一种sll0659基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用

摘要

本发明涉及一种sll0659基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用。该应用所涉及的sll0659基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供了一种在集胞藻PCC6803β‑胡萝卜素合成中具有重要作用的集胞藻PCC6803中sll0659基因的应用，通过将集胞藻PCC6803中的sll0659基因敲除后，集胞藻PCC6803的叶黄素含量增加了22.3％，玉米黄素含量增加了31.3％，而海胆酮含量降低了34.3％，β‑胡萝卜素百分含量则降低了1.3％。同时，HPLC检测结果表明，与野生型集胞藻PCC6803相比，sll0659基因敲除突变体中类胡萝卜素组分中有一个明显的峰，经与标品对照检测，确定其为α‑胡萝卜素。

权利要求

1.一种sll0659基因在提高集胞藻类胡萝卜素中叶黄素、玉米黄素和α-胡萝卜素含量中的应用，所述sll0659基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，步骤如下：（1）根据GenBank数据库中公布的集胞藻PCC6803 sll0659序列扩增集胞藻PCC6803 sll0659上游cDNA片段，制得上游片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）根据GenBank数据库中公布的集胞藻PCC6803 sll0659序列扩增集胞藻PCC6803 sll0659下游cDNA片段，制得下游片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

（3）将步骤（1）制得的上游片段连接入载体，用限制性内切酶BamHI 和SalI双酶切，回收载体片段1，将步骤（2）制得的下游片段用限制性内切酶BamHI 和SalI双酶切，制得回收片段2，连接载体片段1和片段2，制得sll0659BamHI载体；

（4）用限制性内切酶BamHI酶切pBluescript-Gm载体，回收庆大霉素抗性片段；将步骤（3）制得的sll0659BamHI载体用限制性内切酶BamHI酶切后，与庆大霉素抗性片段连接，制得集胞藻PCC6803 sll0659基因敲除的载体pKNsll0659-Gm；

（5）将步骤（4）制得的载体pKNsll0659-Gm转化集胞藻PCC6803，经筛选，制得转基因集胞藻，经培养，即得。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，扩增引物核苷酸序列如下：sll0659-1-F：5’-ATGAACTATGCAACTACACC-3’；

sll0659-1-BamHI-R: 5’-CGAGGATCCGGCAATGATTGGTAATT-3’。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，扩增体系如下：

2×Hifi PCR Mix 10μL，大肠杆菌基因组DNA模板1μL，正向引物sll0659-1-F 1μL，反向引物sll0659-1-BamHI-R 1μL，ddH2O 7μL，总反应体系为20μL。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，扩增反应条件如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后；72℃10min，

4℃保存。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，扩增引物核苷酸序列如下：sll0659-2-BamHI-F: 5’-GCAGGATCCAATACTTTTGGGAAGCT-3’；

sll0659-2-SalI-R: 5’-CACGTCGACTCAATGGTGGAAATCGT -3’。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，扩增体系如下：

2×Hifi PCR Mix 10μL，大肠杆菌基因组DNA模板1μL，正向引物sll0659-2-BamHI-F 1μL，反向引物sll0659-2-SalI-R 1μL，ddH2O 7μL，总反应体系为20μL。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，扩增反应条件如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后；72℃10min，

4℃保存。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中，载体为T3载体。

说明书

一种sll0659基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种sll0659基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用，特别涉及集胞藻PCC6803中sll0659基因在集胞藻PCC6803光合作用中合成集胞藻类胡萝卜素中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

[0002] 类胡萝卜素(Carotenoids)是胡萝卜素(Carotenes)和叶黄素(Xanthophylls)两大类色素的总称，通常是碳氢化合物及其的氧化衍生物，由8个类异戊二烯单位组成，是一类重要的天然色素，目前已发现的类胡萝卜素有700多种，常见的有α-胡萝卜素(α-Carotene)、β-胡萝卜素(β-Carotene)、玉米黄素(Zeaxanthin)、叶黄素(Lutein)和虾青素(Astaxanthin)等。

