一种去甲异波尔定壳聚糖微球及其制备方法

摘要

本发明属于壳聚糖微球的制备领域，具体涉及一种去甲异波尔定壳聚糖微球及其制备方法。具体包括以下步骤：1）先将去甲异波尔定溶于醋酸溶液，然后加入壳聚糖溶胀后超声脱气，配制成去甲异波尔定壳聚糖醋酸溶液；2）在圆底烧瓶中加入液体石蜡和乳化剂，搅拌下逐滴加入步骤1）制得的去甲异波尔定壳聚糖醋酸溶液，40℃下搅拌乳化0.5 h；3）逐滴加入交联剂，制得去甲异波尔定壳聚糖微球。将去甲异波尔定制备成壳聚糖微球，去甲异波尔定的包封率达69.27%，能提高去甲异波尔定在体内的生物利用度，减少临床给药频次，减少给药量，降低不良反应。此去甲异波尔定壳聚糖微球的制备方法操作简单，易重复，可控性好，具有很好的应用前景。

权利要求

1.一种去甲异波尔定壳聚糖微球的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）先将去甲异波尔定溶于醋酸溶液，然后加入壳聚糖溶胀后超声脱气，配制成去甲异波尔定壳聚糖醋酸溶液；醋酸溶液的体积分数为2%，去甲异波尔定壳聚糖醋酸溶液中壳聚糖的浓度为10 g/L，去甲异波尔定与壳聚糖的质量比为1:20-3:1；

2）在圆底烧瓶中加入液体石蜡和乳化剂，搅拌下逐滴加入步骤1）制得的去甲异波尔定壳聚糖醋酸溶液，40 ℃下搅拌乳化0.5 h；所述的乳化剂为Span-80，乳化剂用量为液体石蜡体积的4%；液体石蜡与去甲异波尔定壳聚糖醋酸溶液的体积比为8:1；

3）逐滴加入交联剂，升温至60℃后，反应5小时；然后用石油醚冲洗干净，离心分离弃去上清液，并于30 ℃干燥3 h得去甲异波尔定壳聚糖微球。

2.根据权利要求1所述的去甲异波尔定壳聚糖微球的制备方法，其特征在于：步骤2）中搅拌速度为1000-1500 r/min。

3.根据权利要求1所述的去甲异波尔定壳聚糖微球的制备方法，其特征在于：步骤3）中所述的交联剂为50%戊二醛，交联剂与去甲异波尔定壳聚糖醋酸溶液的体积比为1:60。

4.一种如权利要求1-3任一项所述的制备方法制得的去甲异波尔定壳聚糖微球，其特征在于：去甲异波尔定的包封率69.27%。

说明书

一种去甲异波尔定壳聚糖微球及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于壳聚糖微球的制备领域，具体涉及一种去甲异波尔定壳聚糖微球及其制备方法。

背景技术

[0002] 去甲异波尔定是从樟科山胡椒属植物乌药Lindera aggregate  (Sims) Kosterm.的干燥块根中分离得到，含量高达1%。近年来对乌药的抗炎镇痛的研究发现，乌药总生物碱能够显著抑制佐剂性关节炎大鼠继发性足肿胀，对原发性足肿胀也有抑制趋势。同时乌药总生物碱还能够减轻小鼠胶原关节炎的严重程度，减少血清中抗胶原抗体，保护骨关节的损坏，其作用机制是通过阻止脂多糖诱导的RAW264.7细胞的NF-κB激活和MAPKs磷酸化而发挥作用。而去甲异波尔定作为乌药总碱中的主要活性成分（在乌药总碱中的含量为37.8%），具有与乌药总碱相似的药理作用。去甲异波尔定通过下调MAPKs信号通路的活性抑制巨噬细胞的活化和致炎因子的释放，从而显著减少RAW264.7巨噬细胞释放一氧化氮、肿瘤坏死因子和白细胞介素-1β。但药动学研究表明，去甲异波尔定的生物利用度仅有2.7%，而代谢产物去甲异波尔定-9-O-α-葡萄醛酸苷的血药浓度大大高于其原型药物，且在体内停留时间也超过原形药。去甲异波尔定的动物实验表明能够显著减少关节炎小鼠（CIA）的疾病严重程度，保护关节受损，减少血清中抗胶原蛋白抗体的含量等，药理作用明确且毒副作用小，但由于其自身微溶于水，体内代谢迅速、血药浓度生物利用度低等极大地限制了它在临床上的应用。

