3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体及其组合物转让专利
申请号 : CN201510026683.2
文献号 : CN105085672B
文献日 : 2020-03-13
发明人 : 鄢慧民 , 李么明 , 周谛晗 , 赵巴利
申请人 : 鄢慧民 , 李么明 , 周谛晗 , 赵巴利
摘要 :
本发明提供了特异性结合多肽的3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体及其组合物，其中所述多肽由选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组中的一个共识序列表示。本发明也提供了组合物，包含至少一个第一3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体，特异性地结合到由共识序列SEQ ID NO：1所代表的第一多肽，至少一个第二3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体，特异性地结合到由共识序列SEQ ID NO：2所代表的第二多肽，以及药学上可接受的溶液。
权利要求 :
1.单克隆免疫球蛋白IgA抗体， 其特征在于，所述单克隆IgA抗体特异性地结合多肽，其中所述多肽由选自SEQ ID NO：1 或SEQ ID NO：2中的一个共识序列表示；与SEQ ID NO：1所示多肽结合的单克隆IgA抗体是由保藏编号为CCTCC NO：C2014144的杂交瘤细胞株 3D-
2A10-IgA产生的，与SEQ ID NO：2所示多肽结合的单克隆IgA抗体是由保藏编号为CCTCC NO：C2014142杂交瘤细胞株3D-3A12-IgA产生的。
2.根据权利要求1所述单克隆IgA抗体，其特征在于，其中SEQ ID NO：1所示多肽是选自由SEQ ID NOS：3-8所示的多肽，SEQ ID NO：2所示多肽是选自由SEQ ID NOS： 10-14所示的多肽。
3.组合物，其特征在于，所述组合物包含至少一个第一单克隆IgA抗体，特异性地结合到由共识序列SEQ ID NO：1所代表的第一多肽，至少一个第二单克隆IgA抗体，特异性地结合到由共识序列SEQ ID NO：2所代表的第二多肽，以及药学上可接受的溶液，其中与SEQ ID NO：1所示第一多肽结合的第一单克隆IgA抗体是由保藏编号为CCTCC NO：C2014144的杂交瘤细胞株3D-2A10-IgA产生的，与SEQ ID NO：2所示第二多肽结合的第二单克隆IgA抗体是由保藏编号为CCTCC NO：C2014142杂交瘤细胞株3D-3A12-IgA产生的。
4.根据权利要求3所述组合物，其特征在于，其中所述第一多肽是选自由SEQ ID NOS：
3-8所示的多肽，第二多肽是选自由SEQ ID NOS：10-14所示的多肽。
说明书 :
3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体及其组合物
技术领域
[0001] 本发明一般涉及对肠道病毒的预防和治疗试剂，并且更具体地涉及对肠道病毒的3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A（IgA）抗体，并进一步涉及预防或治疗组合物，包含3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体。
背景技术
[0002] 肠道病毒被分为四个主要亚型A，B，C和D，每个亚型包含许多血清型。肠道病毒引起不同的疾病。例如，手，足和口病（HFMD）中的主要病原体是属于小核糖核酸病毒家族的肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒（CV）。手足口病日益严重的威胁到公众健康，特别是对婴幼儿。EV71和CV感染导致严重的无菌性脑膜炎，脑炎，心肌炎，急性麻痹，肺水肿，导致高死亡率。
[0003] 作为小核糖核酸病毒家族内肠病毒属的成员，EV71具有典型正义单链RNA基因组，含有单个开放阅读框，编码4个衣壳蛋白（VP1-4）和7个非结构蛋白（2A，2B，2C，3A，3B，3C和pol3D）。3D（也称为3D ）蛋白作为病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp），在病毒负链合成和一些蛋白质的尿苷酰化 (uridylylation)中起着主要作用。从EV71的晶体结构的研究中发现，一个 EV71病毒粒子包含由三个病毒结构蛋白VP1-VP3的60个拷贝形成的核衣壳，衣壳的内表面附着60个拷贝的小蛋白VP4。
[0004] 3D在所有肠道病毒中有着高度序列同源性，但与人类蛋白质具有低的同源性。EV71的3D与小核糖核酸病毒家族的脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒，鼻病毒和口蹄疫病毒聚合酶的同源RdRps具有结构/序列相似性。
[0005] 3D具有N-末端的活性部位。 Kiener等用来自EV71 C4菌株的重组3CD蛋白作为免疫原，分离了单克隆抗体4B12（IgG1），识别线性表位DFEQALFS（对应于3D的53-60位置和EV71聚蛋白的1784-1791），接近3D聚合酶的活性位点; 4B12在变性点杂交法检测到的所有肠道病毒71亚型（Kiener et al. Characterization of a monoclonal antibody against the 3D polymerase of enterovirus 71 and its use for the detection of human enterovirus A infection. J Virol Methods. 2012; 180(1-2):75-83）。4B12能够检测广泛亚型毒株，有力提示3D-特异性单克隆抗体对诊断感染可能是有用的，但没有提及或建议预防或治疗使用4B12，更不用说一般的3D特异性抗体。