[0003] 类胡萝卜素在自然界中分布广泛，主要由植物、藻类、蓝藻以及一些细菌、真菌等微生物合成，动物自身不能合成类胡萝卜素，只能通过食物链获取。在光合生物中，类胡萝卜素作为捕光色素成分参与光合作用和通过清除自由基的参与抗光氧化的保护作用，同时在动物和人类体内也发挥着重要作用。例如类胡萝卜素(尤其是β-胡萝卜素)是作为人体内维生素A的重要来源，类胡萝卜素如番茄红素、β-胡萝卜素、虾青素及叶黄素等具有很强的抗氧化活性，可以有效地抑制自由基的产生，阻断体内的链式自由基反应，阻止脂质过氧化，延缓衰老和老年动脉粥样硬化的形成。它同样可以治疗疾病并提高机体免疫力。同时，类胡萝卜素也具有较大的医用价值，人类摄食类胡萝卜素不仅可以预防眼病、心血管病的发生，还可以增强生物机体的特异性及非特异性免疫功能，增强肿瘤免疫。

[0004] 目前，在国内外市场上，类胡萝卜素主要作为医药原料、功能食品、膳食补充剂和饲料色素，价格昂贵，市场需求量极大。功能性天然色素的类胡萝卜红素在医药、食品、化妆品等方面都有着良好的应用前景，它的开发应用将给农业、食品加工业、医药行业等相关的行业带来可观的经济效益，具有广阔的市场前景。类胡萝卜素的生产方法包括化学合成法、微生物发酵法和天然植物提取法三种。其中天然提取法正逐步成为类胡萝卜素生产的主要方法。从植物资源中提取主要是以果蔬为原料，存在成本高、生产工艺复杂、产品得率偏低等问题，目前此方法已不占主导地位。与植物相比，大多数的藻类能够合成类胡萝卜素，如蓝藻中的北冰洋聚球藻能合成玉米黄素、β-胡萝卜素、隐黄质等，红球藻(Haematococcus pluvialis)在氮磷饥饿条件下，细胞中的虾青素积累增大，绿藻中的杜氏藻(Dunaliella)能大量积累β-胡萝卜素。同时由于微藻不与农作物争地、争水；在环境胁迫如缺氮等条件下，有些单细胞微藻可大量积累类胡萝卜素，所以有很多利用微藻生产高附加值物质的研究。而随着代谢工程技术的发展及日趋成熟,通过改造、阻断及引入新的代谢途径来提高细胞内类胡萝卜素的含量，可以在提高目标产物的得率同时减少副产物的生成。

[0005] 近年来，应用类胡萝卜素合成相关基因的转基因植物研究取得了较大进展。类胡萝卜素生物合成的第一步是由八氢番茄红素合酶(PSY)催化两个牻牛基牻牛基焦磷酸(GGPP)分子合成八氢番茄红素(phytoene)。PSY是类胡萝卜素生物合成途径中的一个关键调节酶，其编码基因成为植物类胡萝卜素遗传工程中的首选目的基因。GGPP是许多途径的反应前体，在番茄中过量表达PSY1基因时，GGPP大量转向合成类胡萝卜素，而赤霉素的合成水平下降。在油菜种子中过量表达细菌的PSY基因发现成熟的种子中类胡萝卜素含量增加了50倍。在水稻胚乳中共表达水仙的PSY基因、LCY基因和细菌的CRTI基因，结果转基因水稻种子胚乳中积累了大量β-胡萝卜素及其氧化产物叶黄体素、玉米黄质等，这种水稻米粒金黄，被誉为“金色水稻”。利用果实特异性启动子在番茄中过量或反义表达Lcy-b基因，结果发现过量表达的转基因植株果实中的β-胡萝卜素含量大量增加。过量表达番茄红素β-环化酶基因的转基因番茄，发现番茄红素向β-胡萝卜素的转化加强，而且总类胡萝卜素的含量也增加了50％以上。在拟南芥中过量表达胡萝卜素羟化酶(BCH)使叶黄素的含量增加，其他类胡萝卜素的含量并没有明显的降低。不过，通过基因工程技术提高植物的类胡萝卜素含量和种类，还面临着许多问题，如前体GGPP的供应与几种物质代谢调控的平衡等。

