一种酵母融合子的制备及快速筛选方法

摘要

本发明提供一种酵母融合子的制备及快速筛选方法，为了实现辅酶Q10的大量生产，本发明利用原生质体融合的方法，通过对粟酒裂殖酵母与多形汉逊酵母进行融合处理，结合一种高效筛选目标酵母融合子的方法，快速高效地获得同时兼备两种酵母菌株优良特性的目标融合子，所述目标融合子同时具有生长速度快、耐高温，以及能够高效生产辅酶Q10等优点。本发明所述的筛选酵母融合子的方法，是以菌体的生长性能包括生长速度和耐高温能力及目标代谢产物作为筛选标记，具体以温度耐受性和含有辅酶Q10结构类似物维生素K3的培养基作为筛选策略，可以直接高通量筛选出目标融合子。本发明方法为一种简单、快捷、高效、经济、实用安全的改良酵母方法。

权利要求

1.一种酵母融合子的制备及快速筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)以多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)DL-1和粟酒裂殖酵母(S.promb)2.1794为出发菌株，分别制备原生质体；

2)以多形汉逊酵母和粟酒裂殖酵母为两亲本，将两亲本原生质体进行融合，得融合处理细胞；

3)对融合处理细胞进行初步培养后以48℃高温培养对初步培养得到的菌株进行初筛，再结合维生素K3选择性培养基对初筛后保留的菌株进行复筛，得目标融合菌株，维生素K3选择培养基为添加有浓度为0.16mg/mL维生素K3的固体YPD培养基；

所述制备原生质体包括以下步骤：

1.1)收集菌体：取对应出发菌株对数期菌液并通过离心收集菌体，以PBS缓冲液洗涤菌体2～3次；

1.2)细胞预处理：以预处理液悬浮经过洗涤的菌体，然后于25～35℃水浴处理5～

10min，处理后通过离心收集菌体；所述预处理液的制备方法为：将15～25μL 0.05mol/L EDTA水溶液以及15～25μLβ-巯基乙醇溶于20mL PB缓冲液中；

1.3)破壁：以2.0～2.5％蜗牛酶酶液悬浮步骤1.2)收集的菌体，然后于25～40℃水浴处理30～60min，使菌体细胞转变为原生质体，然后通过离心收集原生质体，然后以KCl高渗缓冲液洗涤原生质体2～3次，所述KCl高渗缓冲液的制备方法为：将4～5g KCl溶于100mL PB缓冲液；

所述融合包括以下步骤：

2.1)灭活：分别将两亲本原生质体在紫外灯下照射1～5min，然后于黑暗中保存15～

20min，分别得到两亲本灭活后的原生质体；

2.2)分别以KCl高渗缓冲液悬浮两亲本灭活后的原生质体，得两亲本原生质体细胞悬液，所述KCl高渗缓冲液的制备方法为：将4～5g KCl溶于100mL PB缓冲液；

2.3)将两亲本原生质体细胞悬液混合后离心并收集细胞，以PEG-CaCl2缓冲液悬浮该细胞，然后于25～35℃水浴处理15～20min，然后通过离心收集细胞，用KCl高渗缓冲液洗涤该细胞2～3次，得融合处理细胞，所述PEG-CaCl2缓冲液的制备方法为：将6～8g PEG6000、0.8～

1.0g CaCl2以及30～50μLβ-巯基乙醇溶于20mL PB缓冲液。

2.根据权利要求1所述一种酵母融合子的制备及快速筛选方法，其特征在于：所述紫外灯的照射功率为15～30W，照射距离为30～50cm。

3.根据权利要求1所述一种酵母融合子的制备及快速筛选方法，其特征在于：所述步骤

3)具体包括以下步骤：

3.1)固体培养基培养：将融合处理细胞用KCl高渗缓冲液悬浮后均匀涂布于KCl高渗培养基上，然后于28～37℃恒温培养36～60h，然后挑取80～120株生长状况较好的菌株作为融合酵母候选菌株，所述KCl高渗缓冲液的制备方法为：将4～5g KCl溶于100mL PB缓冲液；

