一种降血压肽微球的制备方法

摘要

一种降血压肽微球的制备方法，涉及降血压肽。1)将VLPVP溶解在SAL溶液中作为水相，油相为液体石蜡和石油醚混合物，所述混合物中含乳化剂，将烘干的SPG膜放入油相中超声，安装到SPG膜乳化器中，在氮气压力下水相通过SPG膜进入油相中，得SAL乳状液；2)将CaCl2溶液与步骤1)中的油相混合，超声后得乳状液，再与步骤1)所得SAL乳状液混合，即得乳白色乳状液，离心后，除去上清液，离心清洗，再除去上清液后，得到海藻酸钠‑钙微球，抽滤清洗，除去微球表面的有机溶剂，然后将微球分散到O‑CMC溶液中，得到负载VLPVP的O‑CMC‑SAL微球，再抽滤，除去表面残留的O‑CMC，干燥后即得降血压肽微球。

权利要求

1.一种降血压肽微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将VLPVP溶解在SAL溶液中作为水相，油相为液体石蜡和石油醚混合物，所述混合物中含乳化剂，将烘干的SPG膜放入油相中超声，安装到SPG膜乳化器中，在氮气压力下水相通过SPG膜进入油相中，得SAL乳状液；

2)将CaCl2溶液与步骤1)中的油相混合，超声后得乳状液，再与步骤1)所得SAL乳状液混合，即得乳白色乳状液，离心后，除去上清液，离心清洗，再除去上清液后，得到海藻酸钠-钙微球，抽滤清洗，除去微球表面的有机溶剂，然后将微球分散到O-CMC溶液中，得到负载VLPVP的O-CMC-SAL微球，再抽滤，除去表面残留的O-CMC，干燥后即得降血压肽微球。

2.如权利要求1所述一种降血压肽微球的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述SAL溶液采用体积百分比为1.5％，pH为4.2的SAL溶液。

3.如权利要求1所述一种降血压肽微球的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述VLPVP与SAL溶液的配比为100mg∶50mL，其中，VLPVP以质量计算，SAL溶液以体积计算。

4.如权利要求1所述一种降血压肽微球的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述液体石蜡和石油醚的体积比为7∶5；所述乳化剂采用PO-500乳化剂，所述乳化剂的含量按质量百分比为液体石蜡和石油醚混合物的4％。

5.如权利要求1所述一种降血压肽微球的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述超声的时间为30min；所述SPG膜的孔径为20μm；所制得的SAL乳状液为W/O型SAL乳状液，在SAL乳状液中水相与油相的体积比为1∶10。

6.如权利要求1所述一种降血压肽微球的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述CaCl2溶液采用体积百分比为2％，pH为6的CaCl2溶液。

7.如权利要求1所述一种降血压肽微球的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述CaCl2溶液与油相的体积比为1∶1。

8.如权利要求1所述一种降血压肽微球的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述离心清洗采用石油醚离心清洗2次，离心的条件为8000rmp下离心5min，20℃。

9.如权利要求1所述一种降血压肽微球的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述抽滤清洗采用去离子水抽滤清洗；所述O-CMC溶液的体积百分比浓度为0.5％。

10.如权利要求1所述一种降血压肽微球的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述再抽滤采用去离子水抽滤；所述干燥采用真空冷冻干燥24h。

说明书

一种降血压肽微球的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及降血压肽，尤其是涉及一种降血压肽微球的制备方法。

背景技术

[0002] 血管紧张素转化酶抑制肽(ACEIP)又称为降血压肽，是由蛋白酶水解动植物蛋白质而获得的一类具有血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性和降血压作用的小肽。与现有的ACE抑制剂类降压药物如卡托普利等相比，ACEIP效果温和、无副作用、对正常血压无影响，而且可通过日常饮食摄入，因此是一类理想的天然降血压物质，已受到国内外学者的广泛关注。VLPVP是一种基因工程方法制备的降血压肽,体外实验表明，该多肽对ACE都有很强的抑制作用，其IC50分别为1.8μmol/L。通过研究VLPVP对自发性高血压大鼠(SHR)的降压效果，结果表明，该降血压肽具有良好的体内降血压效果，但对血压正常的大鼠无降血压作用，因此具有良好的实际应用前景。然而，大量研究表明，当ACEIP以口服形式摄入时，极易被胃肠道蛋白酶降解进而失去体内降压活性，因此ACEIP的体内稳定性和降压活性已经成为一个制约ACEIP产业化的关键问题。

[0003] 水凝胶体系也是目前提高蛋白质以及多肽类药物体内稳定性以及实现肠道靶向释放的重要方法。水凝胶是一类具有亲水基团，能被水溶胀但不溶于水的具有三维网络结构的聚合物，能够感知外界刺激的微小变化，如温度、pH值、离子强度、电场、磁场等，通过体积的溶胀或收缩对刺激做出敏感性的相应。水凝胶的这一特点使它在生物医学领域、生物酶的固定等方面有广泛的应用前景。目前在蛋白质和多肽靶向输送中应用得最多的是pH敏感性水凝胶。壳聚糖-海藻酸钠水凝胶体系已被广泛用于蛋白质和多肽类药物的肠道靶向释放。