[0006] 由于疫苗是控制传染病的最好策略，不同EV71的候选疫苗进行了研究，包括EV71灭活全病毒疫苗，减毒活病毒疫苗，重组VP1疫苗，基于VP1的DNA疫苗，合成肽疫苗和病毒样颗粒疫苗。福尔马林灭活EV71疫苗在小鼠和恒河猴引发令人满意的免疫保护和交叉反应性中和抗体的;在中国，EV71灭活疫苗于2013年已完成三期临床试验。由于在感染过程中外衣壳含有主要抗原位点，合成肽疫苗只含有核衣壳蛋白，包括VP1和VP2（Kung et al. Update on the development of enterovirus 71 vaccines. Expert Opin Biol Ther. 2014; 3:1-10）。
[0007] 因为EV71是一种RNA病毒，通过容易出错的RdRp对如肠病毒71型核衣壳基因的复制可能会导致相当大的遗传和抗原多样性。 Chen等人证明，通过抗VP1的一组单克隆抗体，基因型不反映其抗原性， EV71病毒可分为不同的抗原组（Chen et al. Antigenic analysis of divergent genotypes human Enterovirus 71 viruses by a panel of neutralizing monoclonal antibodies: current genotyping of EV71 does not reflect their antigenicity. Vaccine. 2013;31(2):425-30）。所有这些表明，选择一个理想的毒株来开发具有广泛有效性的疫苗是一个挑战。
[0008] 由于目前没有疫苗和特效抗病毒药物，人类静脉内注射免疫球蛋白（IVIG）一直在临床上用于治疗严重的EV71感染。然而，EV71感染中抗体依赖性增强作用（ADE）的发现，显示抗体在控制EV71感染的复合作用。 ADE是一种现象，其中先前存在的亚水平的中和抗体增强病毒进入和复制。亚水平的中和抗体显示，加强EV71感染含有Fc受体的人单核细胞，并加重EV71感染小鼠。此外，肠病毒抗体之间存在的广泛交叉反应性，也可能成为在EV71感染中的ADE的潜在风险。
[0009] Han等证明，低浓度（为50μg/ ml）的抗EV71的中和抗体（免疫球蛋白）可增强肠病毒71型感染单核细胞系（Han et al. Antibody dependent enhancement infection of enterovirus 71 in vitro and in vivo. Virol J. 2011; 8:106）。 Cao等进一步研究了各IgG亚类在中和及增强EV71感染中的作用，并发现人的免疫球蛋白的中和活性主要是由IgG1亚类介导，IgG2亚类较低，IgG3部分没有中和活性，但提高了肠病毒71型在体外的感染（Cao et al., Human IgG subclasses against enterovirus Type 71: neutralization versus antibody dependent enhancement of infection. PLoS One. 2013; 8(5):e64024）。因此，新型疫苗的设计应诱导产生抗体，具有强中和，但较弱的ADE活性。
[0010] 由于结构衣壳蛋白因突变而具有抗原多样性，因此难以找出对他们的通用抗体;到目前为止，已知两个通用的IgG单克隆抗体，一个抗VP1（Lim et al. Characterization of an isotype-dependent monoclonal antibody against linear neutralizing epitope effective for prophylaxis of enterovirus 71 infection. PLoS One.
2012; 7(1):e29751），另一个抗VP3（Kiener et al. A novel universal neutralizing monoclonal antibody against enterovirus 71 that targets the highly conserved "knob" region of VP3 protein. PLoS Negl Trop Dis. 2014; 8(5):e2895）。然而，这些通用抗体的ADE能力没有被研究。
2012; 7(1):e29751），另一个抗VP3（Kiener et al. A novel universal neutralizing monoclonal antibody against enterovirus 71 that targets the highly conserved "knob" region of VP3 protein. PLoS Negl Trop Dis. 2014; 8(5):e2895）。然而，这些通用抗体的ADE能力没有被研究。
[0011] Jia等人的研究对灭活EV71病毒疫苗的安全问题提出了严重关切（Jia et al. The cross-reactivity of the enterovirus 71 to human brain tissue and identification of the cross-reactivity related fragments. Virol J. 2010; 7:
47）。Jia等人证明在EV71感染的患者的血清中存在特异性IgG，具有对人类大脑的交叉反应活性;然后使用19个纯化多肽制备多克隆血清， P230-323，P646-755，P857-1012及P1329-
