一种气管支架及其应用

摘要

本发明涉及一种气管支架及其应用。所述的气管支架设有支撑环和支撑连杆，各个所述的支撑环为C型，且各个支撑环由支撑连杆串联连接，从而使得各个支撑环和支撑连杆固定成一体。本发明还提供了一种组织工程气管，它是在所述的气管支架的外表面包绕软骨细胞‑明胶/聚己内酯电纺膜复合物制成。应用本发明的气管支架或组织工程气管，可通过气管外支撑悬吊法修复气管狭窄，并在植入后形成新的C型软骨环，最终使之具有可生长潜能。

权利要求

1.一种气管支架，其特征在于，所述的气管支架设有支撑环和支撑连杆，各个所述的支撑环为C型，各个所述的支撑环形状大小相同，在轴向方向上等距平行排布，且各个支撑环由支撑连杆串联连接，从而使得各个支撑环和支撑连杆固定成一体，形成侧壁带有轴向缺口的镂空圆管状结构；所述的支撑连杆数目为两根，各个所述的支撑环的两端端部由支撑连杆串联连接。

2.根据权利要求1所述的气管支架，其特征在于，所述的气管支架由生物可降解材料制成。

3.根据权利要求1所述的气管支架，其特征在于，所述的气管支架内径为5-10mm，外径为6-12mm，所述的支撑环宽度为1-3mm，相邻支撑环之间的间隙为1-4mm。

4.一种组织工程气管，其特征在于，它是由以下方法制备得到的：

a)将明胶和聚己内酯溶于三氟乙醇中，搅拌至完全溶解得到明胶/聚己内酯纺丝液，其中所述明胶、聚己内酯和三氟乙醇的比例为0.5g:(0.4-0.6)g:(8-12)ml；向所述明胶/聚己内酯纺丝液中加入乙酸，搅拌至溶液由浑浊变澄清，所述乙酸与明胶/聚己内酯纺丝液的比例为10μl:(8-12)ml；抽取澄清的明胶/聚己内酯纺丝液，固定在静电纺丝装置上，调整静电压为5-15kv，接受距离为10-15cm，注射速率为1.5-2.5ml/h，进行电纺，采用铝箔为接受装置，纺丝，得到明胶/聚己内酯膜，厚度为20-40μm，真空冷冻干燥消毒处理；

b)将耳廓软骨悬液接种于所述明胶/聚己内酯膜上，接种比例为(4.2-8.3)×1011个/cm3；然后将接种后的明胶/聚己内酯膜围绕权利要求1-3任一所述的气管支架包绕6-9层，将轴向缺口处的膜片沿中轴剪开后分别贴服于气管支架两边的内壁。

5.根据权利要求4所述的组织工程气管，其特征在于，它是由以下方法制备得到的：

a)将明胶和聚己内酯溶于三氟乙醇中，搅拌至完全溶解得到明胶/聚己内酯纺丝液，其中所述明胶、聚己内酯和三氟乙醇的比例为0.5g:0.5g:10ml；向所述明胶/聚己内酯纺丝液中加入乙酸，搅拌至溶液由浑浊变澄清，所述乙酸与明胶/聚己内酯纺丝液的比例为10μl:

10ml；抽取澄清的明胶/聚己内酯纺丝液，固定在静电纺丝装置上，调整静电压为10kv，接受距离为12cm，注射速率为2ml/h，进行电纺，采用铝箔为接受装置，纺丝，得到明胶/聚己内酯电纺膜，厚度为30μm，真空冷冻干燥消毒处理；

b)将耳廓软骨悬液接种于所述明胶/聚己内酯电纺膜上，其中接种比例为5.6×1011个/cm3；然后将接种后的明胶/聚己内酯电纺膜围绕权利要求1-3任一所述的气管支架包绕7层，将轴向缺口处的膜片沿轴向剪开后分别贴服于所述气管支架两边的内壁上。

6.权利要求1-3任一所述的气管支架、权利要求4或5所述的组织工程气管在制备人工气管中的应用。

说明书

一种气管支架及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医疗器械技术领域，具体地说，涉及一种气管支架、基于所述气管支架的组织工程气管以及它们的用途。

