一种低聚木糖含量的检测方法

摘要

本发明涉及分析化学领域，特别涉及一种低聚木糖含量的检测方法。该检测方法包括：取低聚木糖供试品，水解，获得水解后的低聚木糖供试品，采用HPLC进行检测，HPLC的色谱条件为：采用糖柱或氨基柱，以纯化水或乙腈水溶液作为流动相进行等度洗脱，根据HPLC检测结果，获得低聚木糖含量。本发明可排除其它功能糖纤维素的干扰，能够准确测定低聚木糖的含量；本发明检测方法通过对低聚木糖的含量测定方法进行线性、精密度试验、回收率试验，均符合GB/T 27404‑2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求，证明该检测方法科学有效，能对低聚木糖的含量测定起到质量控制的目的。

权利要求

1.一种低聚木糖含量的检测方法，其特征在于，取样品与无水乙醇混合，超声提取，无水乙醇补足减失质量，离心，取上清液，干燥，加水溶解，得到低聚木糖供试品；

取所述低聚木糖供试品，水解，获得水解后的低聚木糖供试品，采用HPLC进行检测，所述HPLC的色谱条件为：采用钙型糖柱，以纯化水进行等度洗脱，根据HPLC检测结果，获得低聚木糖含量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述超声提取的时间为10～20min。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述水解为：加入硫酸，在100～120℃下水解90～120min，冷却，用10％氢氧化钠调节pH值至6.5～7.5。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述低聚木糖与硫酸的质量比为1:(20～50)。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述HPLC检测的流速为0.3～0.6mL/min。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述HPLC检测的柱温为60～80℃。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述HPLC检测的检测池温度为50～70℃。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述HPLC检测的进样量为10～80μL。

说明书

一种低聚木糖含量的检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及分析化学领域，特别涉及一种低聚木糖含量的检测方法。

背景技术

[0002] 便秘是临床常见的复杂症状，而不是一种疾病，主要是指排便次数减少、粪便量减少、粪便干结、排便费力等。导致便秘症状的原因很多。便秘在人群中的患病率高达27％，可以影响各年龄段的人。女性多于男性，老年多于青、壮年。因便秘发病率高、病因复杂，患者常有许多苦恼，便秘严重时会影响生活质量。

[0003] 低聚木糖作为一种新兴的功能性食品配料，因具有优良的加工特性和多种生理调节功能，被广泛应用于各种功能性食品中。低聚木糖(xylo-oligosaccharides)又称木寡糖，是由2～7个木糖残基以β-1，4糖苷键结合而构成的低聚糖，其组成又以木二糖和木三糖为主。低聚木糖能够选择性的促进肠道双歧杆菌等有益菌的增殖，使其成为肠道优势菌群，调节肠道微生态平衡，促进肠道健康。双歧杆菌是人体肠道内的正常栖居的菌群，它能够选择性的代谢低聚木糖产生大量短链脂肪酸，相反，肠道中的葡萄球菌、大肠杆菌和许多梭状芽孢杆菌都不能利用低聚木糖。双歧杆菌代谢低聚木糖产生的短链脂肪酸主要是乳酸和醋酸，能够降低肠道的pH值，抑制了其它有害菌的繁殖，使人体内的吲哚、酚、氨和尸胺等有害代谢物质明显减少，从而降低了人体患结肠癌等疾病的机率。同时，肠道酸性环境的改善还能刺激肠道蠕动，增加粪便湿润度，促进排便，从而防止便秘发生，减少宿便对便秘患者带来的危害，同时，低聚木糖通过调节肠道菌群对腹泻症状也有一定的缓解作用，因而它是一种具有通便和缓解腹泻的双向调节剂。

