一株高产厚垣孢子的绿色木霉及其应用

摘要

本发明公开了一株高产厚垣孢子的绿色木霉及其应用。该菌株为绿色木霉(Trichoderma viride)菌株TW12，保藏编号为CGMCC No.11048。发明还提供了一种含有所述绿色木霉菌株TW12的生物防治制剂及其制备方法。实验表明，本发明的绿色木霉菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、厚垣孢子产生率大，抗逆性强，在黄瓜、柑橘叶片能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该绿色木霉菌株TW12制备的生物防治制剂，可以作为防治黄瓜病害的生物农药或生物肥料，防治多种黄瓜灰霉病、黄瓜菌核病和柑橘炭疽病等。

权利要求

1.一株高产厚垣孢子的绿色木霉（Trichoderma viride）菌株TW12，所述菌株的保藏编号为CGMCC No. 11048。

2.权利要求1所述的绿色木霉菌株TW12在防治黄瓜灰霉病中的用途。

3.一种含有权利要求1所述的绿色木霉菌株TW12的生物防治制剂。

4.权利要求3所述的生物防治制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：（1）制备绿色木霉菌株TW12的种子液；

（2）将步骤（1）制备的种子液接种到固体培养基中，28-30℃下恒温培养3 5 d；

~

（3）将步骤（2）培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28-30℃、相对湿度85%以上的发酵室中进行发酵培养；

其中，步骤（2）中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶液的质量比为1：1.8；所述固料由质量比为60：10：30的木粉、玉米粉和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液的组分及含量为：3.5%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，0.5%硫酸钙，4%硫酸铵，

0.05%氯霉素，1.3%轻质碳酸钙，剩余为水；

步骤（3）中的大量发酵培养基同固体培养基。

5.如权利要求4所述的生物防治制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：（1）将绿色木霉菌株TW12的孢子移植到PDB液体培养基中，28-30℃摇床振荡培养2 3 d~得到种子液；PDB液体培养基为：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1000 mL；

（2）将步骤（1）制备的种子液按质量比15%的比例接种到固体培养基中，28-30℃下振荡培养3 5 d，期间维持相对湿度85%以上；

~

（3）将步骤（2）培养的培养物加入无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至大量发酵培养基，室温28-30℃、相对湿度85%以上的发酵室中发酵培养8 9 d。

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6.权利要求3所述的生物防治制剂在防治黄瓜灰霉病中的用途。

说明书

一株高产厚垣孢子的绿色木霉及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物防治植物病害领域。具体而言，本发明涉及一种高产厚垣孢子的绿色木霉菌株及其应用。

背景技术

[0002] 木霉(Trichoderma spp.)，属于半知菌类的丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科，是一类广泛分布于土壤、空气、枯枝落叶及各种发酵物上的真菌，从植物根圈、叶片及种子、球茎表面均可以分离到。木霉通过产生抗生素、营养竞争、重寄生、细胞壁降解酶以及诱导植物产生抗性等机制，对于多种植物病原菌具有拮抗作用，可抑制多种植物病害，是目前生防菌株中研究最为广泛的菌株之一。木霉对植物病原菌的生物防治机制是多样而复杂的，常常是多种机制共同作用的结果，不同的菌株生防机制的侧重点不同，其生防作用效果与菌株类型、病原真菌的类型、作物类型和环境条件密切相关。但由于木霉菌孢子不具备抗逆性，在高温、干燥和强光下就会死亡，失去抑菌活性。实验表明，一般不经过特殊处理的木霉菌孢子，在常温下(25℃)，相对湿度80％，存活时间只有12天，添加保水剂和紫外线防护剂，其存活时间只有2个月。因此，获得具有产生抗逆性很强的厚垣孢子产生菌就具有特殊意义。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种高产厚垣孢子的绿色木霉菌株TW12，该菌株不仅能够产生抗逆性很高的厚垣孢子，而且对黄瓜灰霉病、菌核病和柑橘炭疽病都具有很高防治效果。本发明的绿色木霉菌株不仅生长速度快、产孢量大、作用谱广，而且厚垣孢子生成率超过
45％，大大增加了抗逆性，储存时间长，且具有在黄瓜叶片、柑橘叶片能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。