背景技术

[0002] 临床上气管畸形在先天性心脏病(先心病)患儿中的发病率较高，文献报道可占到先心病患儿的12.9％左右。而我国先心病发病率约为0.7％～0.8％，每年新增患儿约15万人。在我们上海交通大学附属儿童医学中心心脏中心，每年有很多先心病患儿合并气管畸形。气管畸形中最常见的是气管狭窄，心血管畸形使气管受压、软化是其原因之一。婴幼儿气管狭窄的治疗仍然是临床难题，目前仅有我们上海交通大学附属儿童医学中心心脏中心对先心病伴气管狭窄的患儿同时行一期手术矫治，但预后欠佳，近期病死率达20％左右。

[0003] 针对气管狭窄，目前临床外科主要的手术方式为端端吻合术及滑片吻合术(Slide法)。端端吻合术即切除狭窄段后直接吻合，主要针对长度不超过1.5cm的短段气管狭窄，而对超过1.5cm的长段狭窄效果不理想，这类病例多采用滑片吻合术，即将狭窄段气管切断后，上端剪开前壁，下端剪开后壁，扩张后对位缝合。我们科徐志伟教授率先在国内开展了大量这方面的手术，积累了非常丰富的经验。然而这两种手术方式术后容易导致吻合口破裂，漏气，肉芽增生等并发症发生，这些并发症一旦发生则严重影响治疗效果。并且，对许多均匀的、长段气管狭窄患儿，因为没有合适的气管修复材料而无法采用Slide法进行修补，不得不放弃外科手术这唯一的希望，预后极差，成为全球医学界治疗的难点、争议的焦点和研究的热点。因此，寻找新的手术方式和气管修复材料，成为解决复杂的长段先天性气管狭窄伴先心病问题的关键。

[0004] 我们知道，正常的气管为管型，由内向外为粘膜上皮层、粘膜下结缔组织层和软骨层。粘膜上皮层是一道重要的生理屏障，能促进气道分泌物的排出，并且有研究表明，完整的粘膜上皮层具有抑制肉芽增生的作用。粘膜下结缔组织层里面含有丰富的腺体和血管，能够为气管提供良好的血供。软骨层一般为C型的软骨环，起到支撑气管，防止气管在呼吸时塌陷的作用。无论是端端吻合术还是滑片吻合术均破坏了气管的三层结构，尤其是粘膜上皮层和粘膜下结缔组织层，从而导致术后漏气、出血、肉芽增生等并发症的出现。那么，能否在不破坏气管上皮层和粘膜下结缔组织层的前提下进行气管狭窄的修复，从而避免传统手术方法的缺陷？目前关于该种手术方法和手术器械还未见报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种气管支架。

[0006] 本发明的再一的目的是，提供一种组织工程气管。

[0007] 本发明的另一的目的是，提供所述的气管支架和组织工程气管的用途。

[0008] 为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

[0009] 一种气管支架，所述的气管支架设有支撑环和支撑连杆，各个所述的支撑环为C型，且各个支撑环由支撑连杆串联连接，从而使得各个支撑环和支撑连杆固定成一体，形成侧壁带有轴向缺口的镂空圆管状结构。

[0010] 各个所述的支撑环形状大小相同。

[0011] 各个所述的支撑环在轴向方向上等距平行排布。

[0012] 各个所述的支撑环的两端端部由支撑连杆串联连接。

[0013] 所述的支撑连杆数目为一根、两根、三根或三根以上。

[0014] 所述的气管支架由生物可降解材料制成。

[0015] 所述的气管支架内径为5-10mm，外径为6-12mm，所述的支撑环宽度为1-3mm，相邻支撑环之间的间隙为1-4mm。

[0016] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

[0017] 一种组织工程气管，它是由以下方法制备得到的：

[0018] a)将明胶和聚己内酯溶于三氟乙醇中，搅拌至完全溶解得到明胶/聚己内酯纺丝液，其中所述明胶、聚己内酯和三氟乙醇的比例为0.5g:(0.4-0.6)g:(8-12)ml；向所述明胶/聚己内酯纺丝液中加入乙酸，搅拌至溶液由浑浊变澄清，所述乙酸与明胶/聚己内酯纺丝液的比例为10μl:(8-12)ml；抽取澄清的明胶/聚己内酯纺丝液，固定在静电纺丝装置上，调整静电压为5-15kv，接受距离为10-15cm，注射速率为1.5-2.5ml/h，进行电纺，采用铝箔为接受装置，纺丝，得到明胶/聚己内酯膜，厚度为20-40μm，真空冷冻干燥消毒处理；

