本发明公开了一种基于SERS的新城疫病毒检测试剂盒及其检测方法，属于光谱学和分子诊断领域。所述基于SERS的新城疫病毒检测试剂盒包括拉曼探针溶液和硝酸纤维素膜；所述的拉曼探针溶液为纳米金、3,3'‑二硫双(6‑硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯复合物与新城疫抗体偶联溶液。检测方法为在硝酸纤维素膜上滴加新城疫病毒，经过封闭和洗涤步骤后与偶联有抗体的拉曼探针孵育，在硝酸纤维素膜上形成“固相抗原‑标记抗体”半夹心结构的免疫复合物，最后对免疫复合物进行拉曼光谱检测，即可以高特异性的识别待测物的增强的拉曼分子信号。本发明涉及的检测试剂盒及其检测方法特异性强，对新城疫病毒的检测限达103PFU/mL，灵敏度高。
1.一种基于SERS的新城疫病毒检测试剂盒，其特征在于：包括拉曼探针溶液和硝酸纤维素膜；
所述的拉曼探针溶液为纳米金、3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯复合物与新城疫抗体偶联溶液；所述的纳米金、3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯复合物与新城疫抗体偶联溶液，通过以下方法制备获得：(1)纳米金与3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯偶联，具体制备步骤为：称
1mg的3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯在1.5mL离心管，加入100μL乙腈，完全
溶解变澄清；取30μL加入1mL的浓度为9×10 颗粒/mL胶体金溶液，涡旋混匀；室温震荡过夜，获得纳米金与3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯偶联溶液；
(2)纳米金、3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯(DSNB)复合物与新城疫抗体偶联：将步骤(1)中4℃过夜溶液，12000rpm，10min离心，可见深紫色小点在底部；移除上清液，用等体积的超纯水重新悬浮纳米金，再12000rpm，10min离心去除3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯；移除上清液，用1mL超纯水重悬纳米金溶液；取1uL的1mg/mL新城疫抗体加入1mL的纳米金和DSNB混合液中；涡旋混匀，室温震荡过夜后获得。
2.根据权利要求1所述的基于SERS的新城疫病毒检测试剂盒，其特征在于：所述的新城疫抗体为新城疫单克隆抗体或新城疫多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的基于SERS的新城疫病毒检测试剂盒，其特征在于：所述的胶体金溶液中纳米金颗粒的直径为20nm，纳米金颗粒的浓度为9×1011颗粒/mL。
4.根据权利要求3所述的基于SERS的新城疫病毒检测试剂盒，其特征在于：所述的纳米金颗粒，通过下述制备方法获得：将1mL的质量分数1％氯金酸溶解于100mL超纯水中，随后加入2mL的质量分数1％柠檬酸钠溶液，并用0.1M碳酸钾将pH调至7，在有冷凝回流装置中50℃-100℃加热20-30分钟，直到颜色变成深紫色；得到纳米颗粒经光子相关光谱测量大小为
5.根据权利要求1所述的基于SERS的新城疫病毒检测试剂盒，其特征在于：所述的3,
3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯，通过下述的的制备方法获得：取100mL圆底双口烧瓶，氮气条件下，加入50mL干燥四氢呋喃，加入0.5g的5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)溶解，再加入0.29g的N-羟基丁二酰亚胺，冰浴，加入0.42mL二环己基碳二亚胺，撤去冰浴，室温下，回流搅拌12h；抽滤反应液，取滤液，40℃下旋蒸除去溶剂得到粗产品，使用丙酮重结晶，获得3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯。
6.应用权利要求1～5任一项所述的试剂盒进行新城疫病毒的检测方法，其特征在于：
将新城疫病毒滴入硝酸纤维素膜中，室温干燥后，将硝酸纤维素膜浸泡于5％的脱脂奶粉，置于37℃摇床封闭1h；TBST洗膜3次，每次5min；取出硝酸纤维素膜浸泡于拉曼探针溶液，37℃摇床孵育1h，TBST洗膜3次，每次5min；待硝酸纤维素膜干燥后，利用拉曼光谱仪对免疫复合物进行拉曼检测，即可以高特异性的识别待测物的增强的拉曼分子信号，实现新城疫病毒的检测。