[0006] 蓝藻(cyanobacteria)又称蓝细菌，是一类能进行光合作用的原核生物。蓝藻细胞可以利用简单的无机物合成有机物，所表达的外源基因产物不形成包含体，并且多数蓝藻及其提取物对人畜无毒，是转基因研究的良好受体。集胞藻PCC 6803(Synechocystissp.sp PCC6803)做为一种单细胞蓝藻，具有生长速度快、培养条件简单、不产生毒素、细胞结构简单、遗传背景清楚、方便分子操作等特点，适合于利用广核生物反应器大规模生产，是很好的蓝藻基因工程受体。鉴于蓝藻表达的外源基因产物易纯化、不含毒素、藻细胞培养成本低且不容易污染等的优点，随着藻类基因工程的发展，使利用蓝藻作为外源基因表达载体以生产药物等高附加值产品成为可能。

[0007] 集胞藻PCC6803中显著积累四种类胡萝卜素，即β-胡萝卜素(β-carotene)、玉米黄素(Zeaxanthin)、海胆酮(Echinenone)和蓝藻叶黄素(Myxoxanthophyll)。集胞藻PCC6803中类胡萝卜素生物合成途径见图1。目前，已经从集胞藻PCC6803中克隆到十多个与类胡萝卜素合成有关的基因，分别为主要有编码异戊二烯焦磷酸异构酶的ipi，编码牻牛儿基焦磷酸合成酶的crtE，编码八氢番茄红素合成酶的crtB，编码八氢番茄红素脱氢酶的crtP，编码ζ-胡萝卜素脱氢酶的crtQ，编码β-胡萝卜素酮醇酶的crtO，编码β-胡萝卜素羟化酶的crtR，编码胡萝卜素异构酶的crtH，和编码番茄红素环化酶/双加氧酶的crtLdiox。它们分别参与了从异戊二烯焦磷酸(IPP)到海胆酮及玉米黄素的羟基化与酮基化反应。集胞藻PCC6803中类胡萝卜素生物合成途径如图1所示。

[0008] 番茄红素是类胡萝卜素合成途径中的重要分支点，在不同环化酶的作用下形成一系列的胡萝卜素。已从聚球藻7942中克隆了编码番茄红素环化酶的crtL。近年来，在绿硫细菌中发现了一类新的双功能番茄红素环化酶基因CruA，在大肠杆菌中可以将番茄红素转化为γ-胡萝卜素。而在聚球藻7002(Synechococcus sp.PCC 7002)中也发现了同源基因CruA和CruP。集胞藻PCC6803中不含crtL-e，而尚未见有关crtL-b的报道。集胞藻PCC6803中sll0659基因(Genbank登录号为WP_010873989.1)与聚球藻CruP(Genbank登录号为WP_012305684.1)氨基酸相似性为51.12％，已有研究表明，sll0659的突变对番茄红素环化过程影响不明显，但尚没有对集胞藻PCC6803中sll0659基因在提高集胞藻PCC6803α-胡萝卜素合成及促进光合方面的应用的报道。

发明内容

[0009] 本发明针对现有技术的不足，提供了一种sll0659基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用。本发明通过在集胞藻PCC6803中利用基因敲除技术降低sll0659基因的表达后，发现增加了蓝藻叶黄素和玉米黄素的百分含量，其中蓝藻叶黄素含量增加了22.3％，玉米黄素含量增加了31.3％，而海胆酮含量和β-胡萝卜素百分含量则分别降低了34.3％和1.3％。HPLC检测结果表明，与野生型集胞藻PCC6803相比，sll0659基因敲除突变体中明显增加了α-胡萝卜素的含量。同时，普通光(40μmol photons m-2s-1)及强光(200μmol photons m-2s-1)处理条件下，与野生型集胞藻PCC6803相比，sll0659基因敲除突变株PSI/PSII比例明显降低。

[0010] 本发明技术方案如下：

[0011] 一种sll0659基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用，所述sll0659基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0012] 上述应用，步骤如下：

[0013] (1)根据GenBank数据库中公布的集胞藻PCC6803 sll0659序列扩增集胞藻PCC6803 sll0659上游cDNA片段，制得上游片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