[0019] b)将耳廓软骨悬液接种于所述明胶/聚己内酯膜上，接种比例为(4.2-8.3)×1011个/cm3；然后将接种后的明胶/聚己内酯膜围绕如上任一所述的气管支架包绕6-9层，将底部的膜片沿中轴剪开后分别贴服于气管支架两边的内壁。

[0020] 优选地，所述的组织工程气管是由以下方法制备得到的：

[0021] a)将明胶和聚己内酯溶于三氟乙醇中，搅拌至完全溶解得到明胶/聚己内酯纺丝液，其中所述明胶、聚己内酯和三氟乙醇的比例为0.5g:0.5g:10ml；向所述明胶/聚己内酯纺丝液中加入乙酸，搅拌至溶液由浑浊变澄清，所述乙酸与明胶/聚己内酯纺丝液的比例为10μl:10ml；抽取澄清的明胶/聚己内酯纺丝液，固定在静电纺丝装置上，调整静电压为
10kv，接受距离为12cm，注射速率为2ml/h，进行电纺，采用铝箔为接受装置，纺丝，得到明胶/聚己内酯电纺膜，厚度为30μm，真空冷冻干燥消毒处理；

[0022] b)将耳廓软骨悬液接种于所述明胶/聚己内酯电纺膜上，其中接种比例为5.6×1011个/cm3；然后将接种后的明胶/聚己内酯电纺膜围绕权利要求1-7任一所述的气管支架包绕7层，将轴向缺口处的膜片沿轴向剪开后分别贴服于所述气管支架两边的内壁上。

[0023] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

[0024] 如上任一所述的气管支架、如上任一所述的组织工程气管在制备人工气管中的应用。

[0025] 本发明优点在于：

[0026] 1、本发明提出了一种新的气管狭窄手术方法——气管外支撑悬吊法，配合此方法发明了一种新的气管支架，其不会破坏气管粘膜上皮层及粘膜下结缔组织层，因此可有效避免传统手术方法的漏气、气道内出血及肉芽增生等问题，并且可以修复长段的均匀性的气管狭窄。

[0027] 2、本发明的气管支架形状设计合理，对于软骨细胞-生物可降解材料复合膜可起到良好的支撑作用，并在植入后形成新的C型软骨环，最终修复狭窄气管并使之具有可生长潜能。

[0028] 3、本发明的组织工程血管使用的软骨细胞-生物可降解材料复合膜种类恰当，细胞添加量和包覆厚度等因素合理，植入裸鼠体内能够形成力学性能好、弹性好且软骨组织生成情况优异的气管。

[0029] 本发明为临床治疗气管狭窄提供了一种全新的手术思路和治疗方式，给这些患儿带来了生的希望。

附图说明

[0030] 图1.外支撑悬吊法手术示意图。A：正常气管；B：狭窄气管；C：将狭窄段气管软骨环打断；D：将带接种有软骨细胞的生物可降解材料复合膜覆盖的气管支架(即组织工程气管)固定于狭窄段气管外，并将气管支架上下两端缝合固定于正常气管软骨环上；E：将狭窄段打断的气管软骨环缝合悬吊于支架气管上，从而将狭窄段气管扩开；F：气管支架逐步降解后，在气管支架的支撑环之间形成新的C形软骨环，实现狭窄气管的最终修复。

[0031] 图2.本发明的气管支架结构示意图。

[0032] 图3.本发明的组织工程气管结构示意图。

[0033] 图4.本发明的组织工程气管构建示意图。A：明胶/聚己内酯电纺膜；B：软骨细胞悬液；C：接种软骨细胞悬液后的明胶/聚己内酯电纺膜；D：细胞-电纺膜复合物；E：将细胞-电纺膜复合物覆盖粘附于本发明的气管支架外表面；G：覆盖有细胞-电纺膜复合物的气管支架；H：用手术剪将C型气管支架轴向缺口处的细胞-电纺膜复合物沿轴向方向剪开并粘附于气管支架两侧的内壁上；I：最终形成细胞-电纺膜-气管支架的组织工程气管。

