EV71 3C蛋白酶作用靶点检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种EV71 3C蛋白酶作用靶点检测试剂盒，包括3C蛋白、多肽底物，以及酶解反应缓冲液，所述3C蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示；所述多肽底物为Dabcyl‑EALFQGPPKFE‑Edans。本发明还公开了一种EV71 3C蛋白酶作用靶点检测方法：将待检测化合物、3C蛋白加入到酶解反应缓冲液中，然后加入多肽底物，混匀，在336nm波长激发下，检测其在490nm处的荧光强度；若检测不到荧光，则表明该待检测化合物能抑制3C蛋白；若能够检测到荧光，则表明该待检测化合物不能抑制3C蛋白。本发明的检测试剂盒及方法，可有效对待检测化合物的抗EV71能力进行检测，方法简便，易行，特异性及灵敏性高。

权利要求

1.一种EV71 3C蛋白酶作用靶点检测试剂盒，其特征在于：包括3C蛋白、多肽底物，以及酶解反应缓冲液，所述3C蛋白的序列如下，如SEQ ID NO.1所示：GPSLDFALSLLRRNIRQVQTDQGHFTMLGVRDRLAVLPRHSQPGKTIWVEHKLVNVLDAVELVDEQGVNLELTLITLDTNEKFRDITKFIPENISTASDATLVINTEHMPSMFVPVGDVVQYGFLNLSGKPTHRTMMYNFPTKAGQCGGVVTSVGKVVGIHIGGNGRQGFCAGLKRSYFASEQ；

所述多肽底物为Dabcyl-EALFQGPPKFE-Edans，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，N端连接Dabcyl基团，C端连接Edans基团。

2.根据权利要求1所述的EV71 3C蛋白酶作用靶点检测试剂盒，其特征在于：所述酶解反应缓冲液为反应buffer液，其包括如下组分：25mM Tris-HCl，pH 8.0；200mM NaCl。

3.根据权利要求1或2所述的EV71 3C蛋白酶作用靶点检测试剂盒，其特征在于：包括以下物质：0.5uM 3C蛋白2ul；10uM多肽底物5ul；反应buffer液13ul。

4.一种利用权利要求1～3中任一项所述的EV71 3C蛋白酶作用靶点检测试剂盒进行检测的方法，其特征在于：将待检测化合物、3C蛋白加入到酶解反应缓冲液中，然后加入多肽底物，混匀，反应30min后，在336nm波长激发下，检测其在490nm处的荧光强度；若检测不到荧光，则表明该待检测化合物能抑制3C蛋白，具有抗EV71病毒能力；若能够检测到荧光，则表明该待检测化合物不能抑制3C蛋白。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：多肽底物在336nm波长激发下，获得其在490nm处的荧光强度值A，表示未降解时的荧光强度；将3C蛋白多肽底物加入到反应buffer液后，混匀反应30min后，倒入玻璃比色皿中，在336nm波长激发下，获得其在490nm处的荧光强度值B，表示经降解后的荧光强度；在上述反应体系中加入一定浓度的待检测化合物，并重复以上步骤操作，获得化合物存在时的荧光强度C，通过比较A,B,C三值大小，确定待检测化合物对3C蛋白酶的酶活性的影响。

说明书

EV71 3C蛋白酶作用靶点检测试剂盒及检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种EV71 3C蛋白酶作用靶点检测试剂盒，及检测方法。

背景技术

[0002] 肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是手足口病的主要致病原之一。临床上多表现为轻微症状：发热、手足口部的疱疹、疱疹性咽峡炎。而严重者则引起神经系统并发症如无菌性脑膜脑炎、脊髓炎、神经源性的肺水肿等。严重者有生命危险。临床上治疗EV71感染主要是对症治疗，目前尚无特异抗病毒药物，寻找和发现抗EV71病毒药物是目前面临的中药课题。

[0003] 寻找抗EV71药物目前主要有2大途径：1：在已知病毒蛋白功能域的基础上进行针对性设计；2：在中草药、海洋生物、陆地微生物等自然界中萃取、寻找。后者往往是新结构、新机制抗病毒药物的重要来源，对于抗病毒药物的研究具有重要意义，但是，这些自然资源中获得的化合物的抗病毒作用靶点却常常存在难度。因此，寻找靶点并开发一套合适的检测方法是急需解决的问题。