[0003] 因此如何通过改变剂型来提高去甲异波尔定的生物利用度，减少代谢作用，提高去甲异波尔定的应用价值成了目前的主要问题。

[0004] 壳聚糖作为一种资源丰富的天然高分子化合物，因其不仅具有良好的生物相容性、生物黏附性、低毒性、易降解吸收，而且还具有消炎、抗菌、止血、抑制癌细胞转移等大多数聚合物所不具有的功能，成为了药物控释剂的新热点。壳聚糖中大量的-OH和-NH2，使其具有较强的吸附性，易进行化学修饰。通过醛氨缩合反应可以使壳聚糖形成网状聚合物，从而降低氨基被质子化的几率，防止壳聚糖使用时的损耗及流失，提高其应用特性，因此壳聚糖常用于制备微球。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于针对去甲异波尔定的生物利用度低的问题，提供一种去甲异波尔定壳聚糖微球及其制备方法。将去甲异波尔定制成壳聚糖微球，能显著提高去甲异波尔定的生物利用度、改善口服吸收、延长药物释放时间，为去甲异波尔定新剂型的研究和开发提供了新的思路。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0007] 一种去甲异波尔定壳聚糖微球的制备方法，包括以下步骤：

[0008] 1）先将去甲异波尔定溶于醋酸溶液，然后加入壳聚糖溶胀后超声脱气，配制成去甲异波尔定壳聚糖醋酸溶液；

[0009] 2）在圆底烧瓶中加入液体石蜡和乳化剂，搅拌下逐滴加入步骤1）制得的去甲异波尔定壳聚糖醋酸溶液，40 ℃下搅拌乳化0.5 h；

[0010] 3）逐滴加入交联剂，升温至60℃后，反应5小时；然后用石油醚冲洗干净，离心分离弃去上清液，并于30 ℃干燥3 h得去甲异波尔定壳聚糖微球。

[0011] 步骤1）中醋酸溶液的体积分数为2%，去甲异波尔定壳聚糖醋酸溶液中壳聚糖的浓度为10 g/L，去甲异波尔定与壳聚糖的质量比为1:20-3:1。

[0012] 步骤2）所述的乳化剂为Span-80，乳化剂用量为液体石蜡体积的4%。

[0013] 步骤2）中液体石蜡与去甲异波尔定壳聚糖醋酸溶液的体积比为8:1。

[0014] 步骤2）中搅拌速度为1000-1500 r/min。

[0015] 步骤3）中所述的交联剂为50%戊二醛，交联剂与去甲异波尔定壳聚糖醋酸溶液的体积比为1:60。

[0016] 一种如上所述的制备方法制得的去甲异波尔定壳聚糖微球，当采用以上最优参数时，去甲异波尔定的包封率达到69.27%。

[0017] 包封率的计算

[0018] 微球包封率是指被包裹物质（如去甲异波尔定）在微球中占药物总量的百分量。本文包封率按照以下公式计算：

[0019] 包封率=微球中药物含量/投入的药物总量×100%；

[0020] 微球中药物含量=供试品峰面积/对照品峰面积×对照品浓度×容量瓶体积。

[0021] 本发明的有益效果在于：

[0022] 1）去甲异波尔定是乌药中的一种异喹啉生物碱，将其制成壳聚糖微球，克服了去甲异波尔定在水溶液中的难溶性问题，增加去甲异波尔定的吸收，提高其生物利用度，为进一步新药开发奠定重要基础；