[0034] 图5.利用聚己内酯(PCL)和聚左旋乳酸(PLLA)可降解生物材料分别制备的气管支架。

[0035] 图6.将软骨细胞接种后的明胶/聚己内酯电纺膜围绕气管支架包绕后构建成的组织工程气管。

[0036] 图7.组织工程气管植入裸鼠皮下4周后的外观形态。

[0037] 图8-图10.组织工程气管植入裸鼠皮下4周后的HE染色、番红O染色、甲苯胺蓝染色和二型胶原染色图片。

[0038] 图11.组织工程气管植入裸鼠皮下8周后的外观形态。

[0039] 图12-图14.组织工程气管植入裸鼠皮下8周后的HE染色、番红O染色、甲苯胺蓝染色和二型胶原染色图片。

具体实施方式

[0040] 以下结合附图对本发明的具体实施方式作详细说明。

[0041] 本申请发明人具备丰富的小儿心胸外科治疗经验，十分关注先天性气管狭窄这一小儿心胸外科临床棘手的问题，并在日常工作中善于总结，充分意识到端端吻合术和滑片吻合术的缺陷与不足，在充分的前期研究基础上，提出不破坏气管粘膜上皮层和粘膜下结缔组织层的前提下将狭窄段气管软骨环打断并将之悬吊于可降解的组织工程气管上的新术式，应用气管三维重建来设计气管支架并利用3D快速成型打印技术进行制备，最后结合组织工程技术使之具有软骨再生能力，制备得到组织工程气管。以上外支撑悬吊法手术示意图参见图1。

[0042] 本文中，附图中涉及的附图标记和组成部分如下所示：

[0043] 1.支撑环 2.支撑连杆

[0044] 3.轴向缺口 10.气管支架

[0045] 20.细胞-电纺膜复合物

[0046] 实施例1本发明的气管支架

[0047] 请参见图2，图2是本发明的气管支架结构示意图。所述的气管支架设有支撑环1和支撑连杆2。所述的支撑环1有若干个，每个支撑环1形状大小相同，为C型，各个支撑环1在轴向方向上等距平行排布，且各个支撑环1的两端端部由两根支撑连杆2分别串联连接，从而使得各个支撑环1和支撑连杆2固定成一体，形成侧壁带有轴向缺口3的镂空圆管状结构。

[0048] 本发明的气管支架的规格优选为：内径为5-10mm，外径为6-12mm，支撑环1的宽度为1-3mm，相邻支撑环1之间的间隙为1-4mm。最优选地，内径为7mm，外径为8mm，支撑环1的厚度为1mm，支撑环1的宽度为2mm，相邻支撑环1之间的间隙为2mm。以上规格为能普遍适用于临床需求的规格标准，另外可保证明胶/聚己内酯电纺膜的卷绕和软骨细胞的生长能够形成形状稳固、力学性能好的组织工程气管，为发明人长期经验总结，不应视为本领域常规技术手段。然而，本发明的支管支架的内外径、长度等均可以随着患者的具体情况进行改变，以适应患者气管个体化情况，以上改变均视为本发明的保护范围。

[0049] 需要说明的是，所述的支撑架1设计成C型，所述的“C型”包括与字母“C”相同或相似的形状、圆弧形和其他弧形等，其与人体正常气管软骨环的形状是相同或近似的。支撑架1设计成该形状，一方面能够有效衔接狭窄段气管的上下两端，充分模拟正常气管软骨环，利于气管功能恢复正常；另一方面该形状的支撑架1在逐步降解时，相邻支撑架1之间的间隙处则能够通过软骨细胞的增生形成与正常气管软骨形状相同或近似的新的气管软骨环，为气管的粘膜上皮层、粘膜下结缔组织层提供支撑，使得狭窄气管修复为正常气管。