发明内容

[0004] 针对上述现有技术，本发明以3C蛋白为抗病毒作用靶点，开发了一套检测试剂盒及检测方法，其目的是检测待检测化合物是否可抑制3C蛋白，进而判断其是否可抑制EV71病毒，是否可以作为抗EV71病毒的药物进行研究应用。

[0005] 3C蛋白是手足口病病原EV71的蛋白酶，其酶活性直接影响病毒复制效率和致病毒力(Weng K.F.，Li M.L.，Hung C.T.et al.Enterovirus 7 l 3C protease cleaves a novel target CstF-64 and ihibits cellular polyadenylation[J].PLOS Pathog，2009，5(9)：elO00593.)。本研究以该蛋白酶测活方法为基础，建立了3C蛋白酶活性的成套试剂，用于检测药物靶点。如果药物可以抑制3C蛋白酶的活性，则提示该药物的作用靶点是EV71的3C蛋白酶的酶活中心(His41,Glu71和Cys147催化三联体)。

[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0007] 一种EV71 3C蛋白酶作用靶点检测试剂盒，包括3C蛋白、多肽底物，以及酶解反应缓冲液，所述3C蛋白的序列如下(如SEQ ID NO.1所示)：

[0008]GPSLDFALSLLRRNIRQVQTDQGHFTMLGVRDRLAVLPRHSQPGKTIWVEHKLVNVLDAVELVDEQGVNLELTLITLDTNEKFRDITKFIPENISTASDATLVINTEHMPSMFVPVGDVVQYGFLNLSGKPTHRTMMYNFPTKAGQCGGVVTSVGKVVGIHIGGNGRQGFCAGLKRSYFASEQ。

[0009] 所述多肽底物为Dabcyl-EALFQGPPKFE-Edans，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，N端连接Dabcyl基团，C端连接Edans基团。

[0010] 所述酶解反应缓冲液为反应buffer液，其包括如下组分：25mM Tris-HCl(pH 8.0),200mM NaCl。

[0011] 一种EV71 3C蛋白酶作用靶点检测方法，如下：将待检测化合物、3C蛋白加入到酶解反应缓冲液中，然后加入多肽底物，混匀，反应30min后，在336nm波长激发下，检测其在490nm处的荧光强度；若检测不到荧光，则表明该待检测化合物能抑制3C蛋白，具有抗EV71病毒能力，可作为抗EV71病毒的药物进行进一步的研究应用；若能够检测到荧光，则表明该待检测化合物不能抑制3C蛋白。

[0012] 进一步地，检测方法如下：多肽底物在336nm波长激发下，获得其在490nm处的荧光强度值A(表示未降解时的荧光强度)。将3C蛋白多肽底物加入到反应buffer液后，混匀反应30min后，倒入玻璃比色皿中，在336nm波长激发下，获得其在490nm处的荧光强度值B(经降解后的荧光强度)。在上述反应体系中加入一定浓度的待检测化合物，并重复以上步骤操作，获得化合物存在时的荧光强度C，通过比较A,B,C三值大小，确定化合物对3C蛋白酶的酶活性的影响(C的数值在A、B之间，C的数值越小，说明待检测化合物对3C蛋白酶的酶活性的抑制越明显，C的数值越大，说明待检测化合物对3C蛋白酶的酶活性的抑制越弱)。

[0013] 本发明的原理为：该成套检测试剂主要由3C蛋白及荧光多肽底物组成。3C蛋白对底物进行酶解后，由于底物两端的基团分离，荧光淬灭消失，反应产物激发出荧光信号。通过比较野生组与对照组的荧光发射曲线差异，判断化合物是否影响了3C蛋白酶对底物的降解活性，进而筛选对抗EV71 3C蛋白酶的靶标化合物，后续还可通过计算3C的米氏常数Km值及催化效率Kcat值，定量判定靶标化合物的抑制能力。