[0014] (2)根据GenBank数据库中公布的集胞藻PCC6803 sll0659序列扩增集胞藻PCC6803 sll0659下游cDNA片段，制得下游片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

[0015] (3)将步骤(1)制得的上游片段连接入载体，用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切，回收载体片段1，将步骤(2)制得的下游片段用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切，制得回收片段2，连接载体片段1和片段2，制得sll0659BamHI载体；

[0016] (4)用限制性内切酶BamHI酶切pBluescript-Gm载体，回收庆大霉素抗性片段；将步骤(3)制得的sll0659BamHI载体用限制性内切酶BamHI酶切后，与庆大霉素抗性片段连接，制得集胞藻PCC6803 sll0659基因敲除的载体pKNsll0659-Gm；

[0017] (5)将步骤(4)制得的载体pKNsll0659-Gm转化集胞藻PCC6803，经筛选，制得转基因集胞藻，经培养，即得。

[0018] 根据本发明优选的，所述步骤(1)中，扩增引物核苷酸序列如下：

[0019] sll0659-1-F：5’-ATGAACTATGCAACTACACC-3’；

[0020] sll0659-1-BamHI-R:5’-CGAGGATCCGGCAATGATTGGTAATT-3’；

[0021] 根据本发明优选的，所述步骤(1)中，扩增体系如下：

[0022] 2×Hifi PCR Mix 10μL，大肠杆菌基因组DNA模板1μL，正向引物sll0659-1-F 1μL，反向引物sll0659-1-BamHI-R 1μL，ddH2O 7μL，总反应体系为20μL。

[0023] 根据本发明优选的，所述步骤(1)中，扩增体系如下：

[0024] 94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后；72℃10min，4℃保存。

[0025] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，扩增引物核苷酸序列如下：

[0026] sll0659-2-BamHI-F:5’-GCAGGATCCAATACTTTTGGGAAGCT-3’；

[0027] sll0659-2-SalI-R:5’-CACGTCGACTCAATGGTGGAAATCGT-3’；

[0028] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，扩增体系如下：

[0029] 2×Hifi PCR Mix 10μL，大肠杆菌基因组DNA模板1μL，正向引物sll0659-2-BamHI-F1μL，反向引物sll0659-2-SalI-R 1μL，ddH2O 7μL，总反应体系为20μL。

[0030] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，扩增体系如下：

[0031] 94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后；72℃10min，4℃保存。

[0032] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中，载体为T3载体。

[0033] 本发明用于构建集胞藻PCC6803中的sll0659基因敲除的集胞藻PCC6803中的sll0659基因序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

[0034] 集胞藻PCC6803中的sll0659基因序列为1569个碱基，编码323个氨基酸。通过在sll0659基因片段中插入庆大霉素抗性片段，构建sll0659基因敲除载体，再进行遗传转化集胞藻PCC6803，抑制集胞藻PCC6803内源基因sll0659的表达，得到集胞藻PCC6803 sll0659基因表达受到抑制的转基因突变藻株。经HPLC检测结果表明，sll0659基因敲除突变株中蓝藻叶黄素含量增加了22.3％，玉米黄素含量增加了31.3％，而海胆酮含量降低了34.3％，β-胡萝卜素百分含量则降低了1.3％。同时，HPLC检测结果表明，与野生型集胞藻PCC6803相比，sll0659基因敲除突变体中明显增加了α-胡萝卜素的含量，降低了光系统组分PSI/PSII比例。

[0035] 有益效果

[0036] 1、本发明提供了一种在集胞藻PCC6803β-类胡萝卜素合成中具有重要作用的集胞藻PCC6803中sll0659基因的应用，通过将集胞藻PCC6803中的sll0659基因敲除后，集胞藻PCC6803的叶黄素含量增加了22.3％，玉米黄素含量增加了31.3％，而海胆酮含量降低了34.3％，β-胡萝卜素百分含量则降低了1.3％。同时，HPLC检测结果表明，与野生型集胞藻PCC6803相比，sll0659基因敲除突变体中类胡罗卜素组分中有一个明显的峰，经与标品对照检测，确定其为α-胡萝卜素。