1440的抗血清对成年人的大脑和胎儿髓质中的神经元表现出较强的染色， P1-69，P324-
443，P444-565，P566-665，P746-876，P1441-1526，P1549-1668，P1732-1851和P2072-2193的抗血清显示弱染色，以及P70-159的，P140 -249，P1197-1338，P1649-1731和P1843-1951的抗血清显示没有染色。
47）。Jia等人证明在EV71感染的患者的血清中存在特异性IgG，具有对人类大脑的交叉反应活性;然后使用19个纯化多肽制备多克隆血清， P230-323，P646-755，P857-1012及P1329-
1440的抗血清对成年人的大脑和胎儿髓质中的神经元表现出较强的染色， P1-69，P324-
443，P444-565，P566-665，P746-876，P1441-1526，P1549-1668，P1732-1851和P2072-2193的抗血清显示弱染色，以及P70-159的，P140 -249，P1197-1338，P1649-1731和P1843-1951的抗血清显示没有染色。
[0012] 因此，迫切需要开发新手段应对肠道病毒，如EV71和CV引起手足口病。
[0013] 本发明快速筛查，以达到降低分析成本、提高检验效率的目的。
发明内容
[0014] 本发明提供了特异性结合多肽的单克隆免疫球蛋白A（IgA）抗体.在一个实施例中，所述多肽由选自SEQ ID NO：1 和SEQ ID NO：2中的一个共识序列表示。
[0015] 在所述3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体的另一个实施例中，与SEQ ID NO：1所示多肽结合的3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体是杂交瘤细胞株3D-2A10-IgA（CCTCC NO：C2014144），与SEQ ID NO：2所示多肽结合的3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体是杂交瘤细胞株3D-3A12-IgA（CCTCC NO：C2014142）。
[0016] 在所述3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体的另一个实施例中，SEQ ID NO：1所示多肽是选自由SEQ ID NOS：3-8所示的多肽，SEQ ID NO：2所示多肽是选自由SEQ ID NOS： 10-14所示的多肽。
[0017] 本发明同时提供了组合物。在一个实施例中，所述组合物包含至少一个第一3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体，特异性地结合到由共识序列SEQ ID NO：1所代表的第一多肽，至少一个第二3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体，特异性地结合到由共识序列SEQ ID NO：2所代表的第二多肽，以及药学上可接受的溶液。
[0018] 在所述组合物的另一个实施例中，与SEQ ID NO：1所示第一多肽结合的第一3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体是杂交瘤细胞株3D-2A10-IgA（CCTCC NO：C2014144），与SEQ ID NO：2所示第二多肽结合的第二3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体是杂交瘤细胞株3D-3A12-IgA（CCTCC NO：C2014142）。
[0019] 在所述组合物的另一个实施例中，所述第一多肽是选自由SEQ ID NOS：3-8所示的多肽，第二多肽是选自由SEQ ID NOS：10-14所示的多肽。
[0020] 通过如下结合附图对优选实施例的详细描述，本发明的目的和优点是显而易见的。
附图说明
[0021] 本发明的优选实施方案现在将参考附图进行说明，其中类似的附图标记表示相同的元件。
[0022] 图1、EV71 3D特异性单克隆IgG抗体的表征。 （A）图片显示用3D特异性IgG单克隆抗体（3A12，2A10，7A6G1和11F1）对EV71感染的细胞的间接免疫荧光染色;鞭毛素蛋白特异性单克隆抗体（5G10）作为阴性对照， 3D-免疫的小鼠血清作为阳性对照。 （B）用3D特异性IgG单克隆抗体（3A12，2A10，7A6G1和11F1）对EV71感染的VERO-1008细胞裂解液的免疫印迹;鞭毛蛋白特异性单克隆抗体（5G10）作为阴性对照，3D-免疫的小鼠血清作为阳性对照。
[0023] 图2、3D特异性IgG单克隆抗体在细胞内抑制EV71的复制。 （A）图示在经由转染而在细胞内抗体存在下的病毒滴度。 （B）图示在不同剂量的2A10或EV-5的存在下的病毒滴度。 EV-5是一种EV71 VP2特异性单克隆抗体。
[0024] 图3、3D特异性IgG单克隆抗体抑制体外3D聚合酶活性。 （A）示意图示3D（RdRp的）介导的RNA延伸。 （B）图片显示不同的IgG单克隆抗体对3D介导的RNA伸长的影响。
[0025] 图4、图示在鼠模型中EV71 3D特异性IgG单克隆抗体的抗病毒功能。
[0026] 图5、图示在2A10-IgG或EV-5-IgG单克隆抗体的存在下EV71复制的抗体依赖性增强。
[0027] 图6、EV71 3D特异性3A12和2A10的表位，在EV71 3D（1RA6）的三维模型中的空间状态。 EV71 3D（1RA6）用来指示3A12和2A10的两个识别表位的位置。