3.2)高温筛选：将融合酵母候选菌株接种于固体YPD培养基上，然后于48℃恒温培养36～60h，筛选耐高温融合菌株；

3.3)维生素K3抗性复筛：将耐高温融合菌株涂布于固体维生素K3选择培养基上，然后于

28～37℃恒温培养36～60h，筛选出的维生素K3抗性菌株即目标融合菌株。

4.根据权利要求1或3所述一种酵母融合子的制备及快速筛选方法，其特征在于：所述PB缓冲液由87.7mL 0.2mol/L NaH2PO4水溶液以及12.3mL 0.2mol/L Na2HPO4水溶液配制而成。

5.根据权利要求3所述一种酵母融合子的制备及快速筛选方法，其特征在于：所述KCl高渗培养基的组成为：酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，以及KCl 

40g/L。

说明书

一种酵母融合子的制备及快速筛选方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种酵母融合子的制备及其高通量快速筛选的方法。

背景技术

[0002] 辅酶Q10为呼吸链上的一个重要的电子载氢体，能可逆地进行氧化还原反应，广泛存在于人、动物、植物及多数微生物中。目前利用微生物法发酵生产辅酶Q10的菌种主要是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyce spombe，S.sprombe)，但粟酒裂殖酵母生长缓慢、生长条件要求严格，严重影响着辅酶Q10的生产效率。近年来，研究人员通过紫外诱变、离子束诱变等方法对其进行进一步基因改造，使其成为辅酶Q10的生产载体。

[0003] 作为食品级的多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha，H.polymorpha)，因其安全性高、优点明显，近年来备受关注。其优点体现在遗传背景清晰，耐高温、易于高密度发酵、繁殖快、遗传操作简单、能对外源产物进行翻译后加工和修饰及无毒性代谢产物等；多形汉逊酵母为一种耐热酵母，最适生长温度为37℃，但最高生长温度可达49℃；另外，其可在廉价的非选择性培养基中生长，pH适应范围广(2.5～8.0)，易于实现高密度发酵，菌体浓度可高达120g/L，一般可作为代谢产物生产发酵的天然载体。因此，如果将多形汉逊酵母优良特性(如生长速度快、耐高温)高效移植到辅酶Q10生产菌株粟酒裂殖酵母中，必能提高粟酒裂殖酵母的辅酶Q10的生产效率。

[0004] 目前，尚未见到关于粟酒裂殖酵母及多形汉逊酵母原生质体融合子制备以及快速筛选方法的报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种酵母融合子的制备及快速筛选方法。

[0006] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

[0007] 1)以多形汉逊酵母和粟酒裂殖酵母为出发菌株，分别制备原生质体；

[0008] 2)以多形汉逊酵母和粟酒裂殖酵母为两亲本，将两亲本原生质体(多形汉逊酵母原生质体和粟酒裂殖酵母原生质体)进行融合，得融合处理细胞；

[0009] 3)对融合处理细胞进行初步培养后以48℃高温培养对初步培养得到的菌株进行初筛，再结合维生素K3选择性培养对初筛后保留的菌株进行复筛，得目标融合菌株。

[0010] 所述制备原生质体包括以下步骤：

[0011] 1.1)收集菌体：取对应出发菌株对数期菌液并通过离心(4000～8000r/min离心5～10min)收集菌体，以PBS缓冲液洗涤菌体2～3次；

[0012] 1.2)细胞预处理：以预处理液(用量为对数期菌液体积的0.5～1倍)悬浮经过PBS缓冲液洗涤的菌体，然后于25～35℃水浴处理5～10min，处理后通过离心(4000～8000r/min)收集菌体；所述预处理液的制备方法为：将15～25μL 0.05mol/L EDTA水溶液以及15～25μLβ-巯基乙醇溶于20mL PB缓冲液中；

