一种用于肝纤维化和肝硬化检测的试剂盒

摘要

本发明公开了一种用于检测由乙肝病毒感染引起的肝纤维化或肝硬化的试剂盒，其通过检测个体样本中CHI3L1的水平来确定个体是否有肝纤维化或肝硬化状况，该试剂盒包含：(1)能够结合CHI3L1的抗体；(2)当CHI3L1结合于(1)中限定的抗体时，能够结合于CHI3L1的标记抗体；以及(3)由含有已知量CHI3L1的溶液组成的标准样，其中CHI3L1来源于由乙肝病毒感染引起的肝纤维化或肝硬化患者的血清。

权利要求

1.一种用于检测由乙肝病毒感染引起的肝硬化的试剂盒，其通过检测个体样本中CHI3L1的水平来确定个体是否有肝硬化状况，该试剂盒包含：(1)能够结合CHI3L1的抗体；

(2)当CHI3L1结合于(1)中限定的抗体时，能够结合于CHI3L1的标记抗体；以及(3)由含有已知量CHI3L1的溶液组成的标准样，其中CHI3L1来源于由乙肝病毒感染引起的肝硬化患者的血清。

2.一种用于检测由乙肝病毒感染引起的肝硬化的试剂盒，其通过检测个体样本中CHI3L1和HBV蛋白的水平来确定个体是否有肝硬化状况，其包含：(1’)能够结合CHI3L1的抗体；

(2’)当CHI3L1结合于(1’)中限定的抗体时，能够结合于CHI3L1的标记抗体；

(3’)能够结合HBV蛋白的抗体；

(4’)当HBV蛋白结合于(3’)中限定的抗体时，能够结合于HBV蛋白的标记抗体；以及(5’)由含有已知量CHI3L1的溶液组成的标准样，其中CHI3L1来源于由乙肝病毒感染引起的肝硬化患者的血清；以及由含有已知量HBV蛋白的溶液组成的标准样，其中HBV蛋白来源于由乙肝病毒感染引起的肝硬化患者的血清。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述样本是全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、精液或眼泪。

4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，还包含引发剂溶液，如果将权利要求1的(1)中限定的抗体称作CHI3L1第一抗体，将权利要求1的(2)中限定的标记抗体称作CHI3L1第二抗体，将权利要求2的(3’)中限定的抗体称作HBV第一抗体，将权利要求2的(4’)中限定的标记抗体称作HBV第二抗体，所述引发剂溶液用于引发CHI3L1第二抗体和HBV蛋白第二抗体上的标记物与分别作为标记物反应对象的化学发光化合物或显色底物或者荧光染料之间的化学反应。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述CHI3L1第二抗体和HBV蛋白第二抗体上的标记物是过氧化物酶、磷酸酯酶或荧光素酶。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述过氧化物酶是辣根过氧化物酶。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，CHI3L1第一抗体和HBV第一抗体分别被固定在不同的固相载体上，所述固相载体是选自下组的固体支持物：微孔板，试管，样品杯，塑料微球，纤维素，纸质或塑料试验条，胶乳粒子，二氧化硅粒子，磁性粒子。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，CHI3L1第一抗体和HBV第一抗体，或者分别用于固定CHI3L1第一抗体和HBV第一抗体的固相载体上分别连接有作为标记物反应对象的化学发光化合物或显色底物或者荧光染料。

9.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。

10.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，个体样本中CHI3L1的水平检测通过ELISA实施。

说明书

一种用于肝纤维化和肝硬化检测的试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于生物医学技术领域。具体地说，本发明涉及一种用于肝纤维化和/或肝硬化检测的试剂盒，尤其涉及一种用于检测样本中CHI3L1水平的试剂盒。

背景技术

[0002] 肝硬化(Cirrhosis)是指肝纤维化中晚期。它的形态学定义为弥漫性肝脏纤维化伴有异常结节形成。仅有弥漫性肝纤维化而无结节形成(如先天性肝纤维化)，或仅有结节形成而无纤维化(如结节性再生性增生)均不能称为肝硬化。从临床的角度来看，肝硬化是指上述肝脏组织病理学改变所导致的肝功能衰竭(血清白蛋白降低、胆硷酯酶活力降低、胆红素升高、凝血酶原时间延长等)和门脉高压症(食管胃底静脉曲张及其破裂出血、腹水、自发性细菌性腹膜炎及肝肾综合征、肝性脑病等)等表现。从病理学上来看，慢性炎症坏死首先导致肝脏纤维结缔组织增生和沉积(纤维化)，继而导致肝小叶结构的破环和假小叶形成，最终发展为肝硬化。