[0023] 2）本发明通过对去甲异波尔定壳聚糖微球的制备工艺进行优化，所测得的去甲异波尔定的包封率69.27%，比优化前的处方制备的微球的包封率提高了27.97%；

[0024] 3）本发明将去甲异波尔定制成壳聚糖微球，极大提高了去甲异波尔定的生物利用度，延长了药物释放时间，减少临床给药频次，减少给药量，降低不良反应。此去甲异波尔定壳聚糖微球的制备方法操作简单，易重复，可控性好，具有很好的应用前景。

附图说明

[0025] 图1实施例1制得的去甲异波尔定壳聚糖微球的电镜图；A为0.25mg/mL的微球电镜图；B为0.5mg/mL的微球电镜图；C为1.0mg/mL的微球电镜图；

[0026] 图2 A为实施例1制得的去甲异波尔定壳聚糖微球的液相色谱图；B为对照品的液相色谱图。

具体实施方式

[0027] 本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

[0028] 实施例1

[0029] 实验原料：

[0030] 去甲异波尔定（由上海中药标准化研究中心提供，纯度＞98%）；壳聚糖（上海伯奥生物科技有限公司，批号130204，脱乙酰度≥90.0%，粘度＜100cps）；乙腈、甲酸（默克公司，色谱纯）；乙酸（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；液体石蜡（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）、乙酸乙酯、石油醚（天津恒兴化学试剂制造有限公司，分析纯）；司盘-80、吐温-20、吐温-80（国药集团化学试剂有限公司，化学纯）；戊二醛（阿拉丁工业公司，质量分数为
50%，化学纯）；水为超纯水。

[0031] 主要仪器：

[0032] 美国Waters Alliance高效液相色谱仪；Waters 2998 PAD检测器；HITACH公司H7650型透射电镜（TEM）；SIS公司400万像素CCD；DF-101S集热式磁力搅拌器（杭州明远仪器有限公司）；纳米粒度仪（NICOMPTM 380ZLS Zeta potential/particle sizer）；BSA系列十万分之一分析天平（德国塞多利斯科学仪器有限公司）；Milli-Q超纯水仪（Millipore，Bedford，MA，USA）。

[0033] 微球的制备：

[0034] 1）先将去甲异波尔定溶于体积分数为2%的醋酸溶液中，然后加入壳聚糖溶胀后超声脱气，配制成去甲异波尔定壳聚糖醋酸溶液；其中壳聚糖的浓度为10g/L；

[0035] 2）在50mL圆底烧瓶中加入24mL液体石蜡，乳化剂0.96mL，搅拌下逐滴加入去甲异波尔定壳聚糖醋酸溶液3mL，40℃下搅拌乳化0.5 h；

[0036] 3）逐滴加入交联剂50%戊二醛0.05 mL，升温至60℃后，继续反应5h后；用石油醚反复冲洗干净，离心分离弃去上清液，并于30 ℃干燥3 h得去甲异波尔定壳聚糖微球。

[0037] 对照品制备

[0038] 精密称取去甲异波尔定对照品8.42 mg，用甲醇-稀盐酸（0.5%，v/v）的混合液（2:1）溶解后，定量转移至10 mL的容量瓶中，并用甲醇-稀盐酸（0.5%，v/v）的混合液（2:1）定容，过0.22 μm微孔滤膜，得到0.842 mg·mL-1的对照品储备液。

[0039] 供试品制备

[0040] 将壳聚糖微球研细，精确称取一定量加入到50 mL圆底烧瓶中，加入甲醇-稀盐酸（0.5%，v/v）的混合液（2:1）30 mL，超声30 min，90 ℃水浴回流4 h，冷却转移至50 mL容量瓶，并用甲醇-稀盐酸（0.5%，v/v）的混合液（2:1）定容，摇匀，静置，取上清液过0.22 μm微孔滤膜即得。