[0004] SPG膜乳化法主要用于制备尺寸均一的乳液、乳珠、微球、微胶囊等，可用于制备W/O、O/W、W/O/W、O/W/O不同乳液，实现乳液的尺寸均一性和可控性、微球表面功能的可控性和稳定性、多孔微球结构的可控性和稳定性；实现均一乳液大规模制备的可行性；多孔微球或缓释胶囊粒径的可控性等。SPG膜乳化法制备的微球，粒径范围为2～100μm，在各个领域都有广泛应用，在生物工程领域可以作为活性物质的分离介质，在药学领域可以作为控制药物释放的载体，在摄影领域可以作为固液态的调色剂等等。其中药学和食品是膜乳化应用最广泛的领域，通过不同的制备方式将水溶性的抗癌药物包埋制备成微球或微囊，提高生物利用率，均一的乳液还可以有效保持食品风味和良好口感，掩盖住个别食品的刺激性气味等。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种降血压肽微球的制备方法。

[0006] 本发明包括以下步骤：

[0007] 1)将VLPVP溶解在SAL溶液中作为水相，油相为液体石蜡和石油醚混合物，所述混合物中含乳化剂，将烘干的SPG膜放入油相中超声，安装到SPG膜乳化器中，在氮气压力下水相通过SPG膜进入油相中，得SAL乳状液；

[0008] 2)将CaCl2溶液与步骤1)中的油相混合，超声后得乳状液，再与步骤1)所得SAL乳状液混合，即得乳白色乳状液，离心后，除去上清液，离心清洗，再除去上清液后，得到海藻酸钠-钙微球，抽滤清洗，除去微球表面的有机溶剂，然后将微球分散到O-CMC溶液中，得到负载VLPVP的O-CMC-SAL微球，再抽滤，除去表面残留的O-CMC，干燥后即得降血压肽微球。

[0009] 在步骤1)中，所述SAL溶液可采用体积百分比为1.5％，pH为4.2的SAL溶液；所述VLPVP与SAL溶液的配比可为100mg∶50mL，其中，VLPVP以质量计算，SAL溶液以体积计算；所述液体石蜡和石油醚的体积比可为7∶5；所述乳化剂可采用PO-500乳化剂，所述乳化剂的含量按质量百分比可为液体石蜡和石油醚混合物的4％；所述超声的时间可为30min；所述SPG膜的孔径可为20μm；所制得的SAL乳状液为W/O型SAL乳状液，在SAL乳状液中水相与油相的体积比可为1∶10。

[0010] 在步骤2)中，所述CaCl2溶液可采用体积百分比为2％，pH为6的CaCl2溶液；所述CaCl2溶液与油相的体积比可为1∶1；所述搅拌的条件可为300rmp下搅拌5h；所述离心清洗可采用石油醚离心清洗2次，离心的条件可为8000rmp下离心5min，20℃；所述抽滤清洗可采用去离子水抽滤清洗；所述O-CMC溶液的体积百分比浓度可为0.5％；所述再抽滤可采用去离子水抽滤；所述干燥可采用真空冷冻干燥24h。

[0011] 本发明以海藻酸钠(sodium alginate,SAL)和羧甲基壳聚糖(O-carboxymethyl chitosan,O-CMC)为壁材，以CaCl2为交联剂,采用SPG膜乳化法制备VLPVP微球，确定SPG膜乳化法制备微球的最佳工艺，并检测了该微球在模拟胃肠液的释放效果。本发明利用SPG膜乳化法得到的VLPVP微球具有良好的pH敏感性，而且粒径分布均匀，并且可以较好的保持VLPVP的活性，因此在pH敏感性传输体系的构建中具有重要意义。

附图说明

[0012] 图1为VLPVP微球形态。

[0013] 图2为VLPVP微球扫描电镜图。标尺为10μm。

具体实施方式

[0014] 以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

[0015] 1.降血压肽微球的制备

[0016] 在室温(20℃)下，准确称取一定量的VLPVP，使其充分溶解在1.5％(v/w)pH4.2的SAL溶液中作为水相，使VLPVP的最佳投药量为100mg/50mL SAL溶液；油相为液体石蜡和石油醚7∶5(v/v)混合物，其中含4％(w/w)的PO-500乳化剂。将烘干的SPG膜放入油相中超声30min，安装到SPG膜乳化器中。在氮气压力下50mL水相通过孔径20μm的SPG膜，进入到500mL油相中，形成W/O型SAL乳状液(水油体积比为1∶10)。

[0017] 将50mL 2％(v/w)的pH＝6的CaCl2溶液与50mL上述的油相混合，搅拌超声后形成均一乳状液，再与SAL乳状液混合，为了保证形成均一的水凝胶微球，混合过程一定要缓慢进行。混合后300rmp搅拌5h，形成均一的乳白色乳状液，倒入离心管中离心后，除去上清液，再用石油醚离心清洗2次(8000rmp，5min，20℃)，除去上清液后，得到海藻酸钠-钙微球，用去离子水抽滤清洗，除去微球表面的有机溶剂；然后将微球分散到50mL 0.5％(v/w)的O-CMC溶液中，300rmp搅拌1h，制备得到负载VLPVP的O-CMC-SAL微球，得到的微球用去离子水抽滤，除去表面残留的O-CMC，真空冷冻干燥24h，得到VLPVP微球。