[0003] 肝硬化的临床诊断方法包括相关的影像学诊断、病理学诊断或/和治疗和随访等。选择的血清样本来源于临床确诊的肝硬化病人等。肝硬化的诊断方法主要有以下3类：

[0004] 1)组织病理学检查：肝活检组织病理学检查至今仍被认为是诊断肝纤维化和肝硬化的“金标准(Gold standard)”。1994年国际慢性肝炎新的分级、分期标准建议将肝脏纤维化作为病情分期的依据，与分级(主要是炎症、坏死的程度)分别评分。目前国际上常用的肝组织评分方法包括Knodell、Scheuer、Ishak、Metavir、Chevallier等系统。我国1995和2000年病毒性肝炎防治方案也采用了相应的分级、分期标准，王泰龄教授也发表了改进的肝纤维化的半定量积分系统。利用常规HE染色和各种细胞外基质的组织化学、免疫组织化学甚至分子原位杂交技术可从肝组织标本获得许多有关纤维化方面的信息；计算机图像分析等各种技术更能提供定量的资料以便于观察抗纤维化治疗的效果。目前在B超引导下采用自动肝穿枪进行肝活检的可靠性及安全性很高，病人的痛苦也很小。但肝活检也有局限性，例如：病变不均一有可能造成取样误差，难以在同一病人反复多次进行，因而不便于观察肝纤维化的动态变化或治疗效果，因此一般很少在临床诊断实际采用。

[0005] 2)肝纤维化的血清学诊断：鉴于肝脏穿刺组织病理检查的局限性，人们经过动物实验和临床－病理对照研究发现了不少对判断肝纤维增生有一定价值的血清指标。国内应用较多的有血清III型前胶原氨基端肽(PIIINP)、IV胶原(CIV)、层连蛋白P1(Lam)、透明质酸(HA)。总的来说，在动物实验中，这些指标和肝脏中相应的细胞外基质成分有良好的相关性；在临床研究中，这些指标和肝组织病理学纤维化程度也有较好的相关性，由慢性肝炎、肝纤维化到肝硬化逐步升高，并能除外肝外疾病及肝脏炎症活动的影响，对诊断肝纤维化有一定帮助。但是各组之间有较多的重叠，仅凭一次结果难以做出肯定的诊断，而且目前国内此类试剂盒急需标准化并提高其稳定性。联合应用多项指标综合判断，并进行动态测定可能更有助于判断肝脏纤维增生变化趋势和治疗效果。

[0006] 3)影像学诊断：各种常用的影像学手段如B型超声、CT、磁共振成像(MRI)等可以发现肝包膜增厚，肝表面轮廓不规则，肝实质的回声不均匀增强或CT值增高或呈结节状，各叶比例改变，脾脏厚度增加及门静脉和脾静脉直径增宽等肝硬化和门脉高压的征象。彩色多普勒超声检查或放射性核素扫描可以测定肝脏动脉和门脉的血流量及功能性门体分流情况。

[0007] 但是以上这些检测都有低灵敏度和特异性的缺陷，造成诊断中出现很高的假阳性和假阴性。因此，人们迫切需要科技工作者开发出检测更方便、灵敏度和特异性更高、而且准确率高的肝硬化诊断手段。

[0008] 导致肝硬化最常见的病因是乙肝(HBV)或丙肝病毒(HCV)感染，世界人口总数的约1/3(20亿)曾感染过或者正在感染乙肝病毒(参见http://www.hepb.org/hepb/statistics.htm)，其中有4亿人为终身慢性感染者。而我国的HBV感染率已经高达10％。因此，由HBV和HCV感染导致的肝硬化在我国的发病逐年增加。据不完全统计，我国慢性乙型肝炎病人约为2000万人，其中近25～30万慢性乙肝病人可发展为肝硬化，其中5～20万可能发展为肝癌。而我国每年死于肝硬化的人数高达20万。因此，如果能够发现易感人群并进行早期诊断和干预，则会大大降低肝硬化乃至肝癌的发病率，降低患者死亡率，减少医疗费用并提高患者的生活质量；同时，肝硬化易感人群的发现对于了解其发病机理并寻找干预手段也有重要的科学意义和临床应用价值，这将对人类最终攻克这一顽疾有重要意义。众所周知，乙肝病毒感染后有着“肝炎-肝硬化-肝癌”三部曲表现，其中肝硬化是基于病毒侵犯肝脏后导致肝细胞长期慢性炎症、肝细胞死亡，并由肝脏纤维组织增生发展而来。