7.根据权利要求6所述的新城疫病毒的检测方法，其特征在于：所述的拉曼光谱仪为SmartRaman便携式拉曼光谱仪。
8.根据权利要求6所述的新城疫病毒的检测方法，其特征在于：所述的拉曼光谱仪检测条件为：激光波长785nm，激光功率为100mW、积分时间为3s、波数范围是700-2000cm-1。
一种基于SERS的新城疫病毒检测试剂盒及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于光谱学和分子诊断领域，具体涉及一种基于SERS(表面增强拉曼光谱技术)的新城疫病毒检测试剂盒及其他人检测方法。
背景技术
[0002] 新城疫(Newcastle disease,ND)又称亚洲鸡瘟，是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种以呼吸道、消化道黏膜出血为典型病变的高度接触性、急性败血性禽病传染病，具有较高的发病率和死亡率，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告动物疫病。ND多年来广泛存在于各类禽群中，给我国养殖业生产造成巨大的经济损失。目前，现有的针对新城疫病毒的检测技术主要包括：病毒分离培养、血凝抑制(HI)试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、RT-PCR和免疫荧光技术等。其中病毒分离培养与酶联免疫吸附试验(ELISA)存在耗时长、步骤繁琐问题；RT-PCR方法虽然能实现具有较高灵敏度的快速检测，但是要求操作人员具有一定的专业技术能力并且需要昂贵的仪器；免疫荧光技术存在假阳性、荧光猝灭问题。与上述检测方法相比，本发明建立的检测方法具有操作简单、用时少和灵敏度高的优点。
[0003] 表面增强拉曼散射(SERS)是通过吸附在金属纳米结构表面上的分子与金属表面发生的等离子共振(SPR)相互作用而引起的拉曼散射强度增强的现象，目前SERS增强效应平均值约为106数量级。拉曼光谱技术作为一种高灵敏度的表征手段，在微生物的分析和检测中发挥了重要作用。而目前缺少将拉曼光谱技术应用到新城疫病毒检测方面的高效试剂盒等研究。
发明内容
[0004] 为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基于SERS(表面增强拉曼光谱技术)的新城疫病毒检测试剂盒。
[0005] 本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的检测方法。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于SERS的新城疫病毒检测试剂盒，包括拉曼探针溶液和硝酸纤维素膜；
[0007] 所述的拉曼探针溶液包括新城疫抗体、3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯(DSNB)和胶体金溶液，所述的拉曼探针溶液为纳米金、3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯复合物与新城疫抗体偶联溶液。
[0008] 所述的新城疫抗体为新城疫单克隆抗体或新城疫多克隆抗体。
[0009] 所述的胶体金溶液中纳米金颗粒的直径为20nm，浓度为9×1011颗粒/mL。
[0010] 所述的纳米金颗粒，通过下述制备方法获得：将1mL的质量分数1％氯金酸(HAuCL4)溶解于100mL超纯水中，随后加入2mL的质量分数1％柠檬酸钠溶液(Na3C6H507)，并用0.1M碳酸钾(K2CO3)将pH调至7，上述溶液在有冷凝回流装置中50℃-100℃加热20-30分钟，直到颜色变成深紫色；得到纳米颗粒经光子相关光谱测量大小约为20nm，浓度为9×1011颗粒/mL。
[0011] 所述的3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯(DSNB)，通过下述的制备方法获得：取100mL圆底双口烧瓶，氮气条件下，加入50mL干燥四氢呋喃，加入0.5g的5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)溶解，再加入0.29g的N-羟基丁二酰亚胺，冰浴，加入0.42mL二环己基碳二亚胺，撤去冰浴，室温下，回流搅拌12h；抽滤反应液，取滤液，40℃下旋蒸除去溶剂得到粗产品，使用丙酮重结晶，获得3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯。
