的酒花酸提取物剂量、或由2至15ppm的剂量、或由3至10ppm的剂量、或由5至10ppm的剂量、及在100与2000ppm之间或更大、或在200与1000ppm之间的有机酸剂量可以直接加入发酵混合物中。所述酸优选为柠檬酸、苯甲酸或丙酸。

[0066] 酒花酸和有机酸也可以在发酵过程之前添加至醪液。至少0.5ppm且小于120ppm、或在1ppm与100ppm之间、或在2与70ppm之间、或在5与50ppm之间、或在5与45ppm之间、或在2与15ppm之间、或在5与15ppm之间、或在5与10ppm之间的酒花酸提取物剂量以及在100与2000ppm之间或更大的有机酸剂量可以在发酵之前添加至醪液。

[0067] 酒花酸和有机酸也可以在繁殖和/或调理期间进行添加。例如酒花酸提取物可以添加至酵母泥，代替酸洗步骤。

[0068] 酒花酸可以连同有机酸一起用于在纤维素乙醇生产中实现改善的结果。与在基于碳水化合物生产乙醇的过程中使用的糖和淀粉不同，纤维素乙醇是一种由纤维素生产的乙醇。纤维素存在于非传统的生物质来源中，如柳枝稷、玉米秸秆和林业。由于大量可用的纤维素来源，此类乙醇生产是特别有吸引力的。纤维素乙醇由于原材料的特别性质而将更高水平的污染物及竞争微生物引入发酵过程中。所用的酒花酸可以连同有机酸一起用于纤维素乙醇生产以防治非期望的微生物。

[0069] 有两种由纤维素生产醇的基本方法。一种方法是使用诸如里氏木霉(Trichoderma reesei)和/或绿色木霉(Trichoderma viride)的真菌的水解法。另一种是使用诸如永达尔梭菌(Clostridium Ijungdahlii)的细菌的气化法。酒花酸可以连同有机酸一起用于任一种方法。

[0070] 在发酵过程之前，在水解过程中纤维素链破碎成五碳糖和六碳糖。这是通过化学方式或酶的方式实现的。

[0071] 在化学水解方法中，纤维素可以在高的温度和压力下用稀酸处理或者在较低温度和大气压下用浓酸处理。在化学水解过程中，纤维素与酸和水反应生成单个糖分子。然后中和这些糖分子，及采用酵母发酵以生产乙醇。酒花酸可以连同有机酸一起在该方法的酵母发酵部分中使用。

[0072] 可以采用两种方法进行酶解。第一种称作微生物直接转化法(DMC)。DMC法使用单一的微生物以将纤维素生物质转化成乙醇。乙醇和所需的酶是通过相同的微生物产生的。酒花酸可以连同有机酸一起在使用该专用生物的繁殖/调理或发酵步骤中使用。

[0073] 第二方法称作酶解法。在该方法中，使用纤维素酶破碎纤维素链。这些酶典型地存在于反刍动物如牛和羊的胃中，以破碎它们吃下的纤维素。酶法典型地在四或五个阶段中进行。对纤维素进行预处理，以使原材料如木材或麦秆更容易发生水解。接着使用纤维素酶将纤维素分子破碎成可发酵糖。在水解之后，将糖从残余物料中分离出并添加至酵母。使用酵母使水解产物糖发酵成乙醇。最后通过蒸馏回收乙醇。替代性地，可以通过使用能够完成这两个过程的特殊的细菌或真菌，一起实施水解和发酵。在这两个步骤一起实施时，该方法称作相继的水解和发酵(SHF)。

[0074] 为了微生物功效，酒花酸可以连同有机酸一起在酶解法中的不同位置引入。酒花酸可以连同有机酸一起用于通过木霉素(Trichoderma)及其他真菌菌株产生的纤维素酶的生产、制造和发酵。酒花酸和有机酸可以加入纤维素同时糖化和发酵阶段(SSF)中。酒花酸和有机酸可以引入相继的水解和发酵(SHF)阶段中。它们也可以在通过产生纤维素酶的分解纤维素真菌的发酵之前、期间或之后的位置引入。替代性地，酒花酸可以连同有机酸一起在酵母发酵阶段中添加，如上所述。

[0075] 气化过程不会将纤维素链破碎成糖分子。首先，纤维素中的碳在部分燃烧反应中被转化成一氧化碳、二氧化碳和氢。然后将一氧化碳、二氧化碳和氢引入使用能够消耗一氧化碳、二氧化碳和氢以产生乙醇和水的微生物如永达尔梭菌(Clostridium Ijungdahlii)的特殊发酵罐中。最终在蒸馏步骤中从水中分离出乙醇。酒花酸和有机酸可以在涉及能够消耗一氧化碳、二氧化碳和氢以产生乙醇和水的微生物如永达尔梭菌(Clostridium Ijungdahlii)的发酵步骤中用作抗菌剂。

