一种用于诊断肝癌的联合型代谢标志物及其检测试剂盒

摘要

本发明涉及血清样品中小分子代谢物色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸作为联合标志物在制备用于诊断受试者中的肝癌患者的试剂盒中的新应用。本发明还涉及检测受试者中的肝癌患者的试剂盒，通过检测来自受试者的血清样品中上述联合标志物各自的相对浓度，基于二元逻辑回归方程计算所述联合标志物变量P，再基于确定的截点值，判断所述受试者是否患有肝癌。所述试剂盒可实现高灵敏、高效检测本发明涉及的几种小分子代谢物，且具有检测成本低，重复性好的特点。本发明可应用于辅助肝细胞癌的临床诊断，具有诊断灵敏度高，可早期判别肝癌以及与传统的临床诊断标志物甲胎蛋白相互补充的特点，具有较好的应用前景。

权利要求

1.联合型的代谢标志物在制备用于血清诊断受试者中的肝细胞癌患者的试剂盒的用途，所述联合型的代谢标志物由色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸共同构成。

2、一种非诊断目的的计算受试者的血清样本中的联合型标志物变量的方法，其中所述受试者包括肝细胞癌患者，及对照的肝硬化患者和/或正常人，所述联合型标志物由色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸共同构成，所述方法包括以下步骤：

1）以含有内标物的提取液处理来自受试者的血清样本，沉淀血清蛋白后，进一步提取极性代谢物，随后进行超滤、冻干，以纯水复溶后进行毛细管电泳-质谱分析；

2）在毛细管电泳-质谱分析获得的总离子流图上，提取色氨酸、谷氨酰胺及2-羟基丁酸的电泳峰强度，色氨酸的提取参数为:正离子模式，质荷比为205.0972±0.005的离子，谷氨酰胺的提取参数为: 正离子模式，质荷比为147.0764±0.005的离子, 2-羟基丁酸提取参数为: 负离子模式，质荷比为103.0401±0.005的离子；

3）以试剂盒中三种物质色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸的标准品对检测到的离子进行定性；将浓度为50µM的三种物质标准品水溶液进行毛细管电泳-质谱分析，确定三种标准品的毛细管电泳迁移时间以及三种离子的实测质荷比，与在受试者样本中实测的三种物质相比较；

4）对每一受试者样本中经定性后的三种物质的电泳峰强度分别与提取液中的内标物比较，获得色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸的相对浓度；

5）以上述三种代谢物的相对浓度值，基于二元逻辑回归方程计算联合型标志物变量P。

说明书

一种用于诊断肝癌的联合型代谢标志物及其检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及分析化学，生物化学以及临床医学领域。

背景技术

[0002] 肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，致死率高。中国是世界上肝癌发病率最高的地区之一，大部分肝癌病人主要由肝硬化发展形成。肝癌早期症状不明显，具有进展迅速、易早期转移的特点，在临床上早诊困难、预后效果差。
当前，B型超声显像、肿瘤标志物甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)的血清含量检查是肝癌筛查的主要方法。然而，B超在小肝癌和肝硬化结节的鉴别上常有困难。甲胎蛋白(AFP)血清水平在诊断肝癌时存在敏感性和特异性较低的缺点，单独用于确诊时的检出率一般只有
50％—75％左右。以上方法的局限性极大地限制了肝细胞癌的早期有效诊断，预警作用有限。对于肝细胞癌的早期有效诊断有助于显著提高患者的生存率，因此，开发具有临床早诊潜力的新方法对于降低肝细胞癌的发病率和死亡率具有非常重要的现实意义。

[0003] 近年来，代谢组学技术作为一个新的有力工具，被广泛运用于疾病研究中。色谱质谱联用技术是代谢组学的主要研究手段，其检测小分子代谢物在疾病诊断中的应用已有成功的案例，包括基于检测多种氨基酸的新生儿疾病筛查、检测肌氨酸的前列腺癌判别等。由于单一代谢物所受影响因素较多，因此从血清代谢谱中优选出由少数代谢物构成的“联合型的代谢标志物”，并以判别公式计算“判别可能性”P值(Probability)，能够显著改善代谢物对疾病诊断的灵敏度以及特异性。考虑到体内极性代谢物在肿瘤生成及抑制方面的关键调控作用，本发明采用基于毛细管电泳-质谱联用的代谢组学技术和研究方法，检测血清中的极性代谢物，经过生物信息学分析，筛选目标代谢物，旨在肝细胞癌的诊断中进行应用。