[0013] 1.3)破壁：以2.0～2.5％蜗牛酶酶液(用量为对数期菌液体积的0.5～1倍)悬浮步骤1.2)收集的菌体，然后于25～40℃水浴处理30～60min，使菌体细胞转变为原生质体，然后通过离心(3000～6000r/min离心5～10min)收集原生质体，然后以KCl高渗缓冲液洗涤原生质体2～3次，所述KCl高渗缓冲液的制备方法为：将4～5g KCl溶于100mL PB缓冲液。

[0014] 所述融合包括以下步骤：

[0015] 2.1)灭活：利用步骤1.1)～1.3)分别制备两亲本原生质体，分别将两亲本原生质体在紫外灯下照射1～5min，然后于黑暗中保存15～20min，分别得到两亲本灭活后的原生质体；

[0016] 2.2)分别以KCl高渗缓冲液悬浮两亲本灭活后的原生质体，得两亲本原生质体细胞悬液，所述KCl高渗缓冲液的制备方法为：将4～5g KCl溶于100mL PB缓冲液；

[0017] 2.3)将两亲本原生质体细胞悬液混合后离心(3000～6000r/min离心5～10min)并收集细胞，以PEG-CaCl2缓冲液(用量为对数期菌液体积的1倍)悬浮该细胞，然后于25～35℃水浴处理15～20min，然后通过离心(3000～6000r/min离心5～10min)收集细胞，用KCl高渗缓冲液洗涤该细胞2～3次，得融合处理细胞，所述PEG-CaCl2缓冲液的制备方法为：将6～8g PEG6000、0.8～1.0g CaCl2以及30～50μLβ-巯基乙醇溶于20mL PB缓冲液。

[0018] 所述紫外灯的照射功率为15～30W，照射距离为30～50cm。

[0019] 所述步骤3)具体包括以下步骤：

[0020] 3.1)固体培养基培养(初步培养，长细胞壁)：将融合处理细胞用KCl高渗缓冲液(用量为对数期菌液体积的0.3～0.5倍)悬浮后均匀涂布于KCl高渗培养基上，然后于28～37℃恒温培养36～60h，然后挑取80～120株生长状况较好的菌株作为融合酵母候选菌株，所述KCl高渗缓冲液的制备方法为：将4～5g KCl溶于100mL PB缓冲液；

[0021] 3.2)高温筛选：将融合酵母候选菌株分别接种于固体YPD培养基上，然后于48℃恒温培养36～60h，筛选耐高温融合菌株；

[0022] 3.3)维生素K3抗性复筛：将耐高温融合菌株分别涂布于固体维生素K3选择培养基上，然后于28～37℃恒温培养36～60h，筛选出的维生素K3抗性菌株即目标融合菌株。

[0023] 所述PB缓冲液由87.7mL 0.2mol/L NaH2PO4水溶液以及12.3mL 0.2mol/L Na2HPO4水溶液配制而成。

[0024] 所述KCl高渗培养基的组成为：酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，以及KCl 40g/L。

[0025] 所述固体维生素K3选择培养基为添加有浓度为0.16mg/mL维生素K3的固体YPD培养基。

[0026] 本发明的有益效果体现在：

[0027] 为了实现辅酶Q10的大量生产，本发明利用原生质体融合的方法，通过对粟酒裂殖酵母和多形汉逊酵母进行融合处理，再结合一种高效筛选目标酵母融合子的方法，快速高效地获得同时兼备两种酵母菌株的优良特性的目标融合子，所述目标融合子同时具有生长速度快、耐高温，以及能够高效生产辅酶Q10等优点。本发明的筛选酵母融合子的方法，是以菌体的耐高温(即48℃高温，过高或过低均无法实现筛选)及目标代谢产物(辅酶Q10)作为筛选标记，具体以耐高温特性和添加辅酶Q10结构类似物维生素K3的培养基作为筛选手段，可以直接筛选出目标融合子。本发明方法为一种简单、快捷、高效、经济、实用、安全的酵母融合子构建方法。

附图说明

[0028] 图1为辅酶Q10高效液相色谱检测图谱，其中：A为辅酶Q10标准品，B为目标融合菌株发酵液提取物。

[0029] 图2为5号目标融合菌株连续八代培养辅酶Q10产量图。

具体实施方式

[0030] 下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。

[0031] 本发明涉及的菌种：多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)DL-1，源于中国工业微生物保藏中心，保藏号为ATCC No.26012；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyce spombe)(S.promb 2.1794)，购自中国科学院微生物研究所。