[0018] 2. VLPVP微球包埋率的测定

[0019] 2.1 VLPVP标准曲线的绘制

[0020] 用高效液相色谱法绘制VLPVP标准曲线，具体步骤如下：准确称取VLPVP标准品适量，加入去离子水溶解成质量浓度为500mg/L的标准储备液，再按一定的比例稀释成25μg/L、125μg/L、250μg/L、375μg/L、500μg/L和625μg/L浓度的溶液，经0.22μm的滤膜过滤后，进样测定。色谱条件为：Eclipse XDB-C18反相色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相乙腈：水＝17:83，其中水相中含有0.05％三氟乙酸(TFA)，超声脱气15min，进样流速为1.0mL/min，柱温保持30℃，检测波长为199nm，进样量为20μL。以VLPVP标准溶液的浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标作线性回归方程，绘制VLPVP标准曲线。

[0021] 2.2微球表面VLPVP含量的测定

[0022] 称取一定质量的冻干微球，加入1mL去离子水，离心1min，小心吸取上清液20μL，稀释10倍，经0.22μm滤膜过滤，取20μL进样，根据2.1中得到的VLPVP标准曲线计算微球表面的VLPVP含量，记为N。

[0023] 2.3微球VLPVP总含量的测定

[0024] pH7.4缓冲液的配制：准确量取81mL 0.2mol/L Na2HPO4溶液和19mL 0.2mol/L NaH2PO4溶液混合，定容到1000mL，配制0.02mol/L的pH7.4磷酸缓冲液。

[0025] 称取一定质量的冻干微球，加入1mL pH7.4的磷酸缓冲液，超声30min后使微球溶胀破裂，离心1min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤后，取20μL进样，根据2.1中得到的VLPVP标准曲线计算微球中VLPVP总含量，记为WB。

[0026] 2.4 VLPVP包埋率的测定

[0027] 微球中VLPVP的包埋率按如下公式计算：

[0028]

[0029] 式中：N-微球表面VLPVP含量；

[0030] WB-微球VLPVP总含量。

[0031] 2.5 VLPVP微球载药量的测定

[0032] VLPVP微球载药量按如下公式计算：

[0033]

[0034] 式中：WB-微球VLPVP总含量；

[0035] m-微球干重，5mg。

[0036] 3.微球粒径分析

[0037] 采用激光粒度分析仪对使用不同孔径的SPG膜制得的微球粒径分布进行分析。平均粒径大小用MV表示，粒径分布用跨距(Span值)表示。

[0038] 4.微球超微结构观察

[0039] 采用扫描电子显微镜(SEM)观察微球的表面形态，样品制备方法如下：取一层双面胶，分别将微球轻轻撒在上面并吹去多余的粉末，将双面胶贴在样品台上，然后在样品上喷金供SEM观察，电压为15kV，观察时间要求尽可能短，以避免电子束长时间照射引起电子损伤。

[0040] 5. VLPVP微球体外模拟胃肠液实验

[0041] 分别用纱布将一定质量利用20μm SPG膜制备的VLPVP微球、微胶囊造粒仪微球和针管挤压微球包好，先放入50mL 37℃的pH1.2模拟胃液中，2h后将微球取出并擦干纱布和微球表面的水分，再转入50mL 37℃的pH6.8的模拟肠液中，每隔0.5h取样，用HPLC法测模拟胃肠液中的VLPVP峰面积，根据2.2.1中VLPVP标准曲线计算VLPVP浓度(c)，进而计算出微球在体外模拟胃肠液中的释放率，分析VLPVP微球在模拟胃肠液中的释放情况。

[0042] 微球的体外模拟释放率按下式计算：

[0043]

[0044] 式中：c-模拟胃肠液中VLPVP浓度(μg/mL)；

[0045] V-模拟胃肠液体积，50mL；

[0046] m-微球质量(mg)。

[0047] 实验结果：

[0048] 制备的VLPVP微球经冷冻干燥后为白色粉末(图1)，电镜下观察为圆球形颗粒(图2)，平均粒径为43.8μm，该微球的包埋率和载药量分别为85.3％和7.8％。

[0049] VLPVP微球体外模拟胃肠液释放结果。SPG膜乳化法制备的VLPVP微球在模拟胃液中浸泡2h后的释放率仅为9.59％，当将微球转移至模拟肠液中后，VLPVP的释放率则随着浸泡时间的延长而持续增加，在5h时VLPVP的累积释放率为87.63％。因此，利用SPG膜乳化法制备的微球在模拟胃液中具有很好的稳定性，而且在模拟肠液中可以实现药物的持续释放，因此适合于作用pH敏感性肠道靶向输送载体。