[0050] 所述的支撑连杆2的作用是将各支撑架1固定成一整体，因此其数目并不局限于两个，也可以是一个或三个或三个以上，其位置也可以不设于各个支撑环1的两端端部，在各个支撑环1两端近端部的位置串联连接也是可以的。但是优选为本实施例的形状，其支撑和固定效果最为稳固，有利于形成C型的气管软骨环。本发明的气管支架优选使用生物可降解材料制成，因其是针对小儿，因此选用可降解的生物相容性好的生物材料，如PCL、PLLA、PLGA等，在植入一定时间后降解并于支撑架1间隙部位形成新的软骨环，提供新的支撑力。

[0051] 本发明的气管支架的生产可利用3D打印技术。

[0052] 实施例2本发明的组织工程气管

[0053] 请参见图3，图3是本发明的组织工程气管结构示意图。所述的组织工程气管设有气管支架10和细胞-电纺膜复合物20。所述的气管支架10如实施例1所述。所述的细胞-电纺膜复合物20为接种软骨细胞悬液的明胶/聚己内酯电纺膜。所述的细胞-电纺膜复合物20覆盖在气管支架10的外表面，且轴向的两端在气管支架10的轴向缺口3的位置向气管支架10的内部卷曲，包覆于气管支架10的内壁上。

[0054] 本发明的组织工程气管构建示意图可参见图4。

[0055] 实施例3本发明的组织工程气管的构建(一)

[0056] 1、方法

[0057] 1.1组织工程气管体外构建

[0058] 明胶/聚己内酯电纺膜的制备：用电子分析天平称取0.5g明胶和0.5g聚己内酯溶于10ml的三氟乙醇中，搅拌24h至完全溶解，得到浓度为10％(克/毫升)的明胶/聚己内酯纺丝液，向溶液中加入10μl乙酸，搅拌10-20min至溶液由浑浊变澄清。选用10ml的注射器，1.2mm内径的针头，抽取明胶/聚己内酯纺丝液，固定在静电纺丝装置上，调整静电压为
10kv，接受距离为12cm，注射速率为2ml/h，进行电纺，采用铝箔为接受装置，纺丝3h，得到明胶/聚己内酯电纺膜。接种细胞前剪裁成所需尺寸和形状，对其进行真空冷冻干燥消毒处理后使用。

[0059] 取猪耳廓软骨，消化后扩增软骨细胞，接种于制备的明胶/聚己内酯电纺膜上，明胶/聚己内酯电纺膜的尺寸为：长1.8cm、宽1cm、厚30μm左右，细胞接种浓度约为1×108个细胞/毫升，将0.3ml细胞悬液滴种于上述明胶/聚己内酯电纺膜。然后围绕气管支架包绕起来，共包绕7层，将轴向缺口处的膜片沿轴向方向剪开后分别贴服于气管支架两边的内壁上。然后准备进行动物皮下移植。

[0060] 1.2组织工程气管裸鼠皮下移植并成熟

[0061] 麻醉动物后，将上述体外构建好的组织工程气管移植到裸鼠皮下，使之成熟，分别于4周、8周后取材观察并进行鉴定。

[0062] 1.3组织工程气管鉴定

[0063] (1)HE染色

[0064] 将切片脱蜡水化后苏木素染色5分钟，冲洗后盐酸酒精分化数秒，自来水洗返蓝30分钟，伊红染色1分钟后乙醇脱水；二甲苯透明后中性树脂封片。

[0065] (2)番红O染色

[0066] 将切片脱蜡水化后番红染色1.5小时，自来水冲洗后逐级乙醇脱水；二甲苯透明后中性树脂封片。

[0067] (3)甲苯胺蓝染色

[0068] 将切片脱蜡水化后甲苯胺蓝染色10分钟，自来水冲洗后丙酮分化，逐级乙醇脱水；二甲苯透明后中性树脂封片。

[0069] (4)二型胶原染色

[0070] 将切片脱蜡水化后，抗原加热修复10分钟，过氧化氢10分钟，PBS洗3次，抗原封闭20分钟，一抗4度过夜，PBS洗3次，二抗室温孵育1.5小时，PBS洗3次，DAB显色5分钟，苏木素染色5分钟，自来水洗反蓝30分钟，逐级乙醇脱水；二甲苯透明后中性树脂封片。