[0004] 本发明从利用毛细管电泳-飞行时间质谱联用获取的肝癌患者，肝硬化患者以及正常人的血清代谢谱中，经多次优选，确定了基于色氨酸、谷氨酰胺及2-羟基丁酸的联合使用，以作为一种联合型的代谢标志物在判断肝癌中的新用途。该组代谢物分别是体内参与生理过程的重要代谢物。色氨酸参与调控肿瘤的免疫抑制，谷氨酰胺参与肿瘤能量代谢及合成过程，而2-羟基丁酸与氧化应激密切相关，目前尚无将该三种代谢物联合用于肝癌诊断的报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对肝细胞癌早期诊断困难尤其是与肝硬化患者难以区分的临床实际问题，提供了一种基于新的小分子极性代谢物的组合对肝癌患者有效判断的新用途，并提供用于上述小分子代谢物的检测方法。

[0006] 该代谢物联合标志物包括下列三种代谢物：色氨酸、谷氨酰胺以及2-羟基丁酸。其中，色氨酸在质谱正离子模式下检测到的质核比为205.0972，谷氨酰胺正离子模式下的质核比147.0764；2-羟基丁酸在质谱负离子模式下检测到的质核比为103.0401。

[0007] 上述三种物质的检测试剂盒如下：

[0008] 标准品：包括色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸，所述标准品分别用于对应的血清代谢物色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸的定性；用于预处理来自受试者的血清样品的提取液：包含内标物5-10μM的蛋氨酸砜，5-10μM的D-樟脑-10-磺酸钠盐或稳定同位素标记的色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸，及其它稳定同位素标记的内源性小分子代谢物的甲醇溶液；用于毛细管电泳-质谱分离的缓冲液，包括1M甲酸(正离子模式下采用)，50mM的乙酸铵(PH值以氨水调节至8.5，负离子模式下采用)。

[0009] 计算受试者血清样品中的联合标志物变量P的方法如下：

[0010] 1)受试者样本处理：以血清样品的提取液处理来自受试者的血清样本，然后进一步提取极性代谢物。

[0011] 2)以毛细管电泳-质谱对经步骤1)处理的血清样本进行分离，并由质谱检测。

[0012] 3)经毛细管电泳-质谱分析后，所得电泳峰强度与分别与内标物比较，正离子与蛋氨酸砜(或同位素内标)，负离子与D-樟脑-10-磺酸钠盐(或同位素内标)相比较，获得上述三种物质的相对浓度。

[0013] 4)进一步将色氨酸、谷氨酰胺及2-羟基丁酸回归为联合标志物变量P，二元逻辑回归方程如下：

[0014] P＝1/(1+e-(14.315+0.776a-13.437b-0.829c))

[0015] 其中，a为血清中2-羟基丁酸的相对含量，b为血清中色氨酸的相对含量，c为血清中谷氨酰胺的相对含量。所得变量P在肝细胞癌患者中增高，该变量值可用于辅助判断肝细胞癌。本发明确定的该联合标志物的对肝癌判断的最佳截点值(cut-off值)设为0.424，高于该截点值的则可能为肝细胞癌。也可以根据实验者的实际结果通过二元逻辑回归得到新的方程，并定义该实验室的最佳截点值。截点值的确定依据为根据联合标志物变量P值作受试者工作特征曲线(ROC曲线)，取灵敏度与特异性之和最大的P值作为最佳截点值。

[0016] 该联合型代谢标志物用途：将肝细胞癌与肝硬化患者及正常人进行有效区分，适用于肿瘤直径小于3cm的小肝癌患者与肝硬化患者的区分，以及AFP阴性(<20ng/mL)肝癌患者与肝硬化患者的区分。

[0017] 本发明原理如下：

[0018] (1)利用毛细管电泳-飞行时间质谱联用的代谢组学分析技术，对正常人、肝硬化患者、肝细胞癌患者的血清样本进行代谢轮廓分析，获得代谢物定性定量分析结果。

[0019] (2)基于多种生物信息学数据处理方式结合的策略，进行标志物的发现。具体实施方式为：

[0020] a)多变量分析：建立三组样本的偏最小二乘判别分析模型，代谢物挑选条件：在第一、二主成分上的重要性因子(VIP)值同时大于1；重要性因子的置信区间为正；在第一或第二主成分上的协方差(p(corr))绝对值大于0.3。

[0021] b)单变量分析：采用非参数检验法，挑选满足肝癌组与正常对照组、肝癌组与硬化组同时具有显著性差异(p<0.05)的代谢物。

[0022] c)以上两种分析方法获得交集代谢物，在z值图中观察他们在三组样本中含量分布，并验证含量的置信区间。排除z值分布过大，含量置信区间为负的代谢物。

[0023] d)假阳性率(FDR)评价，只保留FDR值小于1.5％的代谢物。

[0024] e)相关性分析，筛选与临床肿瘤标志物甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)的血清含量相关性小的代谢物，作为获选标志物。