[0028] 图7、鉴定EV71 3D特异性3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体。 （A）图片显示EV71感染的细胞的间接免疫荧光染色，所用3D特异性3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体是3A12-IgA和2A10-IgA，16CF7 IgA (抗MeV)作为阴性对照，3D免疫小鼠的血清作为阳性对照。（B）EV71感染VERO-1008细胞的免疫印迹（WB），所用3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体是3A12-IgA和2A10-IgA，16CF7 IgA 作为阴性对照，3D蛋白免疫小鼠的血清作为阳性对照。
[0029] 图8、3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体胞内抑制EV71复制。（A）图示在Transwell基底部存在IgA抗体的情况下，EV71感染的极化VERO-pIgR细胞中的病毒滴度。（B）图示在基底部存在不同剂量的3A12-IgA或16CF7IgA的情况下，EV71感染的极化VERO-pIgR细胞中的病毒滴度。（C）图示在基底部存在不同IgG抗体的情况下，EV71感染的极化VERO-pIgR细胞中的病毒滴度。（D）图示在基底部存在不同IgA抗体的情况下，EV71感染的极化VERO-1008细胞中的病毒滴度。
[0030] 图9、EV71 3D-IgA 抑制病毒蛋白的累积。（A）免疫印迹（WB）检测在EV71感染的极化VERO-pIgR细胞中的3D和VP2的表达，在培养期间在基部有IgA抗体的存在。（B）图示ELISA结果，检测如（Ａ）所描述的细胞中3D和VP2的表达。
[0031] 图10、图示不同IgA单克隆抗体对3D介导的RNA延伸的影响。
[0032] 图11、图示在小鼠模型中EV71 3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体的抗病毒的效应。
[0033] 图12、图示由VTT-3D表达载体所表达的3D的免疫印迹（VTT-3D，一个重组表达3D的减毒牛痘病毒）。
[0034] 图13、图示免疫和攻毒程序。
[0035] 图14、图示初免后的3D特异性抗体应答：（A）血清IgG; （B）血清IgA的; （C）唾液IgA;和（D）阴道IgA。
[0036] 图15、图示第一次加强免疫后的3D特异性抗体应答：（A）血清IgG; （B）血清IgA; （C）唾液IgA;和（D）阴道IgA。
[0037] 图16、图示第二次加强免疫后的3D特异性抗体应答：（A）血清IgG; （B）血清IgA; （C）唾液IgA;和（D）阴道IgA。
[0038] 图17、图示由被免疫母亲出生的新生小鼠的肠中的3D特异性IgG抗体应答。
[0039] 图18、图示经小鼠适应株EV71攻毒后的新生小鼠的存活百分比。
[0040] 图19、图示用纯化的3D蛋白免疫BALB/c小鼠后的抗体应答。
具体实施方式
[0041] 可以通过引用以下的本发明的某些实施例的详细描述而更容易地理解本发明。
[0042] 在本申请中，为了更充分地描述本发明所涉及领域状态，当出版物被引用，这些出版物的公开内容的全部经引用而并入本申请。
[0043] 除非另有说明，在本发明的实践将采用分子生物学（包括重组技术），微生物学，细胞生物学，生物化学，核酸化学和免疫学的现有技术，这些是在本领域的技能之内。
[0044] 这些技术在文献中已有完全解释，如分子克隆：实验室说明书，第三版（Sambrook和Russel，2001年）;动物细胞培养（RI Freshmey主编，1987年版）;分子生物学当代程序（FM Ausubel等主编，1987年，包括补充至2001年）;免疫学当代程序（JE Coligan等主编，1991年）;免疫分析手册“（D.Wild 主编，斯托克顿出版社，纽约，1994年）;免疫学分析方法（R. Masseyeff，WH Albert和NA Staines等主编，Weinheim：VCH VERLAGS GESELLSCHAFT MBH，1993年）。
[0045] 本发明发现， 3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体在一个Transwell模型中能有效地抑制肠道病毒71型（EV71），更重要的是能够保护宿主免于病毒攻毒。
[0046] EV71 BrCr毒株的3D蛋白（SEQ ID NO：15）被表达和纯化，纯化的3D蛋白用来免疫的小鼠，遵照标准程序用于产生单克隆IgG抗体。通过常规的杂交瘤技术制备了两个3D蛋白特异性单克隆IgG抗体（杂交瘤细胞株3D-2A10-IgG和杂交瘤细胞株3D-3A12-IgG）。相应的杂交瘤细胞系已经保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），CCTCC NO：C2014143为杂交瘤细胞株3D-2A10-IgG和CCTCC NO：C2014141为杂交瘤细胞株3D-3A12 IgG抗体。保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址 湖北武汉大学，保藏日期：2014年7月22日。单克隆IgG抗体可以是包含的Fc结构域的抗体，单链抗体，或Fab片段。各种抗体的定义和生产是众所周知的。
