P19/Ebi3复合物及其多克隆抗体在系统性红斑狼疮诊治中的应用

摘要

本发明公开了P19/Ebi3复合物及其多克隆抗体在系统性红斑狼疮诊断、治疗中的用途。实验证明，与正常小鼠相比，系统性红斑狼疮小鼠中的P19/Ebi3复合物高水平表达，且使用抗P19/Ebi3蛋白的多克隆抗体可以降低小鼠体内抗体的表达水平及免疫细胞的数目，表明可以通过制备抗P19/Ebi3的抗体来治疗系统性红斑狼疮，因此P19/Ebi3复合物及其抑制剂用于制备诊治系统性红斑狼疮药物，具有良好的开发前景。

权利要求

1.P19/Ebi3异二聚体复合物在制备抑制B细胞向浆细胞分化药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的浆细胞是由B细胞分化的GL7+浆细胞。

3.P19/Ebi3异二聚体复合物在制备诊断系统性红斑狼疮产品中的应用。

4.P19/Ebi3异二聚体复合物抑制剂在制备治疗系统性红斑狼疮药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的P19/Ebi3异二聚体复合物抑制剂是特异性识别和/或结合P19/Ebi3异二聚体的抗体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗体是多克隆抗体。

说明书

P19/Ebi3复合物及其多克隆抗体在系统性红斑狼疮诊治中的

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及P19/Ebi3复合物及其多克隆抗体在系统性红斑狼疮诊断、治疗中的用途。

背景技术

[0002] 系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)是一种严重威胁人类健康与生命的自身免疫性疾病，有较高的致死率和致残率。其病因与发病机制尚不明了，普遍认为是环境因素作用于一定遗传背景的机体(包括组织相容性、细胞因子、细胞因子受体等表达的不同型别)而形成的结果。其免疫病理特征是体内产生多种高低度、致病性自身抗体，同时淋巴细胞凋亡。释放出大量细胞核内容物及核糖小体而成为自身抗原；抗原抗体结合形成免疫复合物，免疫复合物的沉积可导致靶细胞损伤和炎症，导致各个组织和器官发生病变。在该病理过程中，B细胞处于高度活化状态，且该过程与T细胞密切相关，有T细胞依赖性。

[0003] 复杂的细胞因子网络调节T细胞和B细胞的生长、分化和功能，这些细胞因子可以分为两大类：Th1型(主要诱导细胞免疫)和Th2型(主要促进抗体产生)。白细胞介素12(IL-12)在细胞因子网络调节中起着重要的作用，它主要由单核巨噬细胞分泌产生。IL-12家族由一个α-链(P19，P28或P35)和一个β-链(P40或Ebi3)异二聚体亚基组成(图1)，其与一些自身免疫疾病，尤其是Th1细胞介导的自身免疫病的发病有关。

[0004] 目前对于系统性红斑狼疮的临床诊断主要依靠临床表现、实验室检查、组织病理学和影像学检查。由于SLE临床表现病症因人而异，有时会出现误诊。而治疗系统性红斑狼疮的常规方法是使用抗疟疾药、抗炎药和免疫抑制药，当症状难以控制时，对非甾体抗炎剂补充以皮质激素；虽然在控制病情、阻止疾病发展中有显著作用，但多有明显不良反应，且对部分患者疗效不佳。B细胞和T细胞在SLE的发病机制中起着重要的作用，针对免疫细胞的生物学疗法将成为治疗SLE的焦点。

发明内容

[0005] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于系统性红斑狼疮诊治的复合物P19/Ebi3及其多克隆抗体。相比传统的系统性红斑狼疮的诊断和治疗方法，使用多克隆抗体与导致自体抗体过度产生的病理性免疫响应相互作用或将其纠正的特异性治疗将更有优势，如具有较高的特异性与准确性，较低的副作用，从而实现治愈系统性红斑狼疮和/或在长期基础上改善患者的生活品质的病因性治疗。

[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0007] 本发明提供了一种分离的P19/Ebi3复合物。

[0008] 进一步，上面所提到的复合物是由P19和Ebi3两个亚基组成的。

[0009] 进一步，上面所提到的P19亚基包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白，或其保守性变异蛋白。

[0010] 进一步，上面所提到的Ebi3亚基包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白，或其保守性变异蛋白。

[0011] 进一步，上面所述的亚基是由多核苷酸编码的，所述的P19亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述的Ebi3亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

[0012] 本发明提供了一种重组载体，它含有上面所述的多核苷酸序列。

[0013] 进一步，所述的重组载体中还含有与所述的多核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。

[0014] 本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。

[0015] 病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。

[0016] 真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEFBos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、pReceiver-Lv18表达载体、pZE-LV122X表达载体或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。

[0017] 优选地，所述表达载体为真核表达载体。优选地，所述真核表达载体为pReceiver-Lv18和pEZ-LV122X表达载体。

[0018] 本发明提供了一种宿主细胞，它含有所述的重组载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

[0019] 优选地，所述宿主细胞为CHO细胞。

[0020] 本发明提供了一种P19/Ebi3复合物的制备方法，它包括下列步骤:

[0021] (a)培养所述的宿主细胞；

[0022] (b)从培养物中分离出所述的复合物。

[0023] 本发明提供了一种抗体，所述抗体特异性识别和/或结合所述的复合物。

[0024] 优选地，所述的抗体为多克隆抗体。

[0025] 本发明提供了一种制备抗体的方法，所述方法包括：以所述的复合物免疫动物，从免疫后的动物体内分离出所述复合物的特异性抗体。

[0026] 优选地，所述抗体为多克隆抗体，用以下所述方法制备：

[0027] 用所述的复合物与完全弗氏佐剂混合(按照体积比1:2～2:1混合，优选地按照体积比1:1混合)后免疫小鼠，2周后用所述的复合物与不完全弗氏佐剂混合(按照体积比1:2～2:1混合，优选地按照体积比1:1混合)后强化免疫小鼠，按照相同的方式再次强化免疫2-3次，1-2周后从血清中分离出多克隆抗体。

[0028] 本发明提供了P19/Ebi3复合物在制备抑制B细胞向浆细胞分化药物中的应用。

[0029] 进一步，所述浆细胞为B细胞分化的(GL7+)浆细胞。

[0030] 进一步，P19/Ebi3复合物的特异性抗体、基于P19/Ebi3复合物的肿瘤疫苗、用于抑制P19/Ebi3复合物活性的蛋白质，抑制P19/Ebi3复合物活性的化合物。

[0031] 本发明提供了一种P19/Ebi3复合物在制备诊断系统性红斑狼疮产品中的应用。

[0032] 进一步，上面所提到的诊断产品包括：通过免疫检测、免疫共沉淀、ELISA或芯片来检测P19/Ebi3复合物的水平以诊断系统性红斑狼疮的产品。

[0033] 进一步，所述用免疫检测来诊断系统性红斑狼疮的产品包括：与P19/Ebi3复合物特异性结合的抗体；所述用免疫共沉淀来诊断系统性红斑狼疮的产品包括：与P19/Ebi3复合物中两个亚基同时特异性结合的抗体；所述用ELISA来诊断系统性红斑狼疮的产品包括：ELISA试剂盒；ELISA试剂盒包括与P19/Ebi3复合物特异性结合的抗体；所述用芯片来诊断系统性红斑狼疮的产品包括：蛋白芯片；其中蛋白芯片包括与P19/Ebi3复合物特异性结合的抗体。

[0034] 优选地，所述产品包括试剂盒和芯片。

[0035] 本发明提供了P19/Ebi3复合物抑制剂在制备治疗系统性红斑狼疮药物中的应用。

[0036] 进一步，本发明所述抑制剂包括：P19/Ebi3复合物的特异性抗体、基于P19/Ebi3复合物的肿瘤疫苗、用于抑制P19/Ebi3复合物活性的蛋白质，抑制P19/Ebi3复合物活性的化合物。

[0037] 进一步，所述P19/Ebi3复合物的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述P19/Ebi3复合物的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与P19/Ebi3复合物的结合能力即可。

[0038] 优选地，所述P19/Ebi3复合物的特异性抗体为多克隆抗体。

[0039] 进一步，所述的药物包括所述的抗体或其活性片段。

[0040] 进一步，本发明的药物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；
表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。

[0041] 本发明的药物还可与其他治疗系统性红斑狼疮的药物联用，多种药物联合使用可以大大提高治疗的成功率。

[0042] “P19/Ebi3复合物”包括P19/Ebi3复合物以及P19/Ebi3复合物的任何功能等同物。所述功能等同物包括P19/Ebi3复合物保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与P19/Ebi3的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

[0043] 优选地，P19/Ebi3复合物是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

[0044] (1)由序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0045] (2)将SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

[0046] (3)与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

[0047] 在本发明的具体实施方案中，所述P19/Ebi3复合物是具有SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白质。

[0048] 通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

[0049] 通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质，只要所得的蛋白保留P19/Ebi3复合物的生物学活性即可。

[0050] 本发明的P19/Ebi3复合物也包括对SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留P19/Ebi3复合物的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

[0051] 本发明的优点和有益效果：

[0052] 本发明首次发现了P19/Ebi3复合物及其与系统性红斑狼疮的关系，通过检测受试者中P19/Ebi3复合物的水平，可以判断其是否患有系统性红斑狼疮，从而指导从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

[0053] 本发明发现了P19/Ebi3复合物特异性抗体可以治疗系统性红斑狼疮，相比现有的治疗手段，该方法准确性高、副作用低，有利于实现治愈系统性红斑狼疮和/或在长期基础上改善患者的生活品质的病因性治疗。

附图说明

[0054] 图1显示IL-12家族分子亚基配对情况；

[0055] 图2显示了人IL-12家族细胞因子亚基P19和Ebi3可组成复合物；

[0056] 图3显示了小鼠IL-12家族细胞因子亚基P19和Ebi3可组成P19/Ebi3复合物；图4显示了小鼠P19/Ebi3复合物的纯化和质谱鉴定；左图显示了纯化蛋白的考马斯亮蓝染色；右图显示了纯化蛋白的质谱分析；

[0057] 图5显示了小鼠P19/Ebi3复合物生物活性研究；左图免疫印迹分析了纯化的Ebi3-Flag/P19-His能刺激B细胞中STAT1的磷酸化；右图免疫印迹分析了纯化的Ebi3-Flag/P19-His能刺激B细胞中STAT3的磷酸化；

