基于牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇探测一氧化氮的方法

摘要

本发明涉及基于牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇探测一氧化氮的方法，包括：(1)配置牛血清蛋白水溶液，加入贵金属盐溶液，用氢氧化钠调节至pH为11～12，在避光条件下反应8～12小时，以制备牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇；(2)配置NO饱和溶液，稀释成不同浓度的NO标准溶液，用格里斯试剂测各一氧化氮溶液的浓度；(3)将一定浓度的牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇与不同浓度的一氧化氮溶液反应，测定其在不同NO浓度下的荧光强度，构建NO浓度与荧光强度之间的线性关系，得到基于牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇NO荧光探针。与现有技术相比，本发明方便简单，经济，制备的荧光探针选择性高，灵敏性好，对NO的高效探测有巨大的应用价值。

权利要求

1.一种基于牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇探测一氧化氮的方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：(1)配置牛血清蛋白水溶液，加入贵金属盐溶液，用氢氧化钠调节至pH为11～12，在避光条件下反应8～12小时，以制备牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇；

(2)配置NO饱和溶液，稀释成不同浓度的NO标准溶液，用格里斯试剂测各一氧化氮溶液的浓度；

(3)将一定浓度的牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇与不同浓度的一氧化氮溶液反应，测定其在不同NO浓度下的荧光强度，构建NO浓度与荧光强度之间的线性关系，进而得到基于牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇NO荧光探针。

2.根据权利要求1所述的基于牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇探测一氧化氮的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的贵金属盐溶液为HAuCl4﹒4H2O或AgNO3，其浓度为5～10mM；

牛血清蛋白水溶液的浓度为10～50mg/mL。

3.根据权利要求1所述的基于牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇探测一氧化氮的方法，其特征在于，步骤(1)调节pH值为11～12后加入还原剂，还原剂为硼氢化钠，硼氧化钠的浓度为0.5～10mM。

4.根据权利要求1所述的基于牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇探测一氧化氮的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的NO标准溶液的浓度为0.01～2.1mM。

5.根据权利要求1所述的基于牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇探测一氧化氮的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇与一氧化氮溶液的反应液中贵金属纳米簇的浓度为0.5～2mg/mL。

说明书

基于牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇探测一氧化氮的

方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物材料，荧光探针及纳米医药技术领域，具体涉及一种基于牛血清蛋白修饰的荧光金属纳米簇的一氧化氮荧光探针的制法。

背景技术

[0002] 一氧化氮(nitric oxide,NO)作为信使分子，在人体中有免疫调节、神经传递、血压生理调控等极为重要的生理作用。一氧化氮是一种气体自由基，具有寿命短，活泼性高，易于和其他物质发生反应的特点。因此，在生物体内灵敏地、有选择性地探测一氧化氮就成为一种具有挑战性的工作，也是近几年的研究热点之一。现有的一氧化氮的探测方法主要有化学发光法、分光光度法、电化学方法、电子顺磁共振波谱法等方法，但是这些方法具有耗时长，线性范围窄，精确度不高等缺点，相对于这些方法，荧光探针法具有灵敏度高、选择性好、操作简单等优点。

[0003] 现有的一氧化氮荧光探针主要包括含有金属离子的荧光探针和邻苯二胺类有机荧光探针，尽管这些分子有很好的选择性和灵敏性，但是具有一定的细胞毒性，因此，研究一种具有高灵敏性、选择性、高生物相容性及低细胞毒性等优点的一氧化氮荧光探针成为一项重要课题。

[0004] 荧光贵金属纳米簇具有很好的生物相容性和低细胞毒性等特点，在生物医学等方面有很大的用途。牛血清蛋白有极好的生物相容性且没有细胞毒性，所以牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇在生物标记和成像及医学等方面有很大的应用价值。基于NO可以使牛血清蛋白的结构发生改变，从而使牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇荧光淬灭的机理，就可以设计一种高灵敏性和选择性的高效荧光探针，对生物体内NO的探测有巨大的应用价值。

[0005] 目前为止，未见牛血清蛋白稳定的荧光贵金属纳米簇来探测一氧化氮的相关中国专利的报道。因此，基于牛血清蛋白修饰的贵金属纳米簇的一氧化氮荧光探针，发展生物体内NO的荧光探测，这些研究预示了这种特殊的NO探针是一项有意义的工作，也是当前相关研究中亟待解决的关键技术问题。

发明内容

[0006] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种简单、经济、高生物相容性、低毒性，在生物医药领域拥有良好应用前景的基于牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇探测一氧化氮的方法。

[0007] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇探测一氧化氮的方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：

[0008] (1)配置牛血清蛋白水溶液，加入贵金属盐溶液，用氢氧化钠调节至pH为11～12，在避光条件下反应8～12小时，以制备牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇；

[0009] (2)配置NO饱和溶液，稀释成不同浓度的NO标准溶液，用格里斯试剂测各一氧化氮溶液的浓度；

[0010] (3)将一定浓度的牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇与不同浓度的一氧化氮溶液反应，测定其在不同NO浓度下的荧光强度，构建NO浓度与荧光强度之间的线性关系，进而得到基于牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇NO荧光探针。

[0011] 步骤(1)中所述的贵金属盐溶液为HAuCl4.4H2O或AgNO3，其浓度为5～10Mm；牛血清蛋白水溶液的浓度为10～50mg/mL。

[0012] 步骤(1)调节pH值为11～12后加入硼氢化钠作为还原剂，硼氧化钠的浓度为0.5～10mM。

[0013] 步骤(2)中所述的NO标准溶液的浓度为0.01～2.1mM。

[0014] 步骤(3)中所述的牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇与一氧化氮溶液的反应液中贵金属纳米簇的浓度为0.5～2mg/mL。