[0004] 本发明所提供的菌株为绿色木霉(Trichoderma viride)菌株TW12，是从潍坊北部渤海滩涂潮间带的枯木上分离获得的，已于2015年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.11048。其具有以下生物学特性：在PDA琼脂培养基上生长快，32℃黑暗条件下培养2d，菌落直径75mm。菌落初期白色稀疏，后期形成黄绿色产孢区，3d即形成大量绿色孢子。反面无色。菌丝聚隔，分枝。分生孢子梗形成松柏式的分枝轮廓，分枝末端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，4.5-10×2.5-3.5μm。分生孢子椭球形、单个，近无色，聚集时呈淡绿色，壁稍粗糙，3.5-5×3-4μm。

[0005] 本发明绿色木霉菌株TW12的培养方法或繁殖方法包括：

[0006] (1)普通培养保存采用PDA培养基，配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂12g，蒸馏水1000mL；

[0007] (2)实验室液体培养采用PDB培养基，配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL；

[0008] (3)固体培养基配方：固料和无机盐溶液，所述固料和无机盐溶液的质量比为1：1.8；所述固料由质量比为60：10：30的木粉、玉米粉和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液的组分及含量为：3.5％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.5％硫酸钙，4％硫酸铵，
0.05％氯霉素，1.3％轻质碳酸钙，剩余为水。

[0009] (4)大量发酵培养基配方：同(3)中固体培养基配方。

[0010] 本发明还提供了一种含有所述绿色木霉菌株TW12的生物防治制剂。

[0011] 本发明所述的生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：

[0012] (1)制备所述绿色木霉菌株TW12的种子液；

[0013] (2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，28-30℃下恒温培养3～5d；

[0014] (3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28-30℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。

[0015] 其中，步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶液的质量比为1：1.8；所述固料由质量比为60：10：30的木粉、玉米粉和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液的组分及含量为：3.5％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.5％硫酸钙，4％硫酸铵，0.05％氯霉素，1.3％轻质碳酸钙，剩余为水。

[0016] 并且，步骤(3)中的大量发酵培养基同固体培养基。

[0017] 在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：

[0018] (1)将所述绿色木霉菌株TW12的孢子移植到PDB液体培养基中，28-30℃摇床振荡培养2～3d得到种子液；PDB液体培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL；

[0019] (2)将步骤(1)制备的种子液按质量比15％的比例接种到固体培养基中，28-30℃下振荡培养3～5d，期间维持相对湿度85％以上；

[0020] (3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至大量发酵培养基，室温28-30℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9d。

[0021] 本发明还提供了上述绿色木霉菌株TW12或者上述生物防治制剂在防治黄瓜灰霉病、黄瓜菌核病和柑橘炭疽病中的用途。

[0022] 并且，本发明还提供了一种用于防治黄瓜灰霉病、黄瓜菌核病和柑橘炭疽病的生物防治方法，所述生物防治方法包括向发病的黄瓜叶片、柑橘施用上述绿色木霉菌株TW12或者上述生物防治粉剂或液体制剂。

[0023] 实验表明，本发明的绿色木霉菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、厚垣孢子产生率大，抗逆性强，在黄瓜、柑橘叶片能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该绿色木霉菌株TW12制备的生物防治制剂，可以作为防治黄瓜病害的生物农药或生物肥料，防治多种黄瓜灰霉病、黄瓜菌核病和柑橘炭疽病等。

具体实施方式

[0024] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0025] 实施例1

[0026] 1、绿色木霉菌株TW12的分离与纯化

[0027] 本发明的绿色木霉菌株TW12是从潍坊北部渤海滩涂潮间带的枯木上分离获得的，分离方法为：

[0028] ⑴木霉菌株的分离：取潮间带枯木残体，先用75％的酒精局部处理1min，再在超净工作台上用紫外灯处理20min后，用灭菌刀片切开处理部位，用接种针挑取少量枯木刮取物，在PDA平板上划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化木霉菌株，转至PDA试管斜面保存备用。