[0071] 2、结果

[0072] 2.1气管支架的制备

[0073] 通过3D打印技术，利用聚己内酯(PCL)和聚左旋乳酸(PLLA)可降解生物材料分别制备出气管支架(如图5)。

[0074] 2.2组织工程气管体外构建

[0075] 将软骨细胞接种后的明胶/聚己内酯电纺膜围绕气管支架(PCL)包绕后构建成组织工程气管(如图6)。

[0076] 2.3组织工程气管体内成熟

[0077] 参见图7和图11，分别于第4周和第8周后从裸鼠体内取材，气管支架未见明显降解，取出的组织工程气管呈白色，具有弹性，气管支架的相邻支撑环之间的间隙中如预料的一样有软骨组织长入，从而形成了比较厚的软骨环，而支撑环的位置形成了比较薄的软骨组织。参见图8-图10、图12-图14，HE染色、番红O染色、甲苯胺蓝染色和二型胶原染色均显示形成了优异的软骨组织，部分支撑架材料依然存在，还没有完全降解。

[0078] 实施例4本发明的组织工程气管的构建(二)

[0079] 明胶/聚己内酯电纺膜的制备：用电子分析天平称取0.5g明胶和0.4g聚己内酯溶于12ml的三氟乙醇中，搅拌24h至完全溶解，得到浓度为7.5％(克/毫升)的明胶/聚己内酯纺丝液，向溶液中加入10μl乙酸，搅拌10-20min至溶液由浑浊变澄清。选用10ml的注射器，1.2mm内径的针头，抽取明胶/聚己内酯纺丝液，固定在静电纺丝装置上，调整静电压为
15kv，接受距离为10cm，注射速率为1.5ml/h，进行电纺，采用铝箔为接受装置，纺丝，得到明胶/聚己内酯电纺膜。接种细胞前剪裁成所需尺寸和形状，对其进行真空冷冻干燥消毒处理后使用。

[0080] 取猪耳廓软骨，消化后扩增软骨细胞，接种于制备的明胶/聚己内酯电纺膜上，明胶/聚己内酯电纺膜的尺寸为：长1.8cm、宽1cm、厚20μm左右，细胞接种浓度约为1×108个细胞/毫升，将0.3ml细胞悬液滴种于上述明胶/聚己内酯电纺膜。然后围绕气管支架包绕起来，共包绕6层，将轴向缺口处的膜片沿轴向方向剪开后分别贴服于气管支架两边的内壁上。

[0081] 实施例5本发明的组织工程气管的构建(三)

[0082] 明胶/聚己内酯电纺膜的制备：用电子分析天平称取0.5g明胶和0.6g聚己内酯溶于8ml的三氟乙醇中，搅拌24h至完全溶解，得到浓度为13.75％(克/毫升)的明胶/聚己内酯纺丝液，向溶液中加入10μl乙酸，搅拌10-20min至溶液由浑浊变澄清。选用10ml的注射器，1.2mm内径的针头，抽取明胶/聚己内酯纺丝液，固定在静电纺丝装置上，调整静电压为5kv，接受距离为15cm，注射速率为2.5ml/h，进行电纺，采用铝箔为接受装置，纺丝，得到明胶/聚己内酯电纺膜。接种细胞前剪裁成所需尺寸和形状，对其进行真空冷冻干燥消毒处理后使用。

[0083] 取猪耳廓软骨，消化后扩增软骨细胞，接种于制备的明胶/聚己内酯电纺膜上，明胶/聚己内酯电纺膜的尺寸为：长1.8cm、宽1cm、厚40μm左右，细胞接种浓度约为1×108个细胞/毫升，将0.3ml细胞悬液滴种于上述明胶/聚己内酯电纺膜。然后围绕气管支架包绕起来，共包绕9层，将轴向缺口处的膜片沿轴向方向剪开后分别贴服于气管支架两边的内壁上。