[0014] 本发明的检测试剂盒及方法，可有效对待检测化合物的抗EV71能力(是否以3C蛋白为靶点)进行检测，方法简便，易行，特异性及灵敏性高。

附图说明

[0015] 图1：抑制剂对3C蛋白降解2C-3A多肽的影响。

具体实施方式

[0016] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

[0017] 下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

[0018] 实验EV71 3C蛋白酶作用靶点检测试剂盒及检测方法的研究

[0019] 1：材料：

[0020] 1.1：3C蛋白

[0021] 采用分子克隆方法获得3C基因的原核表达质粒，使用大肠杆菌Bl21菌株进行蛋白的表达和纯化(公知技术)。肽序列如下(如SEQ ID NO.1所示)：

[0022]GPSLDFALSLLRRNIRQVQTDQGHFTMLGVRDRLAVLPRHSQPGKTIWVEHKLVNVLDAVELVDEQGVNLELTLITLDTNEKFRDITKFIPENISTASDATLVINTEHMPSMFVPVGDVVQYGFLNLSGKPTHRTMMYNFPTKAGQCGGVVTSVGKVVGIHIGGNGRQGFCAGLKRSYFASEQ。

[0023] 3C蛋白第147位半胱氨酸酶活中心的C为酶活中心的关键氨基酸。

[0024] 1.2：荧光多肽底物

[0025] 发明人前期检测了3C蛋白酶对6条10肽底物的酶活，寻找到一条在水溶液中稳定性好、并被3C蛋白高效降解的多肽(表1)。这一底物是基于EV71上2C-3A蛋白序列设计。酶解位点为谷氨酰胺与甘氨酸之间的肽键。多肽的N端连接Dabcyl基团，C端连接Edans基团。

[0026] Dabcyl和Edans两基团靠近时发生荧光催灭，不显示荧光。当多肽被降解后，两基团分离，在336nm波长光激发下，可在490nm处检测到荧光。

[0027] 表1 荧光多肽底物

[0028]

[0029] 2方法步骤：蛋白酶活力测定实验

[0030] 2.1：酶活性检测

[0031] 2.1.1酶活反应体系如下：

[0032] 3C蛋白2ul(0.5uM)；

[0033] 多肽底物5ul(10uM)；

[0034] 反应buffer液(25mM Tris-HClpH 8.0,200mM NaCl)13ul。

[0035] 2.1.2酶活测定方法

[0036] 多肽底物在336nm波长激发下，获得其在490nm处的荧光强度值A(表示未降解时的荧光强度)。将3C蛋白多肽底物加入到反应buffer液后，混匀反应30min后，倒入玻璃比色皿中，在336nm波长激发下，获得其在490nm处的荧光强度值B(经降解后的荧光强度)。在上述反应体系中加入一定浓度的待检测化合物，并重复以上步骤操作，获得化合物存在时的荧光强度C，通过比较A,B,C三值大小，确定化合物对3C蛋白酶的酶活性的影响。

[0037] 2.1.3 酶活测定原理

[0038] 多肽的N端连接Dabcyl基团，C端连接Edans基团。Dabcyl和Edans两基团靠近时发生荧光催灭，不显示荧光。当多肽被逐渐被3C蛋白酶降解后，两基团分离，在336nm波长光激发下，可在490nm处检测到荧光，并且随着降解的加速荧光逐渐变强直至反应完全。通过比较评价受试样品对反应产物荧光强度的影响，进而确定其是否通过抑制3C蛋白酶活性发挥抗病毒药效。

[0039] 2.2：实验结果

[0040] 2.2.1抑制剂芦平曲苇(Rupintrivir)对3C蛋白降解底物2C-3A的酶活抑制[0041] 分别取0.5uM 3C蛋白加入到含多肽底物的反应体系中，混匀反应30min中后测定336nm波长激发下，在490nm处的荧光强度，根据以上实验方法，分别检测有无5uM抑制剂芦平曲苇存在时的荧光强度，作图。

[0042] 结果如图1所示，由图可知，在无抑制剂芦平曲苇存在时，3C蛋白不受到抑制，可降解多肽底物，可检测到较强的荧光。在有5uM抑制剂芦平曲苇存在时，3C蛋白受到抑制，不降解多肽底物，几乎检测不到荧光。