[0037] 2、本发明在集胞藻PCC6803中定向敲除sll0659基因，对于提高集胞藻PCC6803中蓝藻叶黄素、玉米黄素和α-胡萝卜素含量、增强其生物量、提高光合效率具有重要意义，这为集胞藻PCC6803中类胡萝卜素的研究提供了理论支持。

[0038] 3、本发明中应用的基因可以为微藻及植物类胡萝卜素研究提供支持。

附图说明

[0039] 图1为集胞藻PCC6803中类胡萝卜素生物合成途径示意图；

[0040] 图2为集胞藻PCC6803 sll0659基因敲除载体结构图；

[0041] 图3为集胞藻PCC6803 sll0659基因敲除突变体PCR扩增检测图；

[0042] 图4为集胞藻PCC6803 sll0659基因敲除突变体生长曲线图；

[0043] 图5为集胞藻PCC6803 sll0659基因敲除突变体光处理条件下77k荧光参数检测图；

[0044] 图中：A，普通光40μmol photons m-2s-1处理条件下77k荧光参数检测图；

[0045] B，强光200μmol photons m-2s-1处理条件下77k荧光参数检测图；

[0046] 图6为集胞藻PCC6803 sll0659基因敲除突变体HPLC检测图。

具体实施方式

[0047] 下面结合说明书附图及实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。以下实施例描述了本发明在构建集胞藻PCC6803 sll0659基因敲除及过量表达载体及转化集胞藻PCC6803的方法。

[0048] 施例中所用实验材料来源如下：

[0049] 大肠杆菌菌株(Escherichia coli)DH5α及载体T3购自北京全式金生物技术有限公司，

[0050] 野生型集胞藻PCC6803购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库；

[0051] 质粒pBluescript-Gm购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心；

[0052] 其它所使用的酶、试剂及试剂盒等均为市售产品。

[0053] 实施例1

[0054] 分离克隆用于构建转集胞藻PCC6803 sll0659基因敲除的sll0659基因cDNA片段：

[0055] 登录：http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝Blast

[0056] Search&LINK_LOC＝blasthome，输入聚球藻7002CruP核苷酸序列(Genbank登录号：EF529627.1)，得到序列号为CP003265.1的集胞藻PCC6803中的sll0659基因序列。

[0057] 用于构建集胞藻PCC6803 sll0659基因敲除载体的sll0659基因上下游片段扩增：

[0058] 根据GenBank数据库中公布的集胞藻PCC6803  sll0659序列(登录号为：CP003265.1)设计扩增集胞藻PCC6803 sll0659上游cDNA片段引物：

[0059] sll0659-1-F：5’-ATGAACTATGCAACTACACC-3’；

[0060] sll0659-1-BamHI-R:5’-CGAGGATCCGGCAATGATTGGTAATT-3’；

[0061] 扩增体系如下：

[0062] 2×Hifi PCR Mix 10μL，大肠杆菌基因组DNA模板1μL，正向引物sll0659-1-F 1μL，反向引物sll0659-1-BamHI-R 1μL，ddH2O 7μL，总反应体系为20μL。

[0063] 扩增程序如下:94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。

[0064] PCR反应结束后进行电泳切胶回收，连接到T3载体克隆载体后转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并测序，制得上游片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

[0065] 扩增集胞藻PCC6803 sll0659下游cDNA片段引物：

[0066] sll0659-2-BamHI-F:5’-GCAGGATCCAATACTTTTGGGAAGCT-3’；

[0067] sll0659-2-SalI-R:5’-CACGTCGACTCAATGGTGGAAATCGT-3’；

[0068] 扩增体系如下：

[0069] 2×Hifi PCR Mix 10μL，大肠杆菌基因组DNA模板1μL，正向引物sll0659-2-BamHI-F1μL，反向引物sll0659-2-SalI-R 1μL，ddH2O 7μL，总反应体系为20μL。

[0070] 扩增程序如下:94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。

[0071] PCR反应结束后进行电泳切胶回收，连接到T3载体克隆载体后转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并测序。制得下游片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0072] 实施例2