[0058] 图6显示了LPS活化的B细胞高表达P19/Ebi3；

[0059] 图7显示了LPS活化的B细胞分泌高水平的P19/Ebi3；左图显示了使用ELISA方法检测LPS刺激的B细胞分泌抗体的情况；右图显示了使用双抗夹心ELISA方法检测LPS刺激的B细胞分泌抗体的情况；

[0060] 图8显示了向浆细胞分化(GL7+)的B细胞高表达P19/Ebi3；

[0061] 图9显示了SLE小鼠模型中向浆细胞分化(GL7+)的B细胞和(CD138+)细胞高表达P19/Ebi3；

[0062] 图10显示了P19/Ebi3多克隆抗体的鉴定；

[0063] 图11显示了抗P19/Ebi3多克隆抗体降低系统性红斑狼疮小鼠尿蛋白；

[0064] 图12显示了抗P19/Ebi3多克隆抗体降低系统性红斑狼疮小鼠脾肿大；

[0065] 图13显示了抗P19/Ebi3多克隆抗体降低系统性红斑狼疮小鼠抗体水平；

[0066] 图14显示了抗P19/Ebi3多克隆抗体降低系统性红斑狼疮小鼠淋巴细胞数目。

[0067] 具体的实施方式

[0068] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。本发明的实施例仅用于解释本发明而不用于限制本发明的范围。

[0069] 下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0070] 下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0071] 实施例1人IL-12家族细胞因子亚基P19和Ebi3可组成P19/Ebi3复合物

[0072] 一、材料

[0073] 人Ebi3蛋白购自Origene公司(货号TP723769)、人P19蛋白购自Origene公司(货号TP309680)、抗Ebi3抗体购自SantaCruzBiotech公司(货号sc-32869)、抗P40抗体购自SantaCruzBiotech公司(货号sc-7926)、抗P19抗体购自SantaCruzBiotech公司(货号sc-50303)、抗c-Jun抗体购自SantaCruzBiotech公司(货号sc-44)

[0074] 二、方法

[0075] 1、免疫沉淀

[0076] 1)Agrose-proteinA/G清洗：取60μl Agrose-proteinA/G到EP管中(剪枪头)，加入500μl预冷的PBS，4℃、5000rpm离心2min(洗两遍)。

[0077] 2)抗体和Agrose-proteinA/G预孵育：将1μg抗Ebi3抗体、抗p40抗体、抗P19抗体、抗c-Jun抗体分别加入到洗好的15μl Agrose-proteinA/G中，4℃翻转1h。

[0078] 3)将5ng/ml人Ebi3蛋白与5ng/ml人P19蛋白在PBS中混匀。

[0079] 4)将1μg抗Ebi3抗体、抗P40抗体、抗P19抗体、抗c-Jun抗体分别与30μl proteinA/G-beads加入到步骤3)所述的混合液中，4℃缓慢摇晃孵育过夜。

[0080] 5)抗原抗体孵育：步骤4)后进行离心(5000rpm，2min)，将Ebi3抗体、P40抗体、P19抗体、c-Jun抗体分别加入到含预孵育好的相应抗体和Agrose-proteinA/G的EP管中，4℃孵育过夜。

[0081] 6)洗IP复合物：5000rpm，离心2min，吸掉上清，加入IP裂解液(一般不用加抑制剂)500μl，弹匀后4℃摇转5min，重复6次。

[0082] 7)加入SDS 60μl检测。

[0083] 2、免疫印迹分析

[0084] 1)配胶

[0085] 表1 10％分离胶和4％浓缩胶

[0086]  10％分离胶 4％浓缩胶
超纯水 4.85ml 3.16ml
40％Acr/Bic(37.5:1) 2.5ml 0.5ml
1.5mol/LTris·HCl(PH8.8) 2.5ml ---
0.5mol/LTris·HCl(PH6.8) --- 1.26ml
10％SDS 100μl 50μl
10％AP(过硫酸铵) 50μl 25μl
TEMED 5μl 5μl

[0087] 加TEMED后，立即混匀即可灌胶。

[0088] 先用1ml枪头小心铺10％分离胶，上加少许异丙醇，待分离胶干凝后，盗取异丙醇，用水洗去多余未聚合的胶，滤纸吸干。再铺4％浓缩胶，注意不要产生气泡，斜插上梳子，待胶干后备用，拔去梳子。

[0089] 2)上样

[0090] 取出上样样品至0.5ml离心管中。加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×SDS。(上样总体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度为20μl样品)。上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。

[0091] 加足够的电泳液开始准备上样。用微量加样器贴壁吸取样品，注意不要产生气泡。将加样器针头插至加样孔缓慢加入样品。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。

[0092] 3)电泳

[0093] 100V，溴酚兰走到分离胶底部后，约1.5h后电泳结束。

[0094] 4)转膜

[0095] 小心取下凝胶，把预先在转膜缓冲液中平衡过的滤纸及硝酸纤维素膜切成与凝胶同样大小，按次序叠放在一起，在4℃、100V电压转膜1h，取出硝酸纤维素膜，用1×立春红染液染5min(于脱色摇床上摇)。然后用TBST漂洗至膜发白。