[0004] 目前，低聚木糖已经被广泛应用于各种医药制剂、口服液、食品和保健品中，其分离和纯化是低聚木糖结构分析的关键。因为低聚木糖自身组成(低聚木糖中不同小聚体间分子量相差较小)、连接、衍生化、微观不均一性等方面的高度复杂性，使其检测具有很大困难。选择合适的方法，对收集到的混合糖链进行分离，是一项摸索性很强的工作。测定低聚木糖的方法很多，如薄层色谱法、气相色谱法、高效毛细管电泳和高效液相色谱法。其中，目前最常用且效果最好的为高效液相色谱法，其液相色谱不受样品挥发度和热稳定性的限制。只要被分析物质在流动相溶剂中有一定溶解度，便可以分析。在常温下即可进行柱分离，毋须衍生化。特别对热稳定低的淀粉糖而言，该分析方法尤为适用。高效液相色谱对样品的回收比较容易，且是定量的，这对任何规模的制备目的特别有利。

[0005] 国标GB/T 23747-2009公开了一种检测低聚木糖含量的方法。该方法基于低聚木糖组分可溶于水，并在一定的稀硫酸水解条件下转化成木糖，同时与水解生成的木糖之间存在相对固定的系数关系的特性，检测其含量。具体方法为：采用稀硫酸水解法将样品中的低聚糖转化成木糖(单糖)。由于低聚木糖在水解过程中β-l,4-糖苷键断裂与水分子结合生成糖苷羟基，因此生成的木糖含量比水解前的木糖含量高。用“平均转化系数”表示水解生成的木糖与水解前的低聚木糖含量之比，其数值因低聚木糖的聚合度而异，均值约为1.06(以木二糖计)。采用高效液相色谱法定量测定样品中原有木糖的质量含量和样品中低聚木糖经稀酸水解后的木糖的质量含量，二者之差除以低聚木糖和木糖的平均转换系数即得到样品中低聚木糖的质量含量。由于色谱柱的分离性质导致木糖的目标峰会受到杂质峰干扰，分离度很难达到要求，且前处理过程会影响木糖的水解量，导致检测结果偏高。

[0006] 《保健食品功效成分检测方法》中公开了一种口服液中低聚木糖的高效液相色谱测定法。其方法为：前处理的原理是用60％(V/V)乙醇沉淀杂质，然后进行酸水解，使低聚木糖水解成木糖，用高效液相色谱法测定，氨基柱分离，流动相为75％乙腈水。此方法的样品前处理应用于保健品中低聚木糖的检测时，会影响木糖的水解量，导致分析结果偏高。由于使用硅胶键合氨基柱分离，此色谱柱在分离分析的过程中，会受到明显的溶剂效应影响，导致木糖峰型较差，且氨基柱的填料会受到极性溶剂的消耗，柱子使用寿命较短，柱效下降较快。

[0007] 同时，针对胃肠道的保健产品配方除了含有低聚木糖之外，还加入了其他的纤维素多糖类物质，复配促进增效。在这种情况下，其他的纤维素多糖类物质也会影响低聚木糖含量的检测。目前还未有公开的检测方法能够准确检测低聚木糖的含量。

发明内容

[0008] 有鉴于此，本发明提供了一种低聚木糖含量的检测方法。该检测方法可排除其它功能糖纤维素的干扰，能够准确测定低聚木糖的含量；通过对低聚木糖的含量测定方法进行线性、精密度试验、回收率试验，均符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求，证明该检测方法科学有效，能对低聚木糖的含量测定起到质量控制的目的。

[0009] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0010] 本发明提供了一种低聚木糖含量检测方法，取低聚木糖供试品，水解，获得水解后的低聚木糖供试品，采用HPLC进行检测，HPLC的色谱条件为：

[0011] 采用糖柱或氨基柱，以纯化水或乙腈水溶液作为流动相进行等度洗脱，根据HPLC检测结果，获得低聚木糖含量。

[0012] 作为优选，低聚木糖供试品的制备方法为：取样品与无水乙醇混合，超声提取，无水乙醇补足减失质量，离心，取上清液，干燥，加水溶解，得到低聚木糖供试品。

[0013] 在本发明中，用无水乙醇溶解样品，使样品中其它功能糖纤维素等干扰物质进行有效的沉淀分离，可排除干扰，准确测定低聚木糖的含量。

[0014] 作为优选，超声提取的时间为10～20min。

[0015] 在本发明提供的一些实施例中，超声提取的时间为15min。

[0016] 作为优选，糖柱为钙型糖柱，流动相为纯化水。

[0017] 本发明采用钙型糖柱和纯化水的HPLC体系进行目标峰分离，此体系稳定，重现性好。

[0018] 在本发明提供的一些实施例中，钙型糖柱长300mm，内径7.8mm。

[0019] 在本发明提供的一些实施例中，钙型糖柱为phenomenex(菲罗门)Rezex RCM-Monosaccharide Ca2+，8μm，300*7.8mm。