[0073] 集胞藻PCC6803 sll0659基因敲除载的构建及转化

[0074] 通过插入失活技术，突变集胞藻PCC6803中sll0659基因片段，根据sll0659基因缺失突变藻株的表型和类胡萝卜素组成研究集胞藻PCC6803sll0659基因在类胡萝卜素合成及光合作用中的应用。

[0075] 集胞藻PCC6803 sll0659基因敲除载体构建：

[0076] 将实施例1制得的集胞藻PCC6803 sll0659基因的上游片段阳性克隆质粒用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切，回收载体片段1；用同样的方法双酶切集胞藻PCC6803 sll0659基因的下游片段阳性克隆质粒，回收片段2。用回收的片段2和载体片段1做连接反应，转化大肠杆菌DH5α。通过筛选阳性克隆，获得sll0659BamHI载体，然后用限制性内切酶BamHI单酶切sll0659BamHI载体，回收载体片段sll0659BamHI；用限制性内切酶BamHI单酶切pBluescript-Gm载体，回收庆大霉素抗性片段。用回收的庆大霉素抗性片段和载体片段sll0659BamHI做连接反应，转化转化大肠杆菌DH5α。通过筛选阳性克隆，获得集胞藻PCC6803 sll0659基因敲除载体，命名为pKNsll0659-Gm(如图1所示)。

[0077] 通过自然转化方法(Williams,J.G.K,1988.Construction of specific mutationsin photosystem II photosynthetic reaction center by genetic engineering methods inSynechocystis6803.Methods Enzymol.167:766-778.)将构建好的载体导入集胞藻PCC6803中，经抗生素筛选，鉴定得到转基因阳性集胞藻，步骤如下：

[0078] 取对数培养期(OD730＝0.6)的集胞藻PCC6803 30ml于室温，4500g离心8min，弃上清；加新鲜BG-11液体培养基洗涤一次后，加新鲜BG-11液体培养基至终浓度OD730＝4.8，并立刻用来转化；将收集的藻液分装到到1.5ml EP管中(每管400μl)，每管加5-10μg质粒，弱光条件下光照温育6小时，期间摇晃一次。将混合物涂到含有庆大霉素抗生素(10μg/ml)的BG-11平板培养基上。约10天可见转化子。制得制得含sll0659基因敲除载体pKNsll0659-Gm的转基因集胞藻PCC6803。

[0079] 实施例3

[0080] sll0659基因敲除藻株PCR检测

[0081] 以含敲除载体pKNsll0659的转基因集胞藻PCC6803和野生型集胞藻PCC6803为材料，提取总DNA进行PCR检测分析。具体方法如下：

[0082] 采用中性酚试剂(购自Invitrogen公司)并利用玻璃珠震荡法从sll0659基因敲除和过表达的集胞藻和野生型集胞藻中提取DNA。具体操作步骤如下：

[0083] 取50ml OD730＝1.8的蓝藻，4℃，5000rpm离心10min收集藻细胞，加入0.4mL中性酚试剂(购自Invitrogen公司)接0.4mL BG-11液体培养基，然后加入适量的直径为0.17mm左右的玻璃珠(购自sigma公司)至玻璃珠界面上方有0.5mL的悬浮液。通过涡旋振荡器以最大速率震荡1min，4℃，11900rpm离心10min，取上清液至新的1.5ml离心管中，加入0.5mL苯酚/三氯甲烷/异戊醇(体积比25:24:1)，颠倒混匀15s，静置3～5min，4℃，11900rpm离心10～15min。取上清到新的1.5ml离心管中，加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min。4℃，
11900rpm离心10min。去上清，加入1ml 75％乙醇(v/v)，颠倒振荡几次，4℃，7500rpm离心
10min。弃上清，室温下敞口晾干至沉淀透明，加入适量ddH2O溶解沉淀，分别制得sll0659基因敲除和过表达的集胞藻和野生型集胞藻总DNA。

[0084] 以sll0659基因敲除转基因集胞藻基因组DNA和野生型集胞藻DNA为模板，以sll0659-1-F和sll0659-2-SalI-R为引物，进行PCR扩增，具体扩增程序如下：