[0012] 所述的纳米金、3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯复合物与新城疫抗体偶联溶液，通过以下方法制备获得：
[0013] (1)纳米金与3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯偶联，具体制备步骤为：称1mg的3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯在1.5mL离心管，加入100μLACN(乙腈)，完全溶解变澄清；取30μL加入1mL胶体金溶液(浓度为9×1011颗粒/mL，OD＝3.0的胶体金溶液对半稀释)，涡旋混匀；室温震荡过夜，获得纳米金与3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯偶联溶液；
[0014] (2)纳米金、3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯复合物与新城疫抗体偶联：将步骤(1)中室温震荡过夜溶液，12000rpm，10min离心，底部可见深紫色小点；移除上清液，用等体积的超纯水重新悬浮纳米金，12000rpm，10min再次离心去除3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯；移除上清液，用1mL超纯水重悬纳米金溶液；取1μL的1mg/mL的新城疫抗体加入到1mL的纳米金和3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯(DSNB)混合液中；涡旋混匀，室温震荡过夜后获得。
[0015] 应用上述试剂盒进行新城疫病毒检测的方法，包括以下步骤：
[0016] 将新城疫病毒滴入硝酸纤维素膜中，室温干燥后，将硝酸纤维素膜浸泡于5％的脱脂奶粉，置于37℃摇床封闭1h；TBST洗膜3次，每次5min；取出硝酸纤维素膜浸泡于拉曼探针溶液，37℃摇床孵育1h，TBST洗膜3次，每次5min；待硝酸纤维素膜干燥后，利用拉曼光谱仪对免疫复合物进行拉曼检测，即可以高特异性的识别待测物增强的拉曼分子信号，实现新城疫病毒的检测。
[0017] 所述的拉曼光谱仪为SmartRaman便携式拉曼光谱仪。
[0018] 所述的拉曼光谱仪检测条件为：激光波长785nm,激光功率为100mW、积分时间为3s、波数范围是700-2000cm-1。
[0019] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0020] 本发明是基于SERS的新城疫病毒检测试剂盒及其检测方法。应用SERS的免疫检测技术，首先将病毒滴入硝酸纤维素膜中，经过封闭、洗涤步骤后加入偶联抗体的拉曼探针，这样就在硝酸纤维素膜上形成了“固相抗原-标记抗体”半夹心的免疫复合物，对该免疫复合物进行拉曼光谱检测，即可高特异性地识别待测物的增强的拉曼分子信号。本发明的检测方法可以用于高灵敏度的新城疫病毒检测。
附图说明
[0021] 图1是本发明的新城疫病毒特异性检测结果图，其中，图中A表示新城疫病毒样品拉曼光谱检测图，B表示禽流感病毒样品拉曼光谱检测图，C表示SPF鸡胚尿囊液样品拉曼光谱检测图。
[0022] 图2是本发明的新城疫病毒灵敏度检测结果图，图中A、B、C分别表示新城疫病毒100倍、1000倍、10000倍稀释后的拉曼光谱图。
具体实施方式
[0023] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0024] 下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025] 实施例1
[0026] 本发明中提供了一种基于SERS(表面增强拉曼光谱技术)的新城疫病毒检测试剂盒及其检测方法，具体步骤如下：
[0027] (1)纳米金的制备：将1mL的质量分数1％氯金酸(HAuCL4)溶解于100mL超纯水中，随后加入2mL的质量分数1％柠檬酸钠溶液(Na3C6H507)，大约用1mL的0.1M碳酸钾(K2CO3)将pH调至7；上述溶液在有冷凝回流装置中50℃-100℃加热20-30分钟，直到颜色变成深紫色。得到纳米颗粒经光子相关光谱测量大小约为20nm，浓度为9×1011颗粒/mL；
[0028] (2)3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯的制备：取100mL圆底双口烧瓶，氮气条件下，加入50mL干燥四氢呋喃，加入0.5g的5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)溶解，再加入0.29g的N-羟基丁二酰亚胺，冰浴，加入0.42mL二环己基碳二亚胺，撤去冰浴，室温25℃下，回流搅拌12h；抽滤反应液，取滤液，40℃下旋蒸除去溶剂得到粗产品，使用丙酮重结晶得到纯品；