[0020] 作为优选，糖柱的交联度为8％。

[0021] 在本发明提供的另一些实施例中，钙型糖柱为Bio-Rad Aminex HPX-87C钙型，9μm，300*7.8mm。

[0022] 在本发明提供的一些实施例中，氨基柱为Waters Nova-Pak，4μm，250mm*3.9mm。

[0023] 在本发明提供的一些实施例中，水解为：加入硫酸，在100～120℃下水解90～120min，冷却，调节pH值至6.5～7.5。

[0024] 作为优选，水解为：加入硫酸，在110℃下水解90min，冷却，用10％氢氧化钠调节pH值至7。

[0025] 作为优选，在水解过程中，低聚木糖与硫酸的质量比为1:(20～50)。

[0026] 优选地，在水解过程中，低聚木糖与硫酸的质量比为1:(24～28)。

[0027] 本发明优化了水解低聚木糖的硫酸添加量和水解后pH值，使样品溶液的盐浓度控制在适合的范围，既保证了低聚木糖的完全水解，又保证了将色谱柱的消耗减至最低，同时保证了盐峰与目标峰有足够的分离度。

[0028] 作为优选，HPLC检测的流速为0.3～0.6mL/min。

[0029] 在本发明提供的一些实施例中，HPLC检测的流速为0.5mL/min。

[0030] 作为优选，HPLC检测的柱温为60～80℃。

[0031] 在本发明提供的一些实施例中，HPLC检测的柱温为65℃。

[0032] 作为优选，HPLC检测的检测池温度为50～70℃。

[0033] 在本发明提供的一些实施例中，HPLC检测的检测池温度为60℃。

[0034] 作为优选，HPLC检测的进样量为10～80μL。

[0035] 在本发明提供的一些实施例中，HPLC检测的进样量为60μL。

[0036] 作为优选，HPLC检测的运行时间为30～60min。

[0037] 在本发明提供的一些实施例中，HPLC检测的运行时间为30min。

[0038] 作为优选，乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为80:20。

[0039] 本发明提供了一种低聚木糖含量的检测方法。该检测方法包括：取低聚木糖供试品，水解，获得水解后的低聚木糖供试品，采用HPLC进行检测，HPLC的色谱条件为：采用糖柱或氨基柱，以纯化水或乙腈水溶液作为流动相进行等度洗脱，根据HPLC检测结果，获得低聚木糖含量。本发明至少具有如下优势之一：

[0040] 本发明可排除其它功能糖纤维素的干扰，能够准确测定低聚木糖的含量；

[0041] 本发明检测方法通过对低聚木糖的含量测定方法进行线性、精密度试验、回收率试验，均符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求，证明该检测方法科学有效，能对低聚木糖的含量测定起到质量控制的目的。

附图说明

[0042] 图1示木糖对照品的图谱；

[0043] 图2示样品水解前图谱；

[0044] 图3示样品水解后图谱；

[0045] 图4示木糖浓度与响应值线性关系图。

具体实施方式

[0046] 本发明公开了一种低聚木糖含量的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0047] 本发明提供的低聚木糖含量检测方法中所用原料药或辅料均可由市场购得。

[0048] 仪器与设备：高效液相色谱仪(带示差折射光检测器)；电子天平(感量0.1mg)；超声波设备仪。

[0049] 试剂：纯化水；10％氢氧化钠溶液：称取10.0g氢氧化钠溶于90mL纯化水；12％硫酸溶液；木糖标准液(来源：中检所，批号：111508-200404，纯度：100％)；pH试纸；无水乙醇。