[0029] (2)厚垣孢子产生率测定：首先在显微镜下进行形态观察，再进行高温活性测试，确定厚垣孢子抗逆性。

[0030] (3)黄瓜灰霉病和柑橘炭疽病高效拮抗木霉菌株的筛选

[0031] ①初筛：采用对峙培养法，制备PDA平板，用打孔器在木霉菌、黄瓜灰霉病菌、柑橘炭疽病病菌边缘打取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，26℃恒温培养，逐日观察木霉菌对病原菌的抑制作用。

[0032] ②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的木霉菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的木霉菌株，进行盆栽防治试验和田间试验。

[0033] 本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治黄瓜灰霉病、菌核病和柑橘炭疽病的绿色木霉(T.viride)TW12。实验证明，该绿色木霉原粉在防治黄瓜病害的代表性大棚种植试验中，对黄瓜灰霉病和柑橘炭疽病都显示出非常高效的防治效果，使得农作物显著增产。因而，本发明的绿色木霉是具有广泛应用前景的绿色木霉新菌株，可以用于制备防治黄瓜等病害的生物防治制剂。

[0034] 2、菌株鉴定

[0035] (1)微生物学特性：在PDA琼脂培养基上生长快，32℃黑暗条件下培养2d，菌落直径75mm。菌落初期白色稀疏，后期形成黄绿色产孢区，3d即形成大量绿色孢子。反面无色。菌丝聚隔，分枝。分生孢子梗形成松柏式的分枝轮廓，分枝末端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，4.5-10×2.5-3.5μm。分生孢子椭球形、单个，近无色，聚集时呈淡绿色，壁稍粗糙，
3.5-5×3-4μm。

[0036] (2)分子生物学特性

[0037] 该菌株的rRNA基因序列测定结果(ITS-5.8S-ITS2区)如下(SEQ-1)：

[0038] GGGCCCGGGATCTACTGATCGAGGTCACATTTCAGAAGTTTGGGGTGTTTACGGCTGTGGCCGCGCCGCGCTCCCGGTGCGAGTGTGCAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCCGGGGCGGCCCGGTGAGGGGCCGATCCCAACGCCGACCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGCTTTGATTCATTTTCGAGACGCCCGCTAGGGTCGCCGAGAAAGGCTCAAGCAAAAATAAAACAGAGCCGCGACGGGAGCCGCGACGGAGAGAAAAAAGAGTTGGAGTTGGTCCTCCGGCGGGCGCCATGGGATCCGGGGCTGCGACGCGCCCGGGGCAAGAGAATCCCGCCGAGGCAACAGATTGGTAACGTTCAATTGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGTT

[0039] 其中，PDA培养基配方：马铃薯200g(去皮)，葡萄糖20g，琼脂12g，蒸馏水1000mL。

[0040] 实施例2

[0041] 1、绿色木霉菌株TW12的发酵过程

[0042] PDB培养基配方：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。

[0043] 大量固体发酵培养基配方：所述固料和无机盐溶液的质量比为1：1.8；所述固料由质量比为60：10：30的木粉、玉米粉和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液的组分及含量为：3.5％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.5％硫酸钙，4％硫酸铵，0.05％氯霉素，1.3％轻质碳酸钙，剩余为水。

[0044] 绿色木霉菌株TW12大量固体发酵过程：

[0045] ①菌种种子液培养：将绿色木霉菌菌株TW12从试管斜面中挑取少量孢子，移至PDB液体培养基中，28℃摇床振荡培养3～5d，此为种子液。

[0046] ②固体生产菌种的培养：将种子液按15％的比例接种到固体培养基(500mL三角瓶)中，28℃恒温培养3～5d，中间多次振荡；期间维持相对湿度85％以上，产孢湿度75～80％；

[0047] ③大量固体发酵：将②中固体培养的培养物用无菌水按1:15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，除去粗渣，即为生产菌液，接种比例按1:6体积比接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(28℃和相对湿度85％以上)中发酵培养8～9d，期间要翻动3～5次，增加氧气量，即可得到绿色木霉菌原粉，菌活为30-50亿/克。