[0032] 本发明涉及的培养基：

[0033] 1)YPD培养基：酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，PH自然，(制备固体培养基需另加入琼脂粉20g/L)。

[0034] 2)KCl高渗培养基：酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，KCl 40g/L，PH自然。

[0035] 3)维生素K3选择培养基：于YPD培养基中加入一定量的维生素K3。

[0036] 4)麦芽汁培养基：酵母浸粉3g/L，蛋白胨4g/L，葡萄糖10g/L，麦芽粉10g/L，PH自然(制备固体培养基需另加入琼脂粉13g/L)。

[0037] 本发明涉及的试剂：

[0038] 1)PB缓冲液:0.2mol/L NaH2PO4水溶液87.7mL，以及0.2mol/L Na2HPO4水溶液12.3mL配制而成；

[0039] 2)PBS缓冲液：14.6g甘露醇溶解于PB缓冲液，定容至100mL，备用；

[0040] 3)预处理液:以0.05mol/L EDTA水溶液20μL，以及β-巯基乙醇20μL，溶于20mL PB缓冲液中，备用；

[0041] 4)2.5％蜗牛酶酶液：2.5mg蜗牛酶(sigma)溶解于100mL PBS缓冲液，备用；

[0042] 5)KCl高渗缓冲液：5g KCl溶于100mL PB缓冲液，备用；

[0043] 6)PEG-CaCl2缓冲液:PEG60008g，CaCl20.9g，以及β-巯基乙醇40μL，溶于20mL PB缓冲液，备用。

[0044] 本发明所述酵母融合子的制备及快速筛选方法，包括以下步骤：

[0045] 一、维生素K3最小抑制浓度的确定

[0046] 取粟酒裂殖酵母保藏菌种，以5％(v/v)接种量接种于麦芽汁培养基中，28℃恒温培养，进行菌种活化，至OD500为1；取菌液再次接种于麦芽汁培养基中，接种量为10％(v/v)，6
28℃恒温培养16h，得粟酒裂殖酵母对数期菌液。取对数期菌液，稀释至浓度为1×10 个/mL，分别涂布于固体维生素K3选择培养基，维生素K3浓度从小到大，分别为0.00、0.04、0.08、
0.12、0.16、0.20、0.24mg/mL。28℃恒温培养48h后观察菌落生长情况，以确定维生素K3的最小抑菌浓度，最终确定最小抑菌浓度为0.16mg/mL。

[0047] 二、融合子的制备

[0048] 1、原生质体的制备(两亲本原生质体制备方法一致)

[0049] 1)收集菌体：取对数期菌液1mL，6000r/min离心10min，弃上清，以1mL PBS缓冲液洗涤2次，6000r/min离心收集菌体；多形汉逊酵母的对数期菌液与粟酒裂殖酵母对数期菌液获得方法相同；

[0050] 2)细胞预处理：以1mL预处理液悬浮步骤1)所得菌体，30℃水浴处理10min，6000r/min离心，弃上清，收集菌体；

[0051] 3)破壁：以1mL 2.5％蜗牛酶酶液悬浮步骤2)所得菌体，35℃水浴处理60min，镜检(90％以上的菌体细胞转变为原生质体)，4000r/min离心10min，收集原生质体，再以1mL KCl高渗缓冲液洗涤2次，洗涤后的原生质体备用。

[0052] 2、原生质体融合

[0053] 1)分别将两亲本原生质体细胞在无菌操作台紫外灯下(功率20W，距离45cm)照射5min，黑暗中保存20min，以0.5mL KCl高渗缓冲液悬浮两亲本原生质体细胞；

[0054] 2)混合两亲本原生质体细胞悬液，4000r/min离心，收集细胞，以1mL PEG-CaCl2缓冲液悬浮细胞，30℃水浴处理20min；4000r/min离心10min，收集细胞，以1mL KCl高渗缓冲液洗涤细胞2次，得融合处理细胞；