[0076] 在一个非限制性的实施方案中，将酒花酸和有机酸添加至罐中并以预定的比例稀释至预定的浓度。在该罐中，将酒花酸提取物，如异构化的α-提取物和有机酸，如柠檬酸溶解在水中，以形成酒花酸和有机酸的混合物。批料罐中的酒花酸提取物溶液和有机酸溶液的浓度可以跨越一个宽的范围改变。然后将混合的酒花酸提取物/有机酸溶液通过出口以给定的剂量由批料罐排出，以产生具有所期望的浓度的溶液。

[0077] 在一个非限制性的实施方案中，酒花酸与有机酸的比例为由1:200至1:10的比例。所述罐典型地为预混罐。

[0078] 含有微生物水溶液的工艺容器经由批料罐上的出口以流体方式连接至批料罐。工艺容器可以是烹煮容器、发酵罐、调理罐、发酵剂罐、繁殖罐、液化容器和/或在这些单元之间的管线或热交换器。装入工艺容器中的酒花酸提取物/有机酸溶液能够促进存在的生产微生物的繁殖，同时降低非期望的微生物的浓度。

[0079] 在较小规模生产发酵产品时，橇装式设备是理想的。橇装允许设备在离位生产，运输至所期望的位置，且容易安装。这确保运输、快速搭建和试运行容易进行。批料罐、工艺容器和连接设备可以橇装方式建造。

[0080] 可以将酒花酸和有机酸组合，然后添加至待处理的系统。它们也可以相继地或分离地添加至待处理的系统。添加至待处理的系统的酒花酸与有机酸的比例可以高达由1:6000至1:5，或1:6000至1:10，或1:500至1:10，或1:200至1:20，或1:100至1:10，或1:100至
1:20。

[0081] 在本发明中有机酸的使用量可以为由12500ppm低至100ppm，由6250低至100ppm，或由4000低至100ppm，或由4000低至200ppm，或由1000低至100ppm，或由1000低至200ppm。一般使用至少100ppm、或至少200ppm、或至少300ppm的有机酸。酒花酸的使用量可以为至少
0.5ppm且小于120ppm，或在1ppm与100ppm之间，或在2与70ppm之间，或在5与50ppm之间，或在5与45ppm之间，或0.5ppm至20ppm，或由0.5ppm至15ppm，或由2至15ppm，或由2至12ppm，或由3至12ppm，或由3至10ppm。在本发明中酒花酸的使用量一般为至少2ppm或至少3ppm。可用于本发明的有机酸包括柠檬酸、苯甲酸及丙酸及它们的盐，优选为柠檬酸或其盐。本发明的组分(酒花酸和有机酸)可以分离地添加至含水系统，或者先混合然后再添加。有机酸可以添加至含水侧系统(aqueous side systems)，包含其他添加剂，例如但不必然限制于表面活性剂、阻垢和防腐化合物、离子或非离子聚合物、pH调节剂及其他用于改变或修饰含水系统的化学性质的添加剂。

[0082] 本领域技术人员通过在此所述的教导能够确定所需的组合物的浓度，以实现可接受的微生物防治，该浓度取决于基质。

[0083] 在用于发酵系统中时，所述酸可以在发酵系统的不同位置添加，例如可以在发酵过程中的单个或多个位置添加，包括一个或多个浆料罐、烹煮器、醪液冷却器、繁殖器及发酵罐。本领域技术人员也可以确定其他的添加位置。

[0084] 虽然显示和描述了本发明的特别的元件、实施方案和应用，但是当然应当理解，本发明并非限制于此，因为本领域技术人员在不偏离本发明公开的范围的情况下，特别是依照前述的教导，可以作出修改。

[0085] 实施例

[0086] 在以下实施例中报告的协同系数使用下式，其首先报告于F.C.Kull,P.C.Eisman,H.D.Sylwestrowka,and R.L.Mayer,Applied Microbiology 9:538-541,1961：

[0087] 协同系数＝Qa/QA+Qb/QB

[0088] 其中，

[0089] Qa是抗微生物剂A在连同抗微生物剂B使用时实现测试微生物生长的完全抑制所需的浓度；

[0090] QA是抗微生物剂A在单独使用时实现测试微生物生长的完全抑制所需的浓度；

[0091] Qb是抗微生物剂B在连同抗微生物剂A使用时实现测试微生物生长的完全抑制所需的浓度；

[0092] QB是抗微生物剂B在单独使用时实现测试微生物生长的完全抑制所需的浓度。

[0093] 协同系数(SI)为1表明两种抗微生物剂之间的相互作用仅仅是相加的，SI大于1表明两种抗微生物剂彼此是对抗性的，SI小于1表明两种抗微生物剂以协同方式相互作用。