[0048] ④可湿性粉剂：原菌粉(菌活40亿/克)5％，CMC 0.5％，拉开粉3％，十二烷基磺酸钠8％，葡萄糖2％，白炭黑1％，其余为凹凸棒土。该可湿性粉剂的菌活为2亿/克。

[0049] 实施例3厚垣孢子抗逆性

[0050] 木霉菌普通孢子对温湿度非常敏感，因此，在加工成产品后，难以保存，而厚垣孢子由于孢子壁加厚，细胞质变浓，含水量减少，从而大大提高了在恶劣环境下的存活率。试验结果如下：

[0051] 1、试验方法：将普通绿色木霉菌LTR-2孢子和含有厚垣孢子绿色木霉菌TW12两个菌株绿色木霉菌原粉分成两部分，一部分分别在30℃、40℃、50℃和60℃恒温箱中保藏3d，另一部分保存在-5℃冰箱中；3d后，用PDA培养基进行平板测定，根据不同温度处理的培养基菌落数与保存在-5℃冰箱的同一批菌粉培养基菌落数进行对比，计算孢子存活率(％)。

[0052] 2、不同温度处理3d后存活率(％)结果如表1所示。LTR-2菌粉为普通绿色木霉菌孢子，TW12菌粉为含有厚垣孢子绿色木霉菌。

[0053] 表1 不同温度处理3d后存活率(％)

[0054]  30℃ 40℃ 50℃ 60℃
LTR-2菌粉 82.45 53.88 19.64 1.31
TW12菌粉 92.71 78.52 59.29 46.74

[0055] 3、常温保存结果分析

[0056] 将普通绿色木霉菌LTR-2孢子和含有厚垣孢子绿色木霉菌TW12两个菌株绿色木霉菌原粉分成两部分，一部分分别在常温下保藏3、6、9和12个月，另一部分保存在-5℃冰箱中；每间隔不同时间，将菌粉取出与冰箱的样品，用PDA培养基进行平板测定，根据不同时间保存的培养基菌落数与保存在-5℃冰箱的同一批菌粉培养基菌落数进行对比，计算孢子存活率(％)。

[0057] 表2 常温下不同保藏时间的存活率(％)

[0058]  3个月 6个月 9个月 12个月
LTR-2菌粉 9.24 2.26 0.03 0
TW12菌粉 62.47 51.86 38.72 32.49

[0059] 根据国家队生物农药产品规定，活体生物制剂常温保存时间不低于12个月，显然，用普通木霉菌进行菌剂生产是无法达到要求的，即使增加制剂孢子最初含量，12个月后也不可能达到目前普遍登记2.0亿活孢子/克的木霉菌菌剂要求，因为普通木霉菌孢子根本存活不到12个月。所以，获得厚垣孢子木霉菌菌株意义重大。

[0060] 实施例4田间药效试验

[0061] 1试验目的

[0062] 黄瓜灰霉病是黄瓜的主要病害，对农业生产影响很大。根据我们筛选的绿色木霉菌厚垣孢子产生菌菌株TW12参照实施例1进行原粉发酵后制成2亿活孢子/克木霉菌可湿性粉剂防治黄瓜灰霉病田间药效试验，为确定药剂防治黄瓜灰霉病的最佳田间使用剂量、药剂药效、作用特点、持效期、药剂对作物及非靶标有益生物的影响和安全合理的使用技术提供数据。

[0063] 2试验条件

[0064] 2.1试验对象、作物和品种的选择

[0065] 试验对象：黄瓜灰霉病botrytis Cinerea Pers.。

[0066] 试验作物：大棚黄瓜，品种为津春4号。

[0067] 2.2作物栽培及环境条件

[0068] 试验田位于浙江省绍兴市农科院五和基地，试验地水肥条件较好，栽培管理条件一致，符合试验要求。

[0069] 3试验设计和安排

[0070] 3.1药剂

[0071] 3.1.1试验药剂

[0072] 2亿活孢子/克木霉菌(实施例2制备)可湿性粉剂。

[0073] 3.1.2对照药剂

[0074] 400克/升啥霉胺SC，拜耳作物科学公司；

[0075] 另设空白对照。

[0076] 3.1.3药剂用量与处理编号

[0077] 表3 供试药剂试验设计

[0078]