[0041] 为了使微球的包封率达到最佳，本发明对各条件参数进行了优化研究。

[0042] 1、醋酸浓度的优化

[0043] 用体积分数分别为1%，2%，3%的醋酸溶液制得质量浓度为10 g/L的壳聚糖醋酸溶液，其他条件不变，进行未载药微球的制备，由表1可见，2%醋酸浓度制备的壳聚糖微球粒径分散度为0.457，分布最均匀，且经纳米粒径仪测量发现，2%醋酸溶液得到的微球形态良好，大小适中，分散均匀；因此，选用2%醋酸浓度来制备微球。

[0044] 表1 不同的醋酸浓度制得的壳聚糖微球对比表

[0045]

[0046] 2、壳聚糖醋酸浓度的优化

[0047] 使用体积分数2%的醋酸水溶液来配制质量浓度分别为5 g/L，10 g/L，15 g/L的壳聚糖醋酸溶液，其他条件不变，制备未载药壳聚糖微球；经纳米粒径仪测量发现，10 g/L的壳聚糖醋酸溶液制备的微球形态良好，大小适中，分散均匀；由表2可知，当壳聚糖醋酸浓度为5 g/L时，制得的微球粒径偏小，且分散也不够均匀；可能是由于壳聚糖醋酸浓度太稀，导致微球在搅拌时粘度不够，易被打散，导致分散不均，大小不一且得到的微球数量也很少；而当壳聚糖醋酸浓度为15 g/L时，浓度太大，微球在搅拌过程中易结节，而实验得到的微球也是基本结块的，所以粒径偏大且分散度极大；而当壳聚糖醋酸浓度为10 g/L时，微球大小最适合，且分散均匀数量合适；因此，选用壳聚糖醋酸浓度为10 g/L来制备微球。

[0048] 表2 不同的壳聚糖醋酸浓度制得的壳聚糖微球对比表

[0049]

[0050] 3、乳化剂的选择

[0051] 微球制备采用乳化交联法，乳化剂的作用是降低微球表面的表面张力，使微球在搅拌过程中能维持良好的球体形态，不互相粘连也不破裂分散；实验以空白微球形态考察不同乳化剂对壳聚糖微球成球特性的影响；分别以适量的吐温-20、吐温-80、Span-80为乳化剂，其他条件不变，制备空白壳聚糖微球；实验结果表明，只有以Span-80为乳化剂制备的微球才能形成球形（见表3）；由实验得知，吐温-20、吐温-80为乳化剂制得的微球无法成球形，而是成为糊状物质。这是由于上述两种乳化剂的亲水亲油平衡值（HLB值）较高，无法降低水相与有机相的表面张力，因此微球在制作过程中由于搅拌而破裂；而Span-80的HLB值较低，可以很好的降低水相与有机相的表面张力，因此微球在制作过程中很好的维持了形态。故选用Span-80来作为乳化剂所制得的微球形态较好，大小适中，分散均匀。

[0052] 表3 不同乳化剂制得的壳聚糖微球对比表

[0053]

[0054] 4、Span-80乳化剂用量的优化

[0055] 固定液体石蜡的体积为24 mL，乳化剂的用量分别按照液体石蜡体积的2%，4%，6%，其他条件保持不变，制备壳聚糖微球，经纳米粒径仪测量发现，乳化剂用量为液体石蜡的4%时，微球形态良好，大小适中，分散均匀；由表4可以看出，当Span-80体积分数为2%时，主要对微球稳定性发生影响，而对粒径产生的影响不大；此时的微球虽能维持形态，但是分散不均匀；而当Span-80体积分数逐渐增大时，乳化剂可以充分的包围微球表面，大大的降低其表面张力，微球分散的越来越均匀；但是当乳化剂加入过量时，由于表面活性张力越来越低，导致微球被分割得越来越小，形成的微球数量变多粒径变小且分散不是很均匀。因此，以Span-80体积分数为4%来制备壳聚糖微球最佳。

[0056] 表4 不同Span-80体积分数制备的壳聚糖微球对比表

[0057]