[0096] 5)封闭

[0097] 称取脱脂奶粉1g，用1×TBS溶解到20ml，使脱脂奶粉浓度为5％。将硝酸纤维膜浸在20ml封闭液中，室温摇2h。

[0098] 6)一抗杂交孵育

[0099] 将一抗用含5％脱脂奶粉的1×TBS溶液稀释，使抗体浓度为1:1000；将封闭过的膜放在一抗稀释液中，4℃过夜；而后吸弃一抗稀释液，用1×TBST洗3次，每次5min。

[0100] 7)二抗杂交孵育

[0101] 将辣根过氧化物酶连接的二抗用含5％脱脂奶粉的1×TBS溶液稀释，使浓度为1:2000，并加入辣根过氧化物酶连接的抗生物素抗体(浓度为1:1000)，将膜置于二抗稀释液中，室温振荡孵育1h；而后吸弃二抗稀释液，用1×TBST洗3次，每次5min。

[0102] 8)显影

[0103] 将膜置入10ml LumiGLO溶液中(配方：0.5ml 20×LumiGLO、0.5ml 20×Peroxide、9.0ml Milli-Qwater)，室温轻摇1min，注意避光操作；在暗室中剪下与膜同样大小的胶片，压在暗盒中，约1min；将胶片放在显影液中饭洗1-5min；水冲洗；定影液中洗2-5min；水冲洗，可在相应位置见到目的条带。

[0104] 9)凝胶图像分析

[0105] 将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

[0106] 三、结果

[0107] 实验结果如图2所示，免疫印迹分析发现，人IL-12家族细胞因子亚基P19和Ebi3可组成P19/Ebi3复合物。

[0108] 实施例2小鼠IL-12家族细胞因子亚基P19和Ebi3可组成P19/Ebi3复合物[0109] 一、材料

[0110] 质粒与菌株：

[0111] P19/pReceiver-Lv18、Ebi3/pEZ-LV122X表达质粒，JM109菌株

[0112] 二、方法

[0113] 1、引物设计

[0114] 扩增P19/Ebi3复合物中P19ORF引物

[0115] 正义链：5’-ATGCTGGATTGCAGAGCAGT-3’(SEQ ID NO:5)

[0116] 反义链：5’-GTAAGCTGTTGGCACTAAGG-3’(SEQ ID NO:6)

[0117] 加上EcoRI位点和保护碱基后的正义链：

[0118] 5’-CCGGAATTCATGCTGGATTGCAGAGCAGT-3’(SEQ ID NO:7)

[0119] 加上XhoI位点和保护碱基后的反义链：

[0120] 5’-CCGCTCGAGGTAAGCTGTTGGCACTAAGG-3’(SEQ ID NO:8)

[0121] 扩增P19/Ebi3复合物中Ebi3ORF引物

[0122] 正义链：5’-ATGTCCAAGCTGCTCTTCCT-3’(SEQ ID NO:9)

[0123] 反义链：5’-TCAGGGCTTATGGGGTGCAC-3’(SEQ ID NO:10)

[0124] 加上EcoRI位点和保护碱基后的正义链：

[0125] 5’-CCGGAATTCATGTCCAAGCTGCTCTTCCT-3’(SEQ ID NO:11)

[0126] 加上XhoI位点和保护碱基后的反义链：

[0127] 5’-CCGCTCGAGTCAGGGCTTATGGGGTGCAC-3’(SEQ ID NO:12)

[0128] 2、P19、Ebi3、P19/Ebi3基因克隆与重组质粒的构建

[0129] 1)总mRNA的提取

[0130] 通过过CD11c免疫磁珠(美天旎公司)从9周龄C57BL/6小鼠体内分选出DC细胞，每1×107细胞中加入1ml的TRIZOL，将标本转移到1.5ml的EP管中，在15-30℃放置5min。

[0131] 加入0.2ml的氯仿，剧烈摇晃15s，在15-30℃放置2-3min，2-8℃，12,000g离心15min。

[0132] 将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入0.5ml异丙醇，室温静置10min，2-8℃，12,000g离心10min。

[0133] 去上清，加入1ml 75％乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，2-8℃，12,000g离心5min。

[0134] 用无RNase水或0.5％SDS溶液重悬RNA沉淀，用枪头反复吹打几次，于55-60℃下静置10min。测浓度后-20℃保存。

[0135] 甲醛变性琼脂糖电泳，确定抽提RNA完整性和DNA污染情况。

[0136] 2)RT-PCR扩增P19/Ebi3复合物中P19和Ebi3ORF序列

[0137] 表2 RT反应体系(第一步)：约20min

[0138]  体积
RNA抽提物 5μl
Radome引物 2μl
RNAsin 0.5μl

[0139] 65℃15min后立即放入冰浴

[0140] 表3 RT反应体系(第二步)：约2h

[0141]  体积
RNAsin 0.5μl
10mM dNTP 1μl
5×RT缓冲液 4μl
25mM MgCl2 4μl
AMV逆转录酶 3μl

[0142] 37℃1.5h；94℃5-10min；反应物保存于-20℃或进行PCR

[0143] 表4 PCR反应体系：约4.5h

[0144]  体积
25mM MgCl2 2μl
10×PCR缓冲液 5μl
10mM dNTP 1μl
上下游引物10pmol/μl 2.5μl×2
cDNA模板 2.5μl
ddH2O 34μl
Taq酶 0.5μl
轻质石蜡油 50μl