[0015] 本发明采用有极好的生物相容性且没有细胞毒性的牛血清蛋白为原料修饰的荧光贵金属纳米簇，在生物标记和成像及医学等方面有很大的应用价值。基于NO可以使牛血清蛋白的结构发生改变，从而使牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇荧光淬灭的机理，设计了一种高灵敏性和选择性的高效荧光探针，对生物体内NO进行探测。

[0016] 与现有技术相比，本发明用简单，经济的方法制备出牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇，测定该体系的荧光强度与NO浓度之间的关系，从而获得基于该体系的一氧化氮荧光探针。与现有的探测一氧化氮的技术相比，本发明方法简单，经济，制备的一氧化氮荧光探针生物相容性好，低毒性，荧光强度高，对于NO的高效探测有巨大的应用价值。

具体实施方式

[0017] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

[0018] 实施例1

[0019] 基于牛血清蛋白修饰的荧光贵金属纳米簇探测一氧化氮的方法，详细的步骤过程如下：配置50mg/mL的牛血清蛋白溶液，加入10mM的HAuCl4.4H2O溶液，两分钟后加入氢氧化钠溶液调节pH约为12，避光条件下反应12小时，以制备牛血清蛋白修饰的荧光金纳米簇。配置浓度为2.1mM的一氧化氮饱和溶液，分别稀释成浓度为0.08mM,0.18mM,0.26mM,0.32mM,0.45mM,0.85mM的一氧化氮溶液。用浓度都为1mg/mL的牛血清蛋白修饰的金纳米簇溶液与上述不同浓度的一氧化氮溶液反应，然后测其在不同NO浓度下的荧光强度，得到NO浓度与荧光强度之间的线性关系，从而得到基于牛血清蛋白修饰的荧光金纳米簇探测一氧化氮的方法。

[0020] 实施例2

[0021] 配置25mg/mL的牛血清蛋白溶液，加入5mM的HAuCl4.4H2O溶液，两分钟后加入氢氧化钠溶液调节PH约为12，避光条件下反应12小时，以制备牛血清蛋白修饰的荧光金纳米簇。配置浓度为2.1mM的一氧化氮饱和溶液，分别稀释成浓度0.09mM,0.21mM,0.25mM,0.31mM,
0.43mM,0.81mM的一氧化氮溶液。用浓度都为0.5mg/mL的牛血清蛋白修饰的金纳米簇溶液与上述不同浓度的一氧化氮溶液反应，然后测其在不同NO浓度下得荧光强度，得到NO浓度与荧光强度之间的线性关系，从而得到基于牛血清蛋白修饰的荧光金纳米簇探测一氧化氮的方法。

[0022] 实施例3

[0023] 配置50mg/mL的牛血清蛋白溶液，加入10mM的AgNO3溶液，加入氢氧化钠溶液调节PH约为12，再加入10mM的硼氢化钠溶液做还原剂，避光条件下反应12小时，以制备牛血清蛋白修饰的荧光银纳米簇。配置浓度为2.1mM的一氧化氮饱和溶液，分别稀释成浓度为0.13mM,0.38mM,0.56mM,0.86mM,0.94mM,1.20mM的一氧化氮溶液。用浓度都为1mg/mL的牛血清蛋白修饰的银纳米簇与上述不同浓度的一氧化氮溶液反应，然后测其在不同NO浓度下的荧光强度，得到NO浓度与荧光强度之间的线性关系，从而得到基于牛血清蛋白修饰的银纳米簇探测一氧化氮的方法。

[0024] 实施例4

[0025] 配置25mg/mL的牛血清蛋白溶液，加入5mM的AgNO3溶液，加入氢氧化钠溶液调节PH约为12，再加入5mM的硼氢化钠溶液做还原剂，避光条件下反应12小时，以制备牛血清蛋白修饰的荧光银纳米簇。配置浓度为2.1mM的一氧化氮饱和溶液，分别稀释成浓度为0.11mM,0.41mM,0.55mM,0.83mM,0.91mM,1.08mM的一氧化氮溶液。用浓度都为1mg/mL的牛血清蛋白修饰的荧光银纳米簇与上述不同浓度的一氧化氮溶液反应，然后测其在不同NO浓度下的荧光强度，得到NO浓度与荧光强度之间的线性关系，从而得到基于牛血清蛋白修饰的银纳米簇探测一氧化氮的方法。

[0026] 实施例5

[0027] 配置10mg/mL的牛血清蛋白溶液，加入8mM的AgNO3溶液，加入氢氧化钠溶液调节pH为11～12，再加入8mM的硼氢化钠溶液做还原剂，避光条件下反应8小时，以制备牛血清蛋白修饰的荧光银纳米簇。配置浓度为2.1mM的一氧化氮饱和溶液，分别稀释成浓度为0.01mM,0.41mM,0.55mM,0.83mM,0.91mM,1.08mM的一氧化氮溶液。用浓度都为2mg/mL的牛血清蛋白修饰的荧光银纳米簇与上述不同浓度的一氧化氮溶液反应，然后测其在不同NO浓度下的荧光强度，得到NO浓度与荧光强度之间的线性关系，从而得到基于牛血清蛋白修饰的银纳米簇探测一氧化氮的方法。