[0094] 在以下实施例中用于测量抗微生物剂活性水平的终点称作最小抑制浓度(Minimal Inhibitory Concentration，或MIC)。其是可实现生长的完全抑制的一种或多种物质的最小浓度。

[0095] 为了确定最小抑制浓度，构建抗微生物剂的2倍倍比稀释系列，稀释物在生长培养基中制备。在96孔微滴定板中制备稀释物，因而每个孔具有最终体积为280μl的培养基和抗微生物剂。第一孔例如具有浓度为1000ppm的抗微生物剂，第二为500ppm，第三为250ppm，以此类推，行中的最后的第12孔根本不具有抗微生物剂，用作正的生长对照。在制定稀释系列之后，孔接收悬浮在生长培养基中的微生物的接种物，因而孔中微生物的最终浓度为约5×105cfu/ml。在这些实施例中，所用的测试微生物是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。将培养物在37℃下孵育18至24小时，基于外观检查混浊的孔，评定孔是正的还是负的生长，混浊是生长的指示。完全抑制生长的抗微生物剂的最小浓度(例如清澈的孔)被指定为最小抑制浓度。

[0096] 为了确定两种抗微生物剂之间的相互作用对于目标微生物是相加的，还是对抗性的，还是协同的，使用96孔微滴定板采用称作“棋盘”法的改变的MIC法。为了构建棋盘孔板，使用用于构建MIC孔板的2倍倍比系列稀释法布置第一抗微生物剂，区别在于每8行是相同的稀释系列，其在第8列后结束。通过相对于第一系列以直角添加相同体积的2倍倍比稀释系列布置第二抗微生物剂。结果是8×8孔正方形的每个孔具有不同的抗微生物剂浓度组合，共实现64种不同的组合。第9和第10列根本不接收抗微生物剂，分别用作正和负的生长对照。在构建棋盘微滴定板之后，用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)接种，在37℃下孵育，如针对MIC法所述进行评定。

[0097] 实施例1：柠檬酸与酒花酸的协同作用

[0098] 针对柠檬酸和酒花酸在pH为6时使用上述规则测定最小抑制浓度，使用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)作为测试微生物。如所述构建棋盘协同孔板，对孔进行接种直至约5×105cfu/ml的最终浓度，孵育18至24小时，然后通过外观评定生长/未生长。根据Kull等人所述的公式计算协同系数。该实施例表明，柠檬酸和酒花酸组合的作用大于单独的抗微生物剂的作用。抑制细菌生长所需的柠檬酸的量由100,000ppm下降到391至12,500ppm。酒花酸的浓度由31.3ppm下降到1.96至15.6ppm的范围。

[0099]

[0100] 实施例2：苯甲酸与酒花酸的协同作用

[0101] 针对苯甲酸和酒花酸在pH为6时使用上述规则测定最小抑制浓度，使用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)作为测试微生物。如所述构建棋盘协同孔板，对孔进行接种直至约5×105cfu/ml的最终浓度，孵育18至24小时，然后通过外观评定生长/未生长。根据Kull等人所述的公式计算协同系数。该实施例表明，苯甲酸和酒花酸组合的作用大于单独的抗微生物剂的作用。

[0102]