[0047] 3D-2A10-IgG和3D-3A12-IgG的 杂交瘤细胞系经过亚型转换，得到两个相应的3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体，杂交瘤细胞株3D-2A10-IgA和杂交瘤细胞株3D-3A12-IgA。相应的杂交瘤细胞系已经保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），CCTCC NO：C2014144为杂交瘤细胞株3D-2A10-IgA和CCTCC NO：C2014142为杂交瘤细胞株3D-3A12-IgA抗体。保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址 湖北武汉大学，保藏日期：2014年7月
22日。
22日。
[0048] 使用从任一末端连续缺失的重组3D蛋白，鉴定了抗体结合的多肽。从相应IgG抗体的结合特异性可以预见， 3D-3A12 IgA抗体结合到KEPAVLTS（SEQ ID NO：3），3D-2A10-IgA的结合YSTYVKDELRSLDKI（SEQ ID NO：9）。利用序列比对，所识别的多肽在所有来自肠道病毒亚型A，B，C和D的肠道病毒毒株中是高度保守的。 如下表1所示，3D-3A12 IgA抗体结合到由一个共识序列KEPAVLX7X8所表示的多肽（SEQ ID NO：1），其中X7选自T，H，R和N，X8选自S，N和K。3D-2A10-IgA抗体结合到由一个共识序列X1X2TX4VKDELRSX12X13KX15被表示的多肽（SEQ ID NO：2），其中X1选自Y，M，L和F，X2选自S和V，X4选自Y和F，X12选自L，A，K和R，X13选自的D，E，T和S，X15选自I和V。
[0049] 表1、由3D-2A10-IgA或3D-3A12 IgA抗体识别的共识序列和示例性序列
[0050]
[0051] 肠道病毒包括亚型A，B，C和D。
[0052] 肠道病毒A亚型包含23个血清型;示范性3D序列包括：（1）人肠道病毒71型（EV71），BrCr毒株（GenBank AB204852.1）（SEQ ID NO：15），其中SEQ ID NO：15包含抗体结合多肽，由SEQ ID NOS：3和9分别表示; （2）人柯萨奇病毒A16型毒株shzh00-1（GenBank AY790926.1）（SEQ ID NO：16），其中SEQ ID NO：16包含抗体结合多肽，由SEQ ID NOS：3和9分别表示。
[0053] 肠道病毒B亚型包含60种血清型;示范性3D序列包括：（1）人柯萨奇病毒B3 Beijing0811毒株（GenBank GQ141875.1）（SEQ ID NO：17），其中SEQ ID NO：17包含抗体结合多肽，由SEQ ID NOS：5和10分别表示 ; （2）人类柯萨奇A9 GRIGGS毒株（GenBank D00627.1）（SEQ ID NO：18），其中SEQ ID NO：18包含抗体结合多肽，由SEQ ID NOS：5和10分别表示。
[0054] 肠道病毒C亚型包含23个血清型;示范性3D序列包括：（1）人脊髓灰质炎病毒1株CHN- Jiangxi//89-1（GenBank：AF111984.2）（SEQ ID NO：19），其中SEQ ID NO：19包含抗体结合多肽，由SEQ ID NOS：6和11分别表示; （2）人柯萨奇病毒A 1 KS-ZPH01F/ XJ/ CHN/ 2011 分离株（GenBank：JX174177.1）（SEQ ID NO：20），其中SEQ ID NO：20包含抗体结合多肽，由SEQ ID NOS：6和12分别表示。
[0055] 肠道病毒D亚型包含5种血清型;示范性3D序列包括：（1）人肠道病毒68 Fermon毒株（GenBank：AY426531.1）（SEQ ID NO：21），其中SEQ ID NO：21包含抗体结合多肽，由SEQ ID NOS：7和13分别表示; （2）人类肠道病毒94 E210 分离株（GenBank：DQ916376.1）（SEQ ID NO：22），其中SEQ ID NO：22包含抗体结合多肽，由SEQ ID NOS：8和14分别表示。
[0056] 重组3D蛋白可以单独或者与来自于肠道病毒的其它蛋白质一起在免疫原性组合物中用作免疫原。如下文的实施例所示，EV71 3D蛋白质与细菌鞭毛蛋白一起使用能诱导抗体应答和部分地保护住的攻毒。由于3D蛋白在所有肠道病毒中高度保守，因此预计3D蛋白可以用作免疫原，对各种亚型具有广泛保护。此外，3D蛋白质的某些变体也可以用于免疫原性组合物，其中，这些变体与相应的野生型蛋白相比，同一性至少85％，优选地90％，更优选地为95％。此外，佐剂可以是任何已知的，如M59，铝佐剂。
[0057] 由于针对3D蛋白的抗体不显示ADE效果，有利的是使用的抗体组合物来治疗患者的肠道病毒感染。用于治疗用途的抗体组合物是公知的，如抗体用于治疗癌症。抗体组合物通常包含药学上可接受的成分，例如氯化钠溶解在药学上可接受的溶液。本发明证明了，3D-2A10-IgA和3D-3A12-IgA能够部分保护宿主免于攻毒，存活率为60% （图11）。
实施例
实施例
[0058] 提供下面实施例的唯一目的是说明本发明的原理；它们决不旨在限制或缩小本发明的范围。
[0059] 实施例1
[0060] EV71 3D特异性IgG单克隆抗体。
[0061] 1.1、 抗原制备
[0062] EV71 BrCr毒株的完整3D基因（编码SEQ ID NO：15所示的蛋白质）克隆到载体pET28a，酶切位点为NcoI和XhoI。简言之，将含有重组3D表达载体转化的大肠杆菌BL21（DE3），细菌生长，通过诱导来制备这些重组蛋白，并通过亲和色谱法在Ni-NTA柱上（Qiagen公司）纯化。
[0063] 1.2、 免疫和制备EV71 3D特异性IgG单克隆抗体