[0025] (3)应用另一批正常人、肝硬化和肝癌患者(含小肝癌)血清样本对以上筛选出的候选物进行验证。同时结合Forward Stepwise(Wald)方法，优选出色氨酸、谷氨酰胺和2-羟基丁酸这一联合标志物组合。

[0026] 本发明具有如下效果：

[0027] 血清中的色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸构成的联合标志物其衍生的联合标志物变量P，能够对肝细胞癌诊断很好的识别，并与AFP具有较好的互补性。本发明涉及的检测试剂盒，对上述代谢物组合的检测，具有简便，快速重复性好的优点，适于肝癌的早期筛查和以及对传统标志物及临床诊断方法的辅助应用。

附图说明

[0028] 图1.色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸在发现集与验证集各组样本中的含量变化(均值±标准偏差表示)。*表示与正常对照组具有显著性差异，#表示与肝硬化组具有显著性差异，&表示小肝癌与一般肝癌组具有显著性差异。*(或#，&):0.01

[0029] 图2.(A)实例1(发现集)中联合标志物用于诊断肝细胞癌与非癌(正常人与肝硬化)的ROC曲线图。(B)实例2(验证集)中联合标志物用于诊断所有肝细胞癌与非癌(正常人与肝硬化)的ROC曲线图。(C)实例2(验证集)中联合标志物和AFP用于诊断所有肝细胞癌与肝硬化的ROC曲线图。(D)实例2(验证集)中联合标志物和AFP用于诊断小肝癌与肝硬化的ROC曲线图。

[0030] 图3.联合标志物用于肝细胞癌的判别。截点值为0.424。

[0031] 图4.联合标志物与AFP用于判别假阳性与假阴性患者的比较。

具体实施方式

[0032] 实施例1

[0033] 1.血清样品收集

[0034] 所有纳入研究的志愿者在血清样品采集前均签署了知情同意书。

[0035] 在相同条件下收集30例正常人、确诊的25例肝硬化和22例肝细胞癌患者的血样，采集后静置60分钟后直接取血清，储存于-80℃的冰箱中保存备用。

[0036] 2.分析方法

[0037] 2.1血清样本预处理

[0038] 样品在4℃条件下解冻，取50μL血清，加入450μL包含定量内标的甲醇提取液(包含10μM的蛋氨酸砜和10μM的D-樟脑-10-磺酸钠盐)，涡旋振荡30秒。继续加入500μL氯仿及200μL水，涡旋振荡1分钟。静置5分钟后，4℃5000g条件下离心10分钟，取450μL上层溶液放置于
5kDa的超滤管中进行超滤离心，条件为14000g，4℃，3小时。最终将滤液冻干，采用纯水复溶后上样分析。

[0039] 2.2毛细管电泳质谱分析

[0040] (1)电泳条件：采用毛细管电泳系统(G7100A,Agilent,USA)，同时装备有1260ISO泵(G1310B,Agilent,USA)及minichiller(Huber,Germany)。通过ChemStation软件(B.04.03,Agilent)实现对电泳系统的控制。毛细管柱为熔融石英毛细管柱(50μm i.d.×80cm)，分离过程中柱温控制在20℃。进样室温度控制在4℃。分别使用正负两种模式进行定量检测。

[0041] 正离子模式下采用1M甲酸作为缓冲液(每10针进样更换一次)，在正向电压27kV条件下进行分离。样品在50mbar下进样3nL。

[0042] 负离子模式下50mM的乙酸铵(利用氨水调节PH至8.5使用)作为缓冲溶液。每针进样前，采用含磷酸盐的平衡溶液(H3302-1022，HMT，Japan)预平衡毛细管柱，以掩蔽毛细管壁上未完全解离的硅羟基，从而防止其与样品中的含磷酸基团的物质通过氢键相互作用。随后采用缓冲液平衡毛细管柱(通过自动更新系统每针更换一次)。在正向电压30kV、正向内压15mbar的条件下进行分离。样品在50mbar下进样25nL。

[0043] (2)质谱条件：采用飞行时间质谱系统(G6224A，Agilent)，配备了电泳-电喷雾离子化-质谱喷雾套件(G1607A,Agilent,USA)。通过Agilent的同轴鞘液接口，实现毛细管电泳与质谱的连接。鞘液组成为1:1的甲醇/水(V/V)溶液，同时含有0.1μM的六(2，2-二氟代乙氧基)磷腈，流速10μL/min。通过Mass Hunter Workstation软件(B.04.00,Agilent)实现对质谱系统的控制。分别使用正负两种模式进行定量检测。