[0145] 94℃2min，55℃1min，72℃2min

[0146] 94℃45s，55℃40s，72℃1min，30个循环

[0147] 72℃10min，4℃5min。

[0148] -20℃保存或电泳

[0149] 电泳检测P19和Ebi3基因片段

[0150] 3)重组表达载体的构建

[0151] P19/Ebi3复合物中P19和Ebi3ORF通过EcoRI和XhoI酶切位点分别插入到pReceiver-Lv18和pEZ-LV122X载体上

[0152] 表5 EcoRI和XhoI双酶切时间及其体系：

[0153]  体积
EcoRI 1μl
XhoI 1μl
10×Buffer 2μl
质粒或PCR产物 5μl
ddH2O 11μl

[0154] 37℃反应20h，用TAKARA的纯化柱试剂盒纯化双酶切产物。

[0155] 酶切、回收后的PCR产物与载体的连接

[0156] 转化：

[0157] a、全量(10μl)加入至100μl JM109感受态细胞中，冰中放置30min。

[0158] b、42℃加热45s后，再在冰中放置1min。

[0159] c、加入890μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60min。

[0160] d、取100μl铺板。

[0161] e、经PCR和酶切鉴定阳性克隆用于测序。

[0162] 3、小鼠重组P19、Ebi3、P19/Ebi3复合物的诱导表达

[0163] P19/pReceiver-Lv18和Ebi3/pEZ-LV122X表达载体共转染CHO细胞

[0164] 1)将0.5-2×105个细胞接种到24孔培养板中，并加入500μl无抗生素培养基，培养24h。

[0165] 2)把P19/pReceiver-Lv18和Ebi3/pEZ-LV122X加入到50μl无血清Opti-MEMI低血清培养基中(或是其它无血清培养基)进行稀释，并轻轻混匀。

[0166] 3)把轻轻混匀的LipofectamineTM2000取相应的量加入到Opti-MEM培养基中进行稀释，室温下静置5min。

[0167] 4)混合LipofectamineTM2000和DNA的稀释液。轻轻混匀并在室温下静置20min。

[0168] 5)吸去培养板中的培养基，并用无血清培养基洗两次。

[0169] 6)将混合物100μl加入培养孔，并前后摇动培养孔使分布均匀。

[0170] 7)转染24h后将细胞以1:10(或更高的稀释度)转移到新鲜的生长培养基中。

[0171] 8)在选择培养基Puromycin(P19/pReceiver-Lv18载体带有)和Neomycin(Ebi3/pEZ-LV122X载体带有)中共表达P19/Ebi3的CHO细胞。

[0172] 9)共表达P19/Ebi3的CHO细胞于37℃、CO2培养箱中培养48-72h，收集上清用进行蛋白纯化。

[0173] 4、免疫沉淀和免疫印迹分析

[0174] 实验过程如实施例1所述

[0175] 三、结果

[0176] 免疫印迹分析结果如图3所示，小鼠IL-12家族细胞因子亚基P19和Ebi3可组成P19/Ebi3复合物。

[0177] 实施例3小鼠P19/Ebi3复合物纯化和质谱鉴定

[0178] 一、方法

[0179] 1、小鼠Ebi3-Flag/P19-His的共表达

[0180] 实验过程参照实施例2。

[0181] 2、Ebi3-Flag/P19-His的纯化

[0182] 1)镍柱处理

[0183] 将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。

[0184] 2)将10ml上清加到已平衡过的镍柱上，并将过柱的样品重复上样3次，取20μl过柱后的样品，以备跑胶。

[0185] 3、考马斯亮蓝染色

[0186] 1)将纯化后的蛋白进行SDS-PAGE，实验过程如实施例1所述。把凝胶浸泡在固定液中至少30min。

[0187] 2)将固定后的凝胶在热的染色液(0.29g考马斯亮蓝溶解在250ml脱色液中，使用前边搅拌变加热至60℃)中浸泡10min，然后用蒸馏水将凝胶淋洗一次。

[0188] 3)多次变换脱色液(250ml乙醇，80ml冰醋酸，加蒸馏水至1L)，直至凝胶背景脱净，为加快脱色，可略加温度；以上各步骤均放在摇床上操作。

[0189] 4)为了防止凝胶干燥后龟裂，脱去背景色的凝胶在保存液中浸泡30min。然后将凝胶放在玻璃板上，再用保存液浸湿玻璃纸包住凝胶在室温下晾干。

[0190] 4、质谱鉴定

[0191] 二、结果

[0192] 实验结果如图4所示，(左图)尽管有杂蛋白带，P19/Ebi3纯度在70％以上；(右图)质谱鉴定显示P19-His分子量约为18KD，Ebi3-Flag分子量约为36KD，Ebi3-Flag/P19-His分子量约为53.5KD。

[0193] 实施例4小鼠P19/Ebi3复合物可诱导B细胞STAT3和STAT1磷酸化

[0194] 一、材料

[0195] 从CellSignalTechnology公司购买p-STAT1、p-STAT3、p-STAT4、p-STAT5、p-STAT6、STAT1、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6、β-actin(货号分别为9167、9145、4134、9314、9364、9172、4904、2653、9363、9362、4967)