[0064] 制备EV71 3D-特异性单克隆抗体方法如先前描述（Li YM, Liu F, Han C and Yan HM. Monoclonal antibody that blocks the Toll-like receptor 5 binding region of flagellin. Hybridoma (Larchmt). 2012 Feb;31(1):60-62）。简言之，5周龄雌性SPF BALB / c小鼠皮下免疫100μg 3D，时间间隔为2周。最后一次加强后四个星期和细胞融合的前3天，小鼠用200μg 3D 腹腔接种加强。三天后，收获小鼠脾细胞，和SP2/0融合，融合中使用50％聚乙二醇（Sigma-Aldrich公司，密苏里州）。杂交瘤培养物上清液用ELISA筛选。阳性杂交瘤细胞通过有限稀释进行克隆，稳定的杂交瘤克隆被注射到液体石蜡预处TM理BALB / c小鼠的腹腔。随后，收获单克隆抗体，用抗体纯化试剂盒（NAb Protein A/G Spin Kit, Thermo Scientific, USA），根据制造商的说明纯化。
[0065] 1.3、3D特异性IgG单克隆抗体的结合特异性的验证
[0066] 24孔板中的Vero-1008细胞用EV71（MOI =0.1）感染。 感染24小时后，用无水甲醇固定细胞，进行间接免疫荧光试验（IFA），先用3D特异性单抗（3A12，2A10，7A6G1和11F1），接着用荧光素异氰酸酯缀合的山羊抗小鼠IgG的抗体;鞭毛蛋白特异性单克隆抗体（5G10）作为阴性对照， 3D免疫的小鼠的血清作为阳性对照。如图1（A）所示，3A12，2A10，7A6G1和11F1显示明显染色，达到与阳性对照相媲美的水平，阴性对照单克隆抗体5G10显示无染色。
[0067] Vero-1008细胞培养和感染如上所述。细胞裂解物用SDS-PAGE分离，并转移至PVDF膜上，印迹用指定抗体按照常规免疫印迹程序。如图1（B）所示，泳道1，3A12;泳道2，2A10;泳道3，7A6G1;泳道4,11F1;泳道5，5G10作为阴性对照;和泳道6，阳性对照。结果表明，3D蛋白质特异性IgG单克隆抗体（3A12，2A10，7A6G1和11F1）显示对应于3D蛋白质的特定条带，但阴性对照（5G10）没有显示3D的结合。
[0068] 1.4、 3D特异性IgG单克隆抗体对EV71复制的细胞内抑制
[0069] Vero-1008细胞接种于24孔板，每孔1×105细胞，培养24小时后，在MOI= 0.1下感染EV71。 感染1小时后，除去细胞上清液，洗涤细胞3次。5μg IgG加到100微升的OPTI-MEM，然后5微升脂质体2000加入到100微升的OPTI-MEM，最后将混合物加入到病毒感染的细胞。转染3小时后，细胞上清液用含3％FBS的0.5ml DMEM替换。八个小时之后，收获EV71感染的细胞，经过1次冻融循环，通过噬斑测定法测定这些细胞样品中的病毒滴度（由PFU/孔表示）。如图2所示，转染的3A12和2A10显著降低病毒滴度;转染的7A6G1降低病毒滴度，但与
3A12和2A10相比没有那么显著;但转染的11F1未能降低病毒滴度。至于EV-5，这是一个VP2特异性IgG单克隆抗体;转染的EV-5未能降低病毒滴度; 值得注意的是，EV-5，当直接加入到细胞培养物，显示增加病毒滴度，表明其抗体依赖性增强（ADE）的效果。病毒滴度的数据表明，通过不同的3D特异性IgG单克隆抗体识别的表位对他们抑制EV71复制的能力是非常重要的。
3A12和2A10相比没有那么显著;但转染的11F1未能降低病毒滴度。至于EV-5，这是一个VP2特异性IgG单克隆抗体;转染的EV-5未能降低病毒滴度; 值得注意的是，EV-5，当直接加入到细胞培养物，显示增加病毒滴度，表明其抗体依赖性增强（ADE）的效果。病毒滴度的数据表明，通过不同的3D特异性IgG单克隆抗体识别的表位对他们抑制EV71复制的能力是非常重要的。
[0070] 除抗体的剂量外，Vero-1008细胞的培养，感染和抗体处理如上所述。如图2（B）所示，转染的2A10在试验剂量（0，0.2％，1或5微克/孔）范围内对病毒滴度的的降低显示剂量依赖性的抑制作用，但转染的EV-5在所有测试的剂量范围内无抑制。三个独立实验经过重复，且报告的是代表性的数据。
[0071] 1.5、 3D特异性IgG单克隆抗体抑制体外3D聚合酶活性
[0072] 图3（A）示意3D（RdRp）介导的RNA延伸。
[0073] 在10微升反应系统中(50 mM HEPES, 75 mM KCl, 5 mM MgCl2, 4 mM TCEP, 300 μM NTP, and 4 μM RNA Complex)，加入1微克功能性3D，可触发RNA的起始和延伸。 RNA种类由包括7摩尔尿素的15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分开，用Stains-All染色。为测定抑制，加入2μg IgG单克隆抗体到各反应。3D的核糖核酸延伸活性，由延伸的RNA条带的出现来确定。如图3（B）所示，泳道1，无聚合酶的阴性对照;泳道2，阳性对照组（没有介入因素）;泳道3，3A12;泳道4，2A10;泳道5，7A6G1;泳道6,11F1;和泳道7，EV-5。 3A12，2A10和7A6G显著抑制RNA延伸条带的出现，但11F1和EV-5未能抑制RNA延伸。进行了三个独立的实验，报告的是有代表性的数据。
[0074] 1.6、 3D特异性单克隆抗体在鼠模型中的抗病毒效果
[0075] EV71 3D特异性IgG的抗病毒功效在鼠模型中进行了研究。 30只1日龄新生小鼠被随机分成6组（每组5只小鼠）。通过腹腔接种分别给予每组100微克/50微升的3A12，2A10，7A6G1，11F1或EV-5 IgG抗体，PBS组作为阴性对照;然后通过腹腔接种每组给予103 TCID50 EV71攻毒。IgG注射4次，间隔为24小时。每天收集小鼠存活数据，收集2周。如图4所示，2A10-IgG和3A12-IgG分别提供20％或40％的保护。