[0058] 5、油水比的优化

[0059] 油相与水相的比例以及油相的粘度，是影响乳液稳定性的重要因素。以液体石蜡为油相，10 g/L的壳聚糖醋酸溶液为水相，其他条件保持不变，分别按照油水比6:1，8:1和10:1来制备壳聚糖微球。经纳米粒径仪测量发现，油水比为8：1时的壳聚糖微球形态良好，大小适中，分散均匀；由表5可见，当油水比为8:1时，分散最均匀，大小最适合；对于油包水的乳剂，提高油相水相体积比，使得水相的微球能够被较厚的油相分隔开来，并且降低了水相微球在搅拌过程中碰撞粘连的几率。而降低油水比，会加大微球碰撞粘连的几率，使得微球结块，分散不均。而当油水比过大时，包裹水相的油相层太厚，也会导致微球分散不均匀。
因此，选用油水比为8:1来制备壳聚糖微球。

[0060] 表5 不同油水比制备的壳聚糖微球对比表

[0061]

[0062] 6、交联密度的优化

[0063] 用50%戊二醛与壳聚糖之比表示交联密度；分别取0.25 mL、0.5 mL、0.75 mL的50%戊二醛溶液，10 g/L的壳聚糖溶液3 mL，其他条件不变，这样交联密度的比例分别为1:120，1:60，1:40，依次制备壳聚糖微球。经纳米粒径仪测量发现，当交联密度比例为1:60时，微球形态良好，大小适中，分散均匀；由表6可见，交联剂的用量对微球的形态有重大关系；当交联剂用量较少时，微球由于交联不充分而有少量粘连与变形，但表面光滑；随着交联剂的量增大，微球粘连现象越来越少，但是表面的光滑度降低，甚至出现凹陷褶皱现象；若交联剂的量继续增加，微球会出现大量粘连现象；因此，选用交联密度为1:60来制备壳聚糖微球。

[0064] 表6 不同交联密度制备的壳聚糖微球对比表

[0065]

[0066] 7、交联反应时间的影响

[0067] 交联反应时间也是微球形成的重要因素；按交联时间分别为0、1、3、5、7h，其他条件不变，依次制备壳聚糖微球；由表7可知，交联反应时间为5小时最合适；若交联反应时间太短，则微球无法充分交联，会导致微球不成形或粘连变形，包封率降低。

[0068] 表7 不同交联反应时间制备的壳聚糖微球对比表

[0069]

[0070] 8、交联反应温度的影响

[0071] 交联温度分别为25℃，40℃，60℃，80℃，其他条件不变，来制备壳聚糖微球；经观察发现，25℃反应体系基本无法产生微球；40℃反应5 h时微球才基本成型；60℃反应3 h体系就产生大量微球，随着温度升高，反应速率变快，从而缩短交联时间；但加热温度过高时，壳聚糖变性和芯材的快速析出使微胶囊形态恶化，使微球稳定性变差且无法成型；综上所述，交联温度过低或过高都不利于微球的成形和有机溶剂的交联，因此，制备微球的理想温度为60℃。

[0072] 9、搅拌转速的影响

[0073] 搅拌速度分为3种，低速、中速、高速转动。转速过慢，制备微球的过程中贴壁严重，且易出现粘连、结块的现象，微球成球形不好，粒径大小不一，分散不均匀；转速过快，生成的剪切力过大，易形成粒径过小的微球；因此，选择中速转动来制备微球，实验操作时，一般选择转速为1000-1500 r/min为宜。

[0074] 对实施例1制得的微球进行电镜观察和色谱检测

[0075] 纯净水稀释样品液100倍；用喷镀有碳膜的铜网，倒扣在样品液滴上2 min，吸干液滴；再用2% PTA（磷钨酸）染色液负染色1 min，吸干染色液；在HITACH公司H7650型透射电镜（TEM）80 KV下观察、SIS公司400万像素CCD摄影；结果如图1所示；

[0076] 色谱柱：Thermo Scientific Syncronis C18色谱柱（250×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-1‰甲酸水溶液=20：80；检测波长为280 nm；流速为0.8 mL·min-1；柱温为30 ℃，进样量为10 μL；结果如图2所示。

[0077] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。