[0196] 二、方法

[0197] 1、Ebi3-Flag、P19-His、Ebi3-Flag/P19-His蛋白的表达和纯化

[0198] 2、B220免疫磁珠分选B细胞

[0199] 1)清洗免疫磁珠

[0200] 在瓶子里重悬免疫磁珠(涡旋不少于30s)；

[0201] 转移适量体积的免疫磁珠到管子里；

[0202] 加入等体积的分离缓冲液或至少1ml，重悬；

[0203] 把管子置于磁体中1min，弃掉上清；

[0204] 把管子从磁体中移开，用和上述步骤中相同体积的分离缓冲液重悬洗过的磁珠。

[0205] 2)准备样品

[0206] 准备单个细胞悬浮液(淋巴器官)，使用分离缓冲液使得细胞的终浓度为1×107个/ml。

[0207] 3)B细胞的分选

[0208] 向管子中加入1ml的细胞，然后加入25μl步骤1)中的免疫磁珠；

[0209] 在4℃孵育20min，置于摇床上轻轻摇晃；

[0210] 把管子置于磁体2min；

[0211] 小心地弃掉上清；

[0212] 把管子从磁体中取出，向其中加入1ml分离缓冲液，吹打2-3次(或涡旋2-3s)，再把该管子置于磁场中2min，小心地弃掉上清；

[0213] 重复上一步至少一次，清洗和磁珠连接的B细胞。

[0214] 3、B细胞的活化反应

[0215] LPS刺激B细胞

[0216] 准备单个B细胞的悬浮液，用RPMI1640完全培养基培养调整B细胞密度为1×106个/ml，加入到96孔板中，加入10ug/ml LPS，37℃培养72-96h。

[0217] 4、免疫印迹分析

[0218] 三、结果

[0219] 实验结果如图5所示，纯化的Ebi3-Flag/P19-His蛋白具有生物学活性，它能有效地刺激B细胞中STAT1、STAT3的磷酸化。

[0220] 实施例5LPS活化的B细胞高表达P19/Ebi3

[0221] 一、材料

[0222] 抗P19抗体购自eBioscience公司(货号50-7023-82)、抗P28抗体购自eBioscience公司(货号12-7285-80)、抗P35抗体购自eBioscience公司(货号50-7352-80)、抗P40抗体购自eBioscience公司(货号12-7123-81)、抗Ebi3抗体购自R&D公司(货号IC18341C)[0223] 二、方法

[0224] 1、LPS刺激B细胞

[0225] 2、阻断Fc受体：(用于消除非特异性的结合染色)

[0226] 使用纯化的FcII/III受体的抗体(CD16/32)，按照1μg/106细胞的用量，在染色缓冲液中4℃孵育15min，PBS清洗后，直接进行下一步染色。

[0227] 3、细胞内因子染色及检测

[0228] 1)固定：加入ICFix/Perm Buffer100μl，混匀，室温孵育20min。

[0229] 2)用1×PermWashBuffer 1ml洗涤1次(2000rpm，10min)，倾倒后滤纸吸干管口液体。

[0230] 3)破膜：加入1×PermWashBuffer 1ml，混匀，4℃孵育45min。

[0231] 4)离心(2000rpm，10min)，倾倒后滤纸吸干管口液体。

[0232] 5)加入细胞因子抗体，4℃孵育45min。

[0233] 6)用1×PermWashBuffer 1ml洗涤1次，倾倒后，加入300μl PBS重悬细胞。

[0234] 7)上机检测。

[0235] 三、结果

[0236] 实验结果如图6所示，LPS活化的B细胞表达少量P28，P35，P40，而高表达P19/Ebi3。

[0237] 实施例6LPS活化的B细胞能分泌高水平的P19/Ebi3

[0238] 一、材料

[0239] 购自SantaCruzBiotech公司的抗Ebi3抗体(货号sc-32869)、抗P40抗体(货号sc-7926)、抗P19抗体(货号sc-50303)、抗P28抗体(货号sc-27490)、抗P35抗体(货号sc-9350)[0240] 二、方法

[0241] 1、B细胞的活化

[0242] 2、ELISA实验

[0243] 1)包被过程(注意设置空白对照,阴性对照)

[0244] 将所用抗原用包被稀释液稀释到适10μg/ml，每孔抗原加入100μl，置于37℃，4h或4℃过夜；可包被BSA溶液或只加包被液作为空白对照。

[0245] 2)封闭酶标反应孔

[0246] 弃去孔内液体，每孔加入200μl封闭液，37℃湿盒封闭6h或4℃过夜，结束后用洗涤液洗涤3-5次，并于吸水纸上轻轻拍干。

[0247] 3)加入待检测样品

[0248] 加一定稀释的待检样品100μl于上述已包被的反应孔中，加PBST作为空白对照。置37℃，孵育45min。然后洗涤3-5次，并于吸水纸上轻轻拍干。

[0249] 4)加入酶标抗体

[0250] 于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度：1:1000以上稀释)100μl。37℃孵育45min，洗涤3次，并于吸水纸上轻轻拍干。

[0251] 5)加入底物液(现用现配)