[0076] 1.7、 2A10-IgG或EV-5-IgG存在下的体外病毒复制
[0077] 将1×104 PFU EV71加入到连续稀释的200μl单克隆抗体（EV-5抗体针对EV71 VP2，或2A10 IgG抗体针对EV71 3D）。孵育1小时后，该混合物感染Caco-2细胞。收集EV71感染的Caco-2细胞，通过噬斑测定法测定这些细胞样品中的病毒滴度。如图5所示，在 0.25-16μg/ ml的浓度下，与基线（P <0.01）相比，EV-5显著增强病毒感染，但2A10在所有测试的剂量下没有增强病毒感染。
[0078] 1.8、测绘EV71 3D特异的3A12和2A10的表位和在EV71 3D（1RA6）的三维模型中的空间状况
[0079] 3D基因（编码由SEQ ID NO：15所代表的蛋白质）和其截短突变体被克隆到pET28a表达载体，通过Western印迹测定IgAs对3D蛋白质和突变体的结合活性。此外，用合成的不同长度的多肽来确定3A12-IgG和2A10 IgG抗体识别的确切范围。如表1所示，3A12和2A10识别的多肽分别为：KEPAVLTS（SEQ ID NO：3）和YSTYVKDELRSLDKI（SEQ ID NO：9）。来自所有A，B，C和D亚型的各种肠道病毒株的比对揭示了，由3A12识别的一个共识序列KEPAVLX7X（8 SEQ ID NO：1），和由2A10识别的另一个共识序列X1X2TX4VKDELRSX12X13KX1（5 SEQ ID NO：2）。如图6所示，EV71 3D（1RA6）被用来显示3A12和2A10的两个已识别的表位的位置。
[0080] 实施例2
[0081] EV71 3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体
[0082] 2.1、3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体
[0083] 2A10-IgA和3A12-IgA单克隆抗体分别来自2A10-IgG和3A12-IgG单克隆抗体，亚型转换通过常规的亚型转换技术。
[0084] 2.2、3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体在胞内染色3D蛋白
[0085] VERO-1008细胞种于24孔板，感染EV71（MOI=0.1）。感染后24小时，用甲醇固定细胞，进行间接免疫荧光染色（IFA），使用的3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体为3A12-IgA和2A10-IgA，16CF7-IgA（抗MeV）为阴性对照，3D免疫小鼠的血清为阳性对照。如图7（A）所示，3A12-IgA和2A10-IgA，以及阳性血清，能够和EV71感染的细胞反应，但是阴性对照显示没有染色。
[0086] 2.3、3D蛋白特异性单克隆免疫球蛋白A抗体的免疫印迹
[0087] EV71 感染的VERO-C1008细胞被裂解，细胞裂解物在SDS-PAGE 上分开，转移到PVDF膜上，免疫印迹使用的抗体为3A12-IgA， 2A10-IgA， 16CF7-IgA， 和阳性血清。如图7（B）所示，3A12-IgA， 2A10-IgA 和阳性血清特异地染色EV71感染的细胞，但是16CF7-IgA却不能。这些结果证明了，3A12-IgA和 2A10-IgA保留了相应的3A12-IgG 和2A10-IgG的3D特异性。
[0088] 2.4、EV71 3D特异IgA通过pIgR胞内抑制EV71复制
[0089] （i）极化的VERO-pIgR细胞，在含有0.4μm膜的Transwell中培养；感染EV71，让病毒吸附的细胞上（细胞粘附）。1小时后，洗涤细胞的顶端和基座两边，去掉没有被吸附的病毒。然后，400 μl完全DMEM加到顶端边；在基座边加入3D特异性或非相关IgA抗体（30μg/100μl）。24 小时后，用PBS充分洗涤细胞两边，收集到400 μl完全DMEM，细胞样品中的病毒滴度用噬斑法测定。如图8（A）所示，3A12-IgA和 2A10-IgA能够显著地抑制EV71复制，但是
16CF7-IgA没有抑制。
16CF7-IgA没有抑制。
[0090] （ii）如（i）操作极化的VERO-pIgR细胞，但是使用不同量的IgA抗体（3A12-IgA和16CF7-IgA）。如图8（B）所示，3A12-IgA胞内抑制EV71复制，呈现剂量依赖性。
[0091] （iii）如（i）操作极化的VERO-pIgR细胞，但是使用相应的IgG抗体（3A12-IgG， 2A10-IgG和16CF7-IgG）。如图8（C）所示，所有IgG抗体对EV71的复制没有显著抑制效应。
[0092] （iv）操作如（i），但是VERO-pIgR细胞换成VERO-1008细胞。如图8（D）所示，所有三个IgA抗体（3A12-IgA， 2A10-IgA和16CF7-IgA）对EV71复制没有显著抑制效应，表明IgA介导的对EV71复制的胞内抑制依赖于VERO细胞表面表达的pIgR。
[0093] 2.5、EV71 3D特异IgAs在胞内抑制EV71和CV株的复制
[0094] 胞内抑制EV71和CV株的复制的实验如实施例2.4中所描述。结果被总结在下文表2中。
[0095] 表2、 胞内抑制EV71和CV株的复制
[0096]
[0097] 其中“a”表示，用培养基组的病毒滴度作为100%， 计算在不同抗体的存在下病毒存活的百分比后，计算“％病毒降低”。
[0098] 2.6、EV71 3D IgA抑制病毒蛋白表达