[0079] 3.2小区安排

[0080] 3.2.1小区面积和重复

[0081] 小区面积(或植株数):10平方米。

[0082] 重复次数:4次。

[0083] 3.3施药方法

[0084] 3.3.1使用方法

[0085] 均匀喷雾，先处理试验药剂，从低浓度到高浓度依次喷雾，然后处理对照药剂，换药剂时清洗喷雾器。

[0086] 3.3.2施药器械

[0087] 浙江台州市广丰塑业有限公司生产的3Wbs-16型手动喷雾器，工作压力为0.2-0.3mpa.。3.3.3施药时间和次数

[0088] 本试验于2014年6月4日、6月11日施药，共2次。

[0089] 3.3.4使用容量

[0090] 施药量为675公斤/公顷。

[0091] 3.3.5防治其他病虫害的药剂资料

[0092] 试验前10天及试验期间没有进行其他病虫草害的药剂防治。

[0093] 4调查、记录和测量方法

[0094] 4.1气象及土壤资料

[0095] 4.1.1气象资料

[0096] 第一次施药当日，阴，气温21.30℃-25.50℃，平均相对湿度92％；第二次施药当日，阴，气温24.10-28.70℃，平均相对湿度90％。

[0097] 4.1.2土壤资料

[0098] 试验地地势平坦，土壤类型：黄化青紫泥；有机质含量(％)：2.9；pH值：6.8。

[0099] 4.2调查方法、时间和次数

[0100] 4.2.1调查时间和次数

[0101] 本试验共计调查3次，分别是2014年6月4日调查药前病情基数，6月11日调查一次药后7天试验结果，6月21日调查二次药后10天结果。

[0102] 4.2.2调查方法

[0103] 根据“农药田间药效试验准则(一)—杀菌剂防治黄瓜灰霉病”的规定进行，每试验小区采用随机四点取样，每点调查2株，调查每株的全部叶片，记录病害等级。病害分级标准如下:

[0104] 0级：无病；

[0105] 1级：单叶片有病斑1-3个；

[0106] 3级：单叶片有病斑4-6个；

[0107] 5级：单叶片有病斑7-10个；

[0108] 7级：单叶片有病斑11-20个；

[0109] 9级：单叶片有病斑密集占叶面积四分之一以上。

[0110] 4.2.3药效计算方法

[0111] 根据调查结果，按照下面(1)、(2)公式计算病情指数和防效。试验数据采用邓肯氏新复极差法(DMRT)进行统计分析。

[0112]

[0113]

[0114] 式中：

[0115] CK0——空白对照区施药前病情指数；

[0116] CKl——空白对照区施药后病情指数；

[0117] PT0——药剂处理区施药前病情指数；

[0118] PTl—药剂处理区施药后病情指数。

[0119] 4.3对作物的直接影响

[0120] 试验期间观察试验药剂对作物的有益或不良影响。

[0121] 5结果与分析

[0122] 表4 2亿活孢子/克木霉菌可湿性粉剂防治黄瓜灰霉病田间药效试验结果[0123]

[0124] 注:1.处理防效为各重复平均值；大写字母表示1％差异显著性，小写字母表示5％差异显著性

[0125] 2.田间试验数据采用邓肯氏新复极差法(DMRT)进行统计分析。

[0126] 结论：田间试验结果表明，2亿活孢子/克木霉菌可湿性粉剂在每公顷制剂用量2812.5克和3750克下对黄瓜灰霉病具有较好的防治效果(与对照药剂400克/升嘧霉胺悬浮剂937.5毫升/公顷处理相当)，可以用来防治黄瓜灰霉病。

[0127] 药剂防治技术要点：使用时应选在黄瓜灰霉病初发期、病情指数较低时使用，使用时应叶片和植株整株均匀喷雾(以湿润而不滴水为度)，建议制剂用量为2812.5-3750克/公顷，兑水675升。

[0128] 试验期间未发现对作物和其他有益生物有不良影响。