[0029] (3)纳米金与3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯偶联：称1mg 3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯在1.5mL离心管,加入100μL ACN(乙腈)，会完全溶解变澄清；取30μL加入1mL液体金水溶液(原溶液OD＝3.0溶液对半稀释)，涡旋混匀；室温震荡过夜；
[0030] (4)纳米金、3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯复合物与抗体偶联：将上述4℃过夜溶液，12000rpm，10min离心，可见深紫色小点在底部；移除上清液,用等体积的超纯水重新悬浮纳米金米金，再12000rpm，10min离心去除3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯；移除上清液，用1mL超纯水重悬纳米金溶液；取1μL抗体(浓度为1mg/mL)加入到1mL的纳米金和DSNB混合液中；涡旋混匀，室温震荡过夜；
[0031] (5)表面增强拉曼光谱检测新城疫病毒：将新城疫病毒滴入硝酸纤维素膜中，室温干燥后，将硝酸纤维素膜浸泡于5％的脱脂奶粉，置于37℃摇床封闭1h；TBST洗膜3次，每次5min；取出硝酸纤维素膜浸泡于偶联抗体的拉曼标记物溶液中，37℃摇床孵育1h，TBST洗膜
3次，每次5min；待硝酸纤维素膜干燥后，利用拉曼光谱仪对免疫复合物进行拉曼光谱检测，即可以高特异性的识别待测物的增强的拉曼分子信号。同时设立空白对照组。
[0032] 新城疫病毒特异性检测的具体实施方案如下：取4μL新城疫病毒、4μL禽流感病毒、4μLSPF鸡胚尿囊液分别滴入3小块硝酸纤维素膜(20mm×10mm)，并标记为A、B、C；室温干燥后，将硝酸纤维素膜浸泡于5％的脱脂奶粉溶液中，置于37℃摇床封闭1h；TBST溶液洗膜3次，每次5min；分别取3块膜置于拉曼探针溶液37℃摇床孵育1h；TBST洗膜3次，每次5min；待硝酸纤维素膜干燥后，利用拉曼光谱仪对3块硝酸纤维素膜进行拉曼光谱检测；拉曼光谱仪测定功率为100mW，波长为785nm，积分时间为3s；拉曼光谱仪检测首先分别以3块硝酸纤维素膜空白处作为暗电流扣除，然后分别检测A、B、C 3块硝酸纤维素膜经本发明所述的检测方法处理后的阳性样品位置，得到光谱图，结果如图1所示。
[0033] 由图1可知，A表示新城疫病毒样品拉曼光谱检测图，图中有3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯(DSNB)特征波峰即1340cm-1处波峰，说明偶联DSNB的新城疫单抗与新城疫病毒特异性结合。B表示禽流感病毒样品拉曼光谱检测图，C表示SPF鸡胚尿囊液样品拉曼光谱检测图，B、C图中无DSNB特征波峰，说明偶联DSNB的新城疫单抗不能特异性结合禽流感病毒和SPF鸡胚尿囊液。结果证明了此新城疫病毒试剂盒具有很好的特异性。
[0034] 新城疫病毒灵敏度检测的具体实施方案如下：将106PFU/mL新城疫病毒，用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释100倍、1000倍、10000倍。取稀释后的病毒液4μL分别滴入3小块硝酸纤维素膜(20mm×10mm)，并标记为A、B、C；室温干燥后，将硝酸纤维素膜浸泡于5％的脱脂奶粉溶液中，置于37℃摇床封闭1h；TBST溶液洗膜3次，每次5min；分别取3块硝酸纤维素膜置于拉曼探针溶液37℃摇床孵育1h；TBST洗膜3次，每次5min；待硝酸纤维素膜干燥后，利用拉曼光谱仪对3块硝酸纤维素膜进行拉曼检测；拉曼光谱仪测定功率为100mW，波长为785nm，积分时间为3s；拉曼光谱仪检测首先分别以3块硝酸纤维素膜空白处作为暗电流扣除，然后分别检测A、B、C 3块硝酸纤维素膜经本发明所述的检测方法处理后的阳性样品位置，得到光谱图，结果如图2所示。
[0035] 由图2可知，图中A、B、C分别表示新城疫病毒100倍、1000倍、10000倍稀释后的拉曼光谱图，其中A、B图中有3,3'-二硫双(6-硝基苯甲酸)双琥珀酸亚胺酯(DSNB)特征波峰即1340cm-1处波峰，而C图没有，说明该试剂盒及方法检测新城疫病毒的灵敏度达103PFU/mL。
[0036] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