[0252] 于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μl，37℃，10～30min。

[0253] 6)终止反应

[0254] 于各反应孔中加入2M硫酸50μl，于20min内测定实验结果。

[0255] 7)结果判断

[0256] 用Bio-Rad酶标仪于450nm以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性(数值的大小依具体检测要求而定)。

[0257] 3、双抗夹心ELISA实验

[0258] 参照上述实验步骤。

[0259] 三、结果

[0260] 实验结果如图7所示，(左图)LPS活化的B细胞分泌少量P28，P35，P40，而分泌高水平的P19、Ebi3；(右图)LPS活化的B细胞分泌少量IL-23，IL-27，而分泌高水平P19/Ebi3。

[0261] 实施例7向浆细胞分化(GL7+)的B细胞高表达P19/Ebi3

[0262] 一、方法

[0263] 实验操作参照实施例5的方法。

[0264] 二、结果

[0265] 实验结果如图8所示，从图中我们可以看出向浆细胞分化(GL7+)的B细胞高表达P19/Ebi3。

[0266] 实施例8系统性红斑狼疮(SLE)小鼠模型中向浆细胞分化(GL7+)的B细胞和浆细胞(CD138+)细胞高表达P19/Ebi3

[0267] 一、材料

[0268] 系统性红斑狼疮自发性模式小鼠：雌性MRL/MpJ/lpr/lpr(MRL/lpr)小鼠购自南京模式生物研究所；MRL/MpJ/+/+(MRL/++)小鼠购自医科院基础医学研究所。

[0269] 二、方法

[0270] 向浆细胞分化(GL7+)的B细胞、浆细胞(CD138+)的获取及计数

[0271] 1、系统性红斑狼疮小鼠脾脏细胞的获取

[0272] 1)取小鼠脾脏，放入盛有5ml Hanks液的培养皿中。

[0273] 2)轻轻研压脾脏(顺同一方向)，用吸管吸取脾细胞悬液，放入试管中。

[0274] 3)镜下细胞计数：40倍镜头，观察脾细胞。

[0275] 2、淋巴细胞的分选

[0276] 1)稀释脾细胞(脾细胞:稀释液＝1:2)。

[0277] 2)在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血(Ficoll:稀释脾细胞＝1:2)，20℃，1500rpm，离心30min。

[0278] 3)沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中。

[0279] 4)加足量稀释液充分洗涤，1800rpm离心10min，弃上清。

[0280] 5)重复洗涤一次，1400rpm离心10min，弃上清。

[0281] 6)适量的培养基重悬细胞，即是小鼠脾淋巴细胞悬液。

[0282] 3、淋巴细胞的计数

[0283] 稀释细胞，计数板放到显微镜下进行计数。

[0284] 4、细胞流式技术分析GL7+和CD138+细胞

[0285] 1)在每个流式检测管中加入适量的预稀释好的一抗(荧光标记抗B220、GL7、CD138抗体)；在空白管或同型对照管中加入与抗体相同量的对照试剂。然后各管避光冰浴或在4℃冰箱中孵育30min。

[0286] 2)加入至少2ml CellStainingBuffer，然后350g离心5min后弃去上清液；重复洗涤两次。

[0287] 3)用0.5ml Cell Staining Buffer重悬细胞，冰上孵育3-5min。

[0288] 5、上机检测并分析结果。

[0289] 二、结果

[0290] 实验结果如图9所示，系统性红斑狼疮(SLE)小鼠模型中向浆细胞分化(GL7+)的B细胞和浆细胞(CD138+)细胞及高表达P19/Ebi3的向浆细胞分化(GL7+)的B细胞和浆细胞(CD138+)细胞数目显著升高。

[0291] 实施例9抗P19/Ebi3多克隆抗体制备与鉴定

[0292] 一、方法

[0293] 1、P19/Ebi3的制备与纯化

[0294] 实验操作参照实施例3。

[0295] 2、多克隆抗体的制备

[0296] 1)免疫动物的选择：10只7-9周龄健康雄性Balb/c小鼠。

[0297] 2)免疫原：使用经镍柱纯化的P19/Ebi3复合物。每次免疫100-200μg。

[0298] 3)待小鼠在新环境中培养3～4天后，取0.1ml尾静脉血作为阴性对照。

[0299] 4)小鼠的免疫

[0300] 用纯化的P19/Ebi3复合物与完全弗氏佐剂等体积混合后采用背部多点注射法免疫小鼠，每次注射100μl，2周后用所述的复合物与不完全弗氏佐剂等比例混合后强化免疫小鼠(于上述部位不同点注射)，按照相同的方式再次强化免疫2-3次，1周后尾静脉取血检测抗体效价。

[0301] 5)血清的分离

[0302] 将离心管放置于37℃烘箱中2h，4℃过夜，10000RCF离心10min。在血清中加入NaN3至终浓度0.02％，分装后-20℃保存。

[0303] 6)抗体的纯化(抗原亲和层析)

[0304] 交联：使用Na2CO3-NaHCO3体系，10mg/ml P19/Ebi3抗原连接到beads，室温反应4h。将结合有抗原的beads装柱。为了保证连接效率，用含有氨基的小分子化合物尿素进行封闭，封闭完成后，除去封闭液，用PBS洗柱三次。