[0085] 94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。

[0086] 反应体系：

[0087] 2×Hifi PCR Mix 10μL，大肠杆菌基因组DNA模板1μL，正向引物sll0659-1-F 1μL，反向引物sll0659-2-SalI-R 1μL，ddH2O 7μL，总反应体系为20μL。

[0088] 电泳检测PCR产物结果如图3所示。

[0089] 实施例4

[0090] 集胞藻PCC6803 sll0659基因敲除突变藻株生长曲线测定

[0091] 将野生型集胞藻PCC6803和sll0659基因敲除藻株接种于50ml BG-11液体培养基中，调节OD730＝0.1，于30℃，40μE.m-2.s-1持续光照条件下振荡培养(180rpm)，分别于1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天取样，通过测定OD730来监测其生长情况，结果如图4所示。

[0092] 由图4可以看出，初始接种浓度为OD730＝0.1，接种后野生型集胞藻PCC6803和sll0659基因敲除突变株生长速度逐渐增加。但sll0659基因敲除突变体生长速度均明显低于野生型集胞藻PCC6803，在第5天二者浓度差达到最大，第6天后两者浓度差逐渐变小，第7天时，突变株已接近野生型浓度。说明sll0659基因敲除在一定程度上影响了突变株的生长，但是培养一段时间后，二者差距逐渐降低。

[0093] 实施例5

[0094] 集胞藻PCC6803 sll0659基因敲除突变藻株77k荧光发射光谱检测

[0095] 将野生型集胞藻PCC6803和sll0659基因敲除突变藻株接种于50ml BG-11液体培养基中，调节OD730＝0.1，于30℃，40μE.m-2.s-1持续光照条件下振荡培养(180rpm)，于第7天取1ml液体培养液，13,000rpm离心5分钟，弃上清，加1ml DMF(N,N-二甲基甲酰胺，购自国药集团化学试剂有限公司)，混匀，13,000rpm离心3分钟，利用分光光度计检测OD625和OD664值。根据叶绿素计算公式计算叶绿素含量(Chlorophyll a，μg/ml)：

[0096] [Chlorophyll a]＝12.1OD664-0.17OD625

[0097] 离心收集藻体，调整叶绿素含量为15mg，加1ml BG-11液体培养基，吸打混匀，于叶绿素荧光分析仪检测77k值，结果如图5所示。

[0098] 由图5可以看出，普通光处理条件下，与野生型集胞藻PCC6803相比，sll0659基因敲除突变株PSI/PSII比例明显增加；而强光处理条件下，与野生型相比，sll0659基因敲除突变株PSI/PSII比例明显降低。

[0099] 实施例6

[0100] 集胞藻PCC6803 sll0659基因敲除突变藻株类HPLC检测

[0101] 将野生型集胞藻PCC6803和sll0659基因过敲除突变藻株接种于50ml BG-11液体培养基中，于对数生长期离心收集藻细胞，于液氮中冷冻干燥。用甲醇(HPLC级别)从冷冻干燥的野生型集胞藻PCC6803和sll0659基因敲除突变藻株细胞中提取色素。通过高效液相色谱法(HPLC)分离类胡萝卜素，所用色谱柱型号为Spherisorb ODS24.0mm×250mm C18色谱柱，15分钟内乙酸乙酯梯度为0-100％，乙氰-水-三乙胺(体积比为9:1:0.01)流速为1ml/min。个别峰的吸收光谱利用光电二极管阵列检测器获得。β-carotene标准品购自美国Sigma公司，结果如图6所示。

[0102] 由图6可以看出，通过将集胞藻PCC6803中的sll0659基因敲除后，集胞藻PCC6803的叶黄素含量增加了22.3％，玉米黄素含量增加了31.3％，而海胆酮含量降低了34.3％，β-胡萝卜素百分含量则降低了1.3％。同时，HPLC检测结果表明，与野生型集胞藻PCC6803相比，sll0659基因敲除突变体中类胡萝卜素组分中有一个明显的峰，经与标品对照检测，确定其为α-胡萝卜素。