[0084] 对比例1

[0085] 明胶/聚己内酯电纺膜的制备：用电子分析天平称取0.5g明胶和0.4g聚己内酯溶于12ml的三氟乙醇中，搅拌24h至完全溶解，得到浓度为7.5％(克/毫升)的明胶/聚己内酯纺丝液，向溶液中加入10μl乙酸，搅拌10-20min至溶液由浑浊变澄清。选用10ml的注射器，1.2mm内径的针头，抽取明胶/聚己内酯纺丝液，固定在静电纺丝装置上，调整静电压为
15kv，接受距离为10cm，注射速率为1.5ml/h，进行电纺，采用铝箔为接受装置，纺丝，得到明胶/聚己内酯电纺膜。接种细胞前剪裁成所需尺寸和形状，对其进行真空冷冻干燥消毒处理后使用。

[0086] 取猪耳廓软骨，消化后扩增软骨细胞，接种于制备的明胶/聚己内酯电纺膜上，明胶/聚己内酯电纺膜的尺寸为：长1.8cm、宽1cm、厚15μm左右，细胞接种浓度约为1×108个细胞/毫升，将0.3ml细胞悬液滴种于上述明胶/聚己内酯电纺膜。然后围绕气管支架包绕起来，共包绕6层，将轴向缺口处的膜片沿轴向方向剪开后分别贴服于气管支架两边的内壁上。

[0087] 对比例2

[0088] 明胶/聚己内酯电纺膜的制备：用电子分析天平称取0.5g明胶和0.7g聚己内酯溶于8ml的三氟乙醇中，搅拌24h至完全溶解，得到浓度为18.75％(克/毫升)的明胶/聚己内酯纺丝液，向溶液中加入10μl乙酸，搅拌10-20min至溶液由浑浊变澄清。选用10ml的注射器，1.2mm内径的针头，抽取明胶/聚己内酯纺丝液，固定在静电纺丝装置上，调整静电压为5kv，接受距离为15cm，注射速率为2.5ml/h，进行电纺，采用铝箔为接受装置，纺丝，得到明胶/聚己内酯电纺膜。接种细胞前剪裁成所需尺寸和形状，对其进行真空冷冻干燥消毒处理后使用。

[0089] 取猪耳廓软骨，消化后扩增软骨细胞，接种于制备的明胶/聚己内酯电纺膜上，明胶/聚己内酯电纺膜的尺寸为：长1.8cm、宽1cm、厚40μm左右，细胞接种浓度约为1×108个细胞/毫升，将0.3ml细胞悬液滴种于上述明胶/聚己内酯电纺膜。然后围绕气管支架包绕起来，共包绕9层，将轴向缺口处的膜片沿轴向方向剪开后分别贴服于气管支架两边的内壁上。

[0090] 实施例6本发明方法制备的组织工程气管性能的综合评价

[0091] 分别按照实施例1、2、3和对比例1、2的方法制备组织工程气管，其中气管支架材料为PCL。移植裸鼠皮下4周、8周后取材观察，对组织气管弹性进行评分，总分1-10分，分数越高，表明弹性越好。然后制作切片，通过HE染色、番红O染色、甲苯胺蓝染色和二型胶原染色对软骨组织的形成情况进行评分，总分1-10分，分数越高，表明软骨组织形成情况越理想，越接近于人生理气管软骨环特征。

[0092] 每种方法做10个平行。组织学观察时针对每个组织工程气管制作大量切片，并随机挑取10张切片进行研究。然后计算各方法制得的组织工程气管弹性评分和软骨形成情况评分的平均值，结果用 表示，比较各组间评分差异，P<0.05认为差异有统计学意义。

[0093] 评分结果见表1。显著性差异分析结果表明，实施例1、2、3与对比例1、2的弹性评分分别比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)；实施例1、2、3与对比例1、2的软骨形成情况评分分别比较，差异也均具有统计学意义(P<0.05)。表明本发明方法制备的组织工程气管具备优异的弹性和软骨形成能力，具备将狭窄气管修复为正常气管的潜力。

[0094] 表1各实施例和对比例制备的组织工程气管性能评分

[0095]组别 弹性分数 软骨形成情况分数
实施例1 9.3±0.8 9.7±1.2
实施例2 7.9±0.7 8.7±0.9
实施例3 8.1±1.2 8.5±1.0
对比例1 4.6±0.8 5.4±0.6
对比例2 2.3±0.5 4.7±0.7

[0096] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。