[0305] 连接效果的评估使用考马斯亮蓝法(Bradford法)。

[0306] 过柱：将预先处理过的血清(10,000g离心5min，通过0.45μm滤膜过滤)用PBS稀释一倍，然后加入连好抗原柱子里。

[0307] 洗脱：用pH2.5左右的HCl(含150mM NaCl)洗脱。一台紫外监测仪检测流出组分以便即时监控，洗脱过程尽里在低温完成，洗脱下的组分应该在冰盒上放置，洗脱下来后的成份用Na2HPO4缓冲液。

[0308] 抗体保存：纯化后的抗体置于相对接近体液的缓冲体系中(PBS+0.02％叠氮钠+5％BSA)，-20℃保存。

[0309] 3、多克隆抗体的鉴定

[0310] 实验过程参照实施例6

[0311] 二、结果

[0312] 实验结果如图10所示，P19/Ebi3复合物免疫小鼠获得的多克隆抗体，能够有效的抗P19蛋白，且效果比阳性对照IL-23P19的抗体效果好。

[0313] 实施例10抗P19/Ebi3多克隆抗体降低系统性红斑狼疮小鼠尿蛋白

[0314] 一、方法

[0315] 1、取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表6中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除)。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。

[0316] 表6不同试管的加样量

[0317]

[0318] 2、加完试剂2-5min后，用比色皿在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1ml H2O加5.0mlG—250试剂。注意：不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95％的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

[0319] 二、结果

[0320] 实验结果如图11所示，在第七天时，抗P19/Ebi3多克隆抗体能显著地降低系统性红斑狼疮小鼠尿蛋白量。

[0321] 实施例11抗P19/Ebi3多克隆抗体降低系统性红斑狼疮小鼠脾肿大

[0322] 一、方法

[0323] 1、抗P19/Ebi3多克隆抗体治疗系统性红斑狼疮小鼠

[0324] 1)实验动物的选择和分组

[0325] 发病的8月龄的雌性系统性红斑狼疮MRL/lpr小鼠20只，PBS治疗组10只；抗P19/Ebi3抗体治疗组10只。

[0326] 2)多克隆抗体的准备

[0327] 采用免疫小鼠并经亲和层析方法获得高效价抗P19/Ebi3多克隆抗体，使用PBS配制成4mg/ml。

[0328] 3)使用多克隆抗体治疗患病小鼠

[0329] 每只小鼠注射0.1ml抗体或PBS，每周注射两次，一共注射4次。治疗后1周，检测抗体治疗效果。

[0330] 2、获取实验小鼠的脾脏组织，比较大小

[0331] 二、结果

[0332] 实验结果如图12所示，采用抗P19/Ebi3抗体治疗系统性红斑狼疮小鼠，从根本上恢复了脾大小，这样有助于脾功能的恢复。

[0333] 实施例12抗P19/Ebi3多克隆抗体降低系统性红斑狼疮小鼠抗体水平

[0334] 一、方法

[0335] 1、抗P19/Ebi3多克隆抗体治疗系统性红斑狼疮小鼠

[0336] 2、小鼠体内抗体水平的检测(双抗夹心ELISA法)

[0337] 1)摘除小鼠的眼球采血。

[0338] 2)将离心管中的血置于37℃温箱或水浴1h，也可室温2h，再置4℃冰箱内3～4h或过夜。

[0339] 3)血液凝固血块收缩后，4000rpm离心10min。

[0340] 4)取上清于干净的离心管中，保存于-20℃或加入防腐剂置4℃冰箱中保存备用。

[0341] 5)IgM和IgGELISA检测：

[0342] 包被：用0.05M PH9的包被缓冲液将捕获IgM或IgG抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加100μl，4℃过夜。弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min。

[0343] 加样：加一定稀释的待检样品100μl于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1h，然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

[0344] 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标检测IgM或IgG抗体(经滴定后的稀释度)100μl。37℃孵育0.5～1h，洗涤。

[0345] 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μl，于37℃下反应10～30min。

[0346] 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸50μl。

[0347] 测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

[0348] 二、结果

[0349] 实验结果如图13所示，采用抗P19/Ebi3抗体治疗系统性红斑狼疮小鼠能够显著地降低小鼠体内的抗体水平。

[0350] 实施例13抗P19/Ebi3多克隆抗体降低系统性红斑狼疮小鼠淋巴细胞数目[0351] 一、方法

[0352] 1、抗P19/Ebi3多克隆抗体治疗系统性红斑狼疮小鼠

[0353] 2、小鼠体内免疫细胞的检测

[0354] 实验步骤参照实施例8，细胞流式技术分析时，每个流式检测管中加入的一抗为荧光标记抗CD11b，Gr-1，CD3，B220，GL7，IgG，IgM抗体。

[0355] 二、结果

[0356] 实验结果如图14所示，采用抗P19/Ebi3抗体治疗系统性红斑狼疮小鼠能有效地降低先天免疫细胞如中性粒细胞(CD11b+Gr-1+)、巨噬细胞(CD11b+Gr-1-)、T细胞(CD3+)、B细胞(B220+)、活化的B细胞(GL7+B220+)、抗体分泌细胞(IgG+或IgM+)的水平。

[0357] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。