[0103] 实施例3：发酵实验室数据

[0104] 使用酒花酸提取物和柠檬酸在玉米至乙醇国家研究中心进行评估。所测试的样品及其浓度可见于图1和表3。进行测试以评估在与在燃料乙醇工业中所用的条件相似的条件下制得的玉米醪液中二元抗微生物剂对乙醇生产的影响。研究了两种特定的作用：(1)在被乳酸菌污染的发酵中抗微生物剂影响乙醇产率和糖转化率的能力，及(2)与无细菌发酵的对照物相比抗微生物剂防治细菌侵染的能力。针对各个处理和对照(接种和未接种)，制备玉米粉、水和酶的三种160克浆料(30％w/w干固体)。将浆料在83℃下孵育90分钟，冷却至40℃，然后用植物乳杆菌(L.plantarum)接种。然后向浆料按计量添加抗微生物剂。设备将二氧化氯、酒花酸提取物和柠檬酸按计量添加至250mL三角瓶，在添加抗微生物剂后15、30和60分钟的时候采集样品。在采集3个时间点的样品之后，通过添加300μl的5N硫酸调节醪液的pH至<5.2。添加至发酵瓶的所有的酶、营养素及其他调理剂均是在使用前新制备的。作为无菌的0.2g/ml溶液添加尿素直至500ppm(w/w)的最终浓度，基于尿素的氮含量(w/w，基于醪液的总质量)。葡糖淀粉酶(Spirizyme Excel，Novozymes)作为0.25g/ml溶液制备，以
0.066％(w/w，基于玉米的湿重)的剂量添加。添加无菌水，使各个处理的总固体含量相等。
所有发酵瓶用酵母(Saccharomyces cerevisiae)的0.2g/ml悬浮液接种。在接种到发酵瓶中之前，该悬浮液在40℃下进行孵育及混合30分钟。每个发酵瓶用170μl的酵母悬浮液接种，以获得1×107个酵母细胞/ml的初始浓度。在完成所有的添加之后记录每个瓶的质量，然后将消毒的发酵阱插入每个瓶中，将它们再次称重。这些瓶在培养箱/摇床中以170rpm摇动的情况下在32℃下孵育总计64小时。在3天的孵育过程中通过周期性地对发酵瓶称重(在用酵母接种后0、17.5、22.5、42.5、48和64小时)，从而监测发酵进程。在发酵结束时通过HPLC测定培养基(葡萄糖、DP2、DP3和DP4+，其中“DPx”代表具有“x”个亚基的葡萄糖寡聚体)和产品(乙醇、甘油、乳酸和乙酸)的浓度。通过离心分离以去除大的固体，然后通过0.45μm注射器式过滤器进行过滤，及通过添加硫酸直至0.01N的最终浓度从而酸化至pH约为2，制备样品用于HPLC。在孵育64小时之后，测定最终pH、总干固体和溶解的干固体的浓度以及啤酒滤液的密度。对来自每个瓶的样品进行菌落计数。

[0105] 表3

[0106]

[0107] 该实施例表明，在发酵期间5ppm酒花酸与200ppm柠檬酸组合有效地减少细菌，这是出人意料地低。5ppm酒花酸与400ppm柠檬酸的组合产生甚至更好的结果。10ppm酒花酸/400ppm柠檬酸的协同混合物减少约3log(减少99.9％)的乳杆菌(Lactobacillus)。

[0108] 图2和表4所示为在发酵后未侵染的对照物和三个样品的平均乙醇产率。在所有的处理中平均乙醇产率没有观察到明显的差别(P＝0.055)，使用ANOVA。图2和表4中的数据为3个独立的重复发酵瓶的平均值。

[0109] 表4

[0110]

[0111] 处理的平均乙醇产率表示为每克干玉米的乙醇克数。

[0112] 实施例4：工厂试验数据

[0113] 在每年55百万加仑乙醇的设备进行工厂规模的评估，以评估酒花酸/柠檬酸二元抗微生物剂对乙醇生产的影响。该工厂使用50％玉米/50％高粱(西非高粱)混合物作为其原料。所测试的酒花酸和柠檬酸的浓度和比例可见于表5。在本试验中研究了三种特定的作用：(1)对甘油水平的作用，(2)对乳酸水平的作用，及(3)对乙酸水平的作用。在工厂，大约每17小时构建批料繁殖器，输送至发酵罐装料/SSF(同时糖化和发酵)阶段的开始。在第1小时，它们开始向繁殖容器装料直至12,500加仑的工作体积，包含15％醪液固体，在此时添加100磅尿素。在第2小时，经由粒化槽添加3加仑Provia(为西非高梁混合物设计的蛋白酶)和
30kg的Beta-Tec(Vita-Hop)，在繁殖器为满量的67％时。在第3小时，经由繁殖容器的顶部添加异构提取物酒花酸(改变的量，参见表5)。然后将200mL葡糖淀粉酶添加至繁殖容器的顶部，接着经由粒化槽添加60kg的SLY液体酵母。然后冲洗粒化槽。然后将柠檬酸(参见表5)经由粒化槽添加至繁殖容器，繁殖器构建现在完成。在第5小时，通过测量pH、白利糖度、温度，百分比出芽率、细胞数和百分比存活率，测量酵母品质/性能分析。在第8小时，重复测量，实施HPLC测试以确定DP4、DP3、麦芽糖、右旋糖、乳酸、甘油、乙酸和乙醇百分比。在第9小时将繁殖器容积送至发酵罐。图3、4和5是显示所产生的统计数据的对照图。UCL(控制上限)和LCL(控制下限)显示于图中。乳酸菌代谢掉糖并产生乳酸和乙酸。图3和4显示乙酸和乳酸被充分地操控，表明酒花酸/柠檬酸的组合保持了乙醇厂中的微生物防治。甘油测量反映酵母的健康状况，表明酒花酸/柠檬酸的混合物并不影响酿酒酵母(S.cerevisiae)的性能(图
5)。设备在所有的剂量下均运行良好，其中酒花酸减少了历史剂量的至少42％。

[0114] 表5

[0115]