[0044] 正离子模式下，采用电喷雾正离子模式检测。质谱参数设置为：雾化器压力，5psig；干燥气温度，300℃；干燥气流速，7L/min；毛细管电压，4kV；毛细管出口电压(fragmentor)，105V；锥孔电压(skimmer)，50V；八级杆电压(Oct RFV)，650V；采集速率，
1.5spectra/s；采集范围，60-1,000m/z；质量校准参比离子，m/z66.0631([2MeOH+H]+)，m/z622.0289([hexakis(2,2-difluoroethoxy)phosphazene+H]+。

[0045] 负离子模式下，采用电喷雾负离子模式检测。质谱参数设置与正离子基本一致，区别在于：毛细管电压、毛细管出口电压(fragmentor)分别设置为3.5kV与125V；采集范围，50-1,000m/z；质量校准参比离子，m/z119.0350([2CH3COOH-H]-，m/z680.03554([hexakis(2,2-difluoroethoxy)phosphazene+CH3COOH–H]-。

[0046] 3.血清测试结果及辅助诊断分析

[0047] 定量分析色氨酸、谷氨酰胺及2-羟基丁酸在正常对照组、肝硬化组及肝细胞癌组中的血清含量，结果如图1所示。与正常人及肝硬化患者相比，在肝细胞癌患者中色氨酸、谷氨酰胺的血清含量显著下降，而2-羟基丁酸的含量显著上升。

[0048] 使用数据统计软件SPSS，进一步将色氨酸、谷氨酰胺及2-羟基丁酸回归为联合标志物变量P。回归方程如下：

[0049] P＝1/(1+e-(14.315+0.776a-13.437b-0.829c))

[0050] 其中，a为血清中2-羟基丁酸的相对含量，b为血清中色氨酸的相对含量，c为血清中谷氨酰胺的相对含量。所得变量P在肝细胞癌患者中增高，该变量值可用于辅助判断肝细胞癌。

[0051] 图2A中，该联合标志物通过判断变量P用于诊断肝细胞癌与非癌(正常人与肝硬化)时，得到ROC曲线的曲线下面积AUC值为0.969，具有较高的灵敏度与特异性。当灵敏度与特异性之和最大时，可获得当前最佳截点值，即0.424。图3A中，当使用该截点值时，联合标志物可有效用于各实验样本组的判别。图4表明，该联合标志物在该最佳截点值条件下，对于肝癌诊断中的AFP假阴性患者(AFP<20μg/L)诊出率可达91.7％。表1中具体列出各组比较中的AUC值、置信区间及灵敏度、特异性。以上结果表明该联合标志物具有较好的肝细胞癌诊断潜力，同时与临床使用的AFP具有较好的互补性。

[0052] 实施例2

[0053] 1.血清样品收集

[0054] 样品收集方法同实施例1。实施例2包括了31例正常人、确诊的25例肝硬化及50例肝细胞癌。所有肝细胞癌患者分为2部分，即20例小肝癌(单个癌结节最大直径不超过3厘米或两个癌结节直径之和不超过3厘米的肝癌)与30例一般肝癌。

[0055] 2.分析方法

[0056] 同实施例1。

[0057] 3.血清验证结果及诊断潜力分析

[0058] 实施例2验证结果与实施例1基本吻合。具体结果如图1所示。使用相同的二元逻辑回归方程，将色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸组合使用，结果分别如表1、图2B,C,D、图3B、图4所示，其AUC值、灵敏度及特异性均较高，各组判别效果较好。该代谢物联合标志物与临床使用的AFP具有较好的互补性，其与AFP进行联合诊断更有助于提高检测肝癌的能力，具有较好的应用前景。

[0059] 表1

[0060]

[0061] 本发明还涉及检测受试者中的肝癌患者的试剂盒，通过检测来自受试者的血清样品中上述联合标志物各自的相对浓度，基于二元逻辑回归方程计算所述联合标志物变量P，再基于确定的截点值，判断所述受试者是否患有肝癌。所述试剂盒可实现高灵敏、高效检测本发明涉及的几种小分子代谢物，且具有检测成本低，重复性好的特点。本发明可应用于辅助肝细胞癌的临床诊断，具有诊断灵敏度高，可早期判别肝癌以及与传统的临床诊断标志物甲胎蛋白相互补充的特点，具有较好的应用前景。