[0055] 3)将所得融合处理细胞用0.3mL KCl高渗缓冲液悬浮后涂布于KCl高渗培养基，37℃培养48h。

[0056] 三、目标融合菌株的筛选

[0057] 1、48℃高温条件下初筛

[0058] 从上述KCl高渗培养基上随机挑选出100株生长速度较快、生长状态良好的单菌落菌株，作为融合酵母候选菌株。

[0059] 将上述100株融合酵母候选菌株在无菌条件下，接种(划线)于固体YPD培养基，分别以多形汉逊酵母和粟酒裂殖酵母作为阳性和阴性对照，48℃下恒温培养48h，筛选出具有耐高温特性的菌落。结果，100株融合酵母候选菌株中有58株可顺利继续生长，显示耐高温特性，同多形汉逊酵母；而粟酒裂殖酵母及其它42株融合酵母候选菌株均不能生长。表明，此58株融合酵母候选菌株具备多形汉逊酵母耐高温的生长特性，其可能为目标融合菌株或多形汉逊酵母。

[0060] 2、维生素K3抗性筛选

[0061] 以上述58株融合酵母候选菌株为研究对象，在无菌条件下，将其接种(划线)于固体维生素K3选择培养基，分别以粟酒裂殖酵母和多形汉逊酵母作为阳性和阴性对照，37℃恒温培养48h，筛选具有维生素K3抗性菌株。结果，58株融合酵母候选菌株中有7株可顺利继续生长，显示维生素K3抗性特性，同粟酒裂殖酵母；而多形汉逊酵母及其它51株融合酵母候选菌株均不能生长。表明，此7株融合酵母候选菌株即为同时具有耐高温及维生素K3抗性的目标融合菌株，分别编号为1～7号。

[0062] 四、终产物检测

[0063] 将上述7株目标融合菌株分别接种于液体YPD培养基中，37℃发酵培养72h，分别对其发酵液以焦性没食子酸法进行提取分离处理，结合利用高效液相色谱(HPLC)对发酵液提取物进行辅酶Q10含量检测。

[0064] 色谱条件为：C18色谱柱；甲醇/无水乙醇(体积比1:1)为流动相；柱温35℃；流速为1mL/min；检测波长为275nm；进样量为20μL。

[0065] 通过对发酵所得的辅酶Q10产量进行检测，发现1～7号目标融合菌株的产量较粟酒裂殖酵母出发菌株都有所提高。粟酒裂殖酵母出发菌株辅酶Q10产量为9.24mg/L，目标融合菌株1～7号辅酶Q10产量分别为16.31mg/L、18.78mg/L、12.47mg/L、15.82mg/L、20.03mg/L、15.08mg/L、17.56mg/L，产量分别增加约76.5％、103.2％、35.0％、71.2％、116.8％、
90.0％，HPLC图谱见图1。

[0066] 五、目标融合菌株遗传稳定性研究

[0067] 以产量最高的5号目标融合菌株为研究对象，对其进行遗传稳定性研究。将5号目标融合菌株接种于液体YPD培养基中，37℃、125r/min下进行摇瓶培养，48h传一代，传代培养8代后，分别对每一代的发酵液进行提取分离，检测辅酶Q10产量。结果见图2，其辅酶Q10产量分别为20.03mg/L、19.87mg/L、19.23mg/L、19.52mg/L、18.63mg/L、18.94mg/L、18.81mg/L、18.79mg/L，虽然有小幅度下降及波动，但整体趋于稳定，产量维持在18.63～20.03mg/L；表明，基于原生质体融合构建的多形汉逊酵母及粟酒裂殖酵母重组菌株，虽然在传代培养中辅酶Q10产量有小幅度下降，但对整体影响并不大，所以具有遗传稳定性。

[0068] 经过多次的重复实验(从出发菌株开始进行融合子制备以及筛选)，每次均可以得到5～20株目标融合菌株，辅酶Q10产量均得到提高，且具有遗传稳定性。