[0050] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0051] 实施例1～3低聚木糖含量的检测

[0052] 液相色谱条件：

[0053] 表1本发明实施例1～3的色谱条件

[0054]

[0055] 2、对照品贮备液的配制：

[0056] 称取木糖对照品50mg，加纯化水超声溶解后用纯化水定容至10mL容量瓶中，配成浓度为5.0mg/mL的标准储备液，于4℃避光保存。

[0057] 3、标准工作曲线绘制：

[0058] 分别取上述标准储备液0.04mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL至10mL容量瓶中，稀释成浓度为0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.40mg/mL的标准供试液，浓度由低到高分别进样测试并绘制出工作曲线。

[0059] 4、试样制备：

[0060] 精密称取样品650±50mg(试验样品为：含低聚木糖的清畅粉，低聚木糖的理论含量为8.1％，约相当于0.10mg/mL标准品浓度的量)于50mL容量瓶中，加无水乙醇超声10～20min(实施例1超声15min，实施例2超声10min，实施例3超声20min)后用无水乙醇定容至刻度，摇匀，转移至50mL离心管中8000R/min离心5min，取上清液10mL于圆底烧瓶中，65±5℃减压蒸干，最后加水10mL溶解，为供试液A，过0.45μm滤膜，上机测定。

[0061] 精密量取5mL供试液A于50mL比色管中，加入1.0mL 12％的硫酸溶液，塞盖，轻轻摇匀，置电热鼓风烘箱110℃加热90min，取出冷却，用10％氢氧化钠溶液调节pH至中性，用纯化水定容至50mL刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，得样品供试液B，上机测定。

[0062] 5、结果计算：

[0063] 试样中的低聚木糖按以下公式计算：

[0064] (1)试样水解前：

[0065]               式I

[0066] 式I中：X1—样品供试液A中木糖的含量，％；

[0067] K—100，单位转换系数；

[0068] C样1—样品中木糖的质量浓度，mg/mL；

[0069] M样—样品的称样量，mg；

[0070] V样1—样品的稀释体积，mL。

[0071] (2)试样水解后：

[0072]                    式II

[0073] 式II中：X2—样品供试液B中木糖的含量，％；

[0074] K—100，单位转换系数；

[0075] C样2—样品中木糖的质量浓度，mg/mL；

[0076] M样—样品的称样量，mg；

[0077] V样2—样品的稀释体积，mL。

[0078] (3)试样中低聚木糖的计算公式：

[0079]             式III

[0080] 式III中：X—样品中低聚木糖的含量，％；

[0081] X2—样品供试液B中木糖的含量，％；

[0082] X1—样品供试液A中木糖的含量，％；

[0083] 1.06—低聚木糖和木糖的平均转化系数。

[0084] 6、试验结果：

[0085] 木糖对照品的图谱见图1，样品水解前图谱见图2，样品水解后图谱见图3。样品中低聚木糖含量检测结果见表2。

[0086] 表2实施例1低聚木糖含量检测结果

[0087]

[0088] 注：清畅粉的低聚木糖理论值为8.10％。

[0089] 实施例4线性范围确认

[0090] 根据实施例1检测方法获得标准品的试验数据，见表3：

[0091] 表3标准品试验数据

[0092]

[0093] 以浓度C为纵坐标，峰面积A为横坐标，绘制标准工作曲线，如图4所示。

[0094] 线性评价：相关系数R2为0.999，所以用该方法间接测定低聚木糖的含量，在浓度为0.0378mg/mL至0.4536mg/mL之间呈现良好的线性，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求【GB/T 27404-2008要求相关系数R2≥0.99】。

[0095] 实施例5精密度试验

[0096] 试验方法：称取6份样品，按实施例1试样制备方法处理样品，检测样品含量，计算其RSD(％)。试验数据见下表：

[0097] 表4精密度试验数据

[0098]

[0099] 结论：6份样品含量的RSD为1.3％，表明该方法有较好的精密度，符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求【GB/T27404-2008要求RSD(％)≤1.3％】。