[0099] （i）极化的VERO-pIgR细胞，在含有0.4μm膜的Transwell中培养；感染EV71，让病毒吸附的细胞上（细胞粘附）。1小时后，洗涤细胞的顶端和基座两边，去掉没有被吸附的病毒。然后，400 μl完全DMEM加到顶端边；在基座边加入3D特异性或非相关IgA抗体（30μg/100μl）。24 小时后，用PBS充分洗涤细胞两边，收集到400 μl完全DMEM，这些细胞样品中的3D和VP2蛋白量用免疫印迹（WB）来测定。如图9（A）所示，3A12-IgA（泳道1）和2A10-IgA（泳道2）显著地抑制3D和VP2的表达，但是16CF7-IgA（泳道3）和DMEM（泳道4）没有明显的抑制。
[0100] （ii）如（i）操作极化的VERO-pIgR细胞。细胞样品用ELISA来分析。如图9（B）所示，3A12-IgA和 2A10-IgA显著地抑制3D的表达。
[0101] 2.7、3A12-IgA和 2A10-IgA抑制3D聚合酶的RNA延伸活性
[0102] 在10微升反应系统中(50 mM HEPES, 75 mM KCl, 5 mM MgCl2, 4 mM TCEP, 300 μM NTP, and 4 μM RNA Complex)，加入1微克功能性3D，触发RNA的起始和延伸。 RNA种类由包括7摩尔尿素的15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分开，用Stains-All染色。如图10所示，泳道1，无聚合酶的阴性对照;泳道2，阳性对照组（没有介入因素）;泳道3，16CF7-IgA (2μg)；泳道4，2A10-IgA (2μg);泳道5，3A12-IgA (2μg)。进行了三个独立的实验，报告的是有代表性的数据。
[0103] 2.8、评价EV71 3D特异性IgA抗体在新生小鼠模型中的抗病毒效率
[0104] 1日龄新生小鼠通过腹腔接种分别给予100微克/50微升IgA抗体;然后通过腹腔接种每组给予103 TCID50 EV71小鼠适应株攻毒。IgA抗体注射4次，间隔为24小时。每天收集小鼠存活数据，收集3周。如图11所示，2A10-IgA和3A12-IgA分别提供40％或60％的保护。
[0105] 实施例3
[0106] 3D作为抗原
[0107] 3.1、在表达3D的重组痘苗病毒天坛株（VTT-3D）中识别3D
[0108] 在重组痘苗病毒感染的VERO-1008细胞中检测EV71 3D。如图7所示，泳道1，蛋白分子量标记，泳道2，模拟感染的VERO-1008对照，泳道3，VTTenv感染的VERO-1008，泳道4-7，4个纯化的重组牛痘病毒克隆感染的VERO-1008。受感染或未受感染的VERO-1008通过SDS-PAGE分离，并转移至PVDF膜。 3D特异性IgG单克隆抗体2A10 IgG抗体作为结合抗体。结果表明，3D基因在VERO-1008细胞插入牛痘病毒基因组，并正确表达。
[0109] 3.2、免疫程序
[0110]表3、免疫程序
[0111] 图13是免疫方案的示意图。
[0112] 每次免疫后检测抗体应答：首免（图14）;第一次加强（图15）;第二次加强（图16）。在VTT-3D组中的每只小鼠免疫100微升107 PFU病毒，而在3D组中的每只小鼠免疫100μl 30微克3D蛋白。收集血清和来自阴道和唾液的黏膜样本，通过ELISA来确定的抗3D蛋白的IgA的滴度。
[0113] 检测的新生小鼠的抗体应答（图17）。
[0114] 3.3、EV71攻毒保护
[0115] 经过三次免疫后，在VTT-3D组，3D组，PBS组以及EV71灭活组中的每只新生小鼠攻3
毒10 TCID50病毒。每天观察新生小鼠。 灭活EV71的免疫完全保护小鼠。在PBS阴性对照组中的所有小鼠，在攻毒后3-5天死亡。 如图18所示，3D和VTT-3D提供10％-30％的保护。
毒10 TCID50病毒。每天观察新生小鼠。 灭活EV71的免疫完全保护小鼠。在PBS阴性对照组中的所有小鼠，在攻毒后3-5天死亡。 如图18所示，3D和VTT-3D提供10％-30％的保护。
[0116] 实施例4
[0117] 4.1、用纯化的3D蛋白质免疫
[0118] 3D蛋白的表达和纯化在实施例1.1中进行了描述。纯3D蛋白加上来自大肠杆菌的鞭毛素或CTB作为佐剂，然后免疫小鼠，途径包括皮下（SC），鼻内（IN）或腹膜内（IP）。表4总结了免疫方案。两次免疫之间的间隔为2周; SC和IP的体积是100微升，而IN的体积是20μL。
[0119] 表4、 用纯化的3D蛋白的免疫方案
[0120]组别 免疫组合物 免疫方法 每组小鼠数目
1 30μg3D+5μgKF 2xSC+2xIN 6
2 30μg3D+5μgKF 2xIP+2xIN 6
3 30μg3D+2μgCTB 2xSC+2xIN 6
4 30μg3D+2μgCTB 2xIP+2xIN 6
5 PBS 2xSC+2xIN 6
1 30μg3D+5μgKF 2xSC+2xIN 6
2 30μg3D+5μgKF 2xIP+2xIN 6
3 30μg3D+2μgCTB 2xSC+2xIN 6
4 30μg3D+2μgCTB 2xIP+2xIN 6
5 PBS 2xSC+2xIN 6
[0121] 3.2、抗体应答
[0122] 最后免疫的2周后，收集血清，小肠和肺样品，小肠和肺的样品匀浆，收集上清液用于测试。这些样品中的3D特异性IgA或IgG抗体应答通过ELISA滴定。图19示出了3D-特异性IgG抗体滴度：血清（A），肺（b）和小肠（c）；3D特异性IgA抗体的滴度：血清（d），肺（e）和小肠（F）。
[0123] 尽管本发明参照特异的实施方式来描述，但是将被理解的是，实施例是说明性的，本发明的范围并不局限于此。本发明的替代实施例对本发明涉及的领域的普通技术人员将变得显而易见。这样的替代实施例都被认为是包含在本发明的精神和范围之内。因此，本发明的范围由所附的权利要求被描述，由前面的描述所支持。