[0100] 实施例6回收率试验

[0101] 试验方法：精密称取600±50mg的样品(试验样品为：含低聚木糖的清畅粉)6份，分成2组，每组3份样品，置于50mL容量瓶中，加适量无水乙醇超声15min溶解，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，转移至50mL离心管中8000R/min离心5min，取上清液10mL于圆底烧瓶中，65±5℃减压蒸干，最后加水10mL溶解。精密量取5.0mL至50mL比色管中，于每一组样品中分别精密加入相当于木糖3.24mg，4.05mg的标准贮备液，加入1.0mL的12％硫酸溶液，塞盖，轻轻摇匀，置电热鼓风烘箱110℃加热90min，取出冷却，用10％氢氧化钠溶液调节PH至中性，用纯化水定容至50mL刻度，摇匀过0.45μm滤膜，得样品加标液，待测。

[0102] 试验数据如下：

[0103] 表5回收率试验结果表

[0104]

[0105] 注：测得对照品投入量＝加标样品测得量-样品测得量；

[0106] 回收率(％)＝测得对照品投入量/理论加标量。

[0107] 试验结论：水解木糖加标平均回收率为：99.56％，相对标准偏差(RSD)分别为2.0％，符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求【GB/T 27404-
2008要求回收率为95％～105％】。

[0108] 结论：通过对实施例1低聚木糖的含量测定方法进行线性、精密度试验、回收率试验，均符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求，证明测定方法科学有效，能对低聚木糖的含量测定起到质量控制的目的。

[0109] 采用实施例2、3的检测方法检测低聚木糖含量，进行线性、精密度试验、回收率试验，均符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求，证明实施例2、3测定方法科学有效，能对低聚木糖的含量测定起到质量控制的目的。

[0110] 对比例1低聚木糖含量检测

[0111] 样品：实施例1中同批次清畅粉。

[0112] 方法：GB/T 23747-2009检测方法。

[0113] 试验数据：

[0114] 表6 GB/T 23747-2009检测结果

[0115]

[0116] 对比例2低聚木糖含量检测

[0117] 样品：实施例1中同批次清畅粉。

[0118] 方法：参照罗珍的《保健食品功效成分检测方法》——口服液中低聚木糖的高效液相色谱测定法。

[0119] 试验数据：

[0120] 表7《保健食品功效成分检测方法》检测结果

[0121]

[0122] 方法对比说明：

[0123] 含量数据分析：对比例1的平均检测含量与理论值的相对偏差为11.6％，对比例2的平均检测含量与理论值的相对偏差为6.3％，实施例1的平均检测含量与理论值的相对偏差为0.4％，试验数据表明本发明的准确度最高，对比例2次之，对比例1准确度最差。

[0124] 精密度分析：对比例1的RSD为7.8％，对比例2的RSD为8.3％，实施例1的RSD为1.3％，试验数据表明本发明方法的精密度最高，对比例1次之，对比例2精密度最差。

[0125] 按对比例1GB/T 23747-2009测定，由于色谱柱的分离性质导致木糖的目标峰会受到杂质峰干扰，分离度很难达到要求，且前处理过程会影响木糖的水解量，导致检测结果偏高。

[0126] 对比例2为专门针对液体试样(口服液)开发的一种低聚木糖检测方法，其方法前处理的原理是用60％(V/V)乙醇沉淀杂质，然后进行酸水解，使低聚木糖水解成木糖，用高效液相色谱法测定，氨基柱分离，流动相为75％乙腈水。此方法的样品前处理应用于清畅粉中低聚木糖的检测时，会影响木糖的水解量，导致分析结果偏高。由于使用硅胶键合氨基柱分离，此色谱柱在分离分析的过程中，会受到明显的溶剂效应影响，导致木糖峰型较差，且氨基柱的填料会受到极性溶剂的消耗，柱子使用寿命较短，柱效下降较快。

[0127] 可见，本发明提供的低聚木糖测定方法的稳定性和重现性都达到方法学验证要求，可准确检测低聚木糖含量。

[0128] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。