[0009] 发明人在肝硬化基因差异表达以及相关的生物标志物研究中，意外地发现在中国人群中由乙肝引起的肝纤维化和肝硬化会发生CHI3L1蛋白的高表达，这提示CHI3L1具有用作肝纤维化和肝硬化的生物标志物的可能性。

[0010] CHI3L1是人类软骨糖蛋白39(HcGP-39)(或称为类几丁质酶蛋白，chitinase 3-like 1)的简写，又简写为YKL-40。人们经研究发现，血清中CHI3L1的水平与许多疾病状况比如在骨关节炎、原发性大肠癌、乳腺癌、复发的卵巢癌有关，因而可用于一些疾病的诊断、预后评估、治疗效果监测及病情发展监测。例如，可用于卵巢癌的诊断和预后(参见：程明刚，等。血清CHI3L1在卵巢癌患者诊断和预后中的应用。《广东医学》2008年29卷2期第255-256页)。耶鲁大学医学院研究人员在2007年11月15日出版的《新英格兰医学期刊》(The New England Journal of Medicine)上发表文章称，临床试验结果表明该分子可能在决定严重哮喘病生理反应时发挥重要作用，与常人相比，哮喘病患者的CHI3L1循环血清会更多，同时也与哮喘的严重程度有关。(参见生物通网址：http://www.ebiotrade.com/newsf/2007-
11/20071116165039.htm)。美国圣迭戈加州大学Johansen等称，CHI3L1是独立于癌胚抗原(CEA)和乳酸脱氢酶的生物标志物，普通人群血清CHI3L1水平高者，其胃肠道肿瘤患病风险增加2.7倍，且诊断为胃肠道肿瘤后预后欠佳(参见中国医学论坛报网络版。网址：http://www.cmt.com.cn/article/080221/a080221b0301.htm)。血清CHI3L1水平在酒精性肝硬化病人中升高(参见Johansen,J.S.,Christoffersen,P.,Moller,S.,Price,P.A.,Henriksen,J.H.,Garbarsch,C.,and Bendtsen,F.(2000)Serum CHI3L1is increased in patients with hepaticfibrosis.Journal of hepatology，32：911-920.)。Kamal等的研究表明血液中的CHI3L1蛋白水平已丙肝病毒慢性感染和肝纤维化有关(Kamal,et al.HEPATOLOGY，2006；43:771-779.)。

[0011] 但是，对于中国人群常见的乙肝病毒感染后生物样本比如血液中CHI3L1水平与肝纤维化和肝硬化的关系，目前还没有报道。

[0012] 因此，基于CHI3L1蛋白与中国人群中乙肝引起的肝纤维化和肝硬化的相关性，本发明提出了通过检测CHI3L1蛋白来判断肝硬化发病、诊断和干预的新的应用方法。

发明内容

[0013] 基于上述发现，本发明的首要目的在于提供一种用于检测肝纤维化和/或肝硬化、尤其是乙肝病毒感染引起的肝纤维化和/或肝硬化的试剂盒，其通过检测个体样本中CHI3L1的水平来确定个体是否有肝纤维化和/或肝硬化状况，该试剂盒包含：

[0014] (1)能够结合CHI3L1的抗体；

[0015] (2)当CHI3L1结合于(1)中限定的抗体时，能够结合于CHI3L1的标记抗体；和[0016] (3)由含有已知量CHI3L1的溶液组成的标准样，其中CHI3L1来源于由乙肝病毒感染引起的肝纤维化和/或肝硬化患者的体液比如血清。

[0017] 为方便起见，将上述(1)中限定的抗体称作CHI3L1初级抗体或者CHI3L1第一抗体；将上述(2)中限定的标记抗体称作CHI3L1第二抗体。

[0018] 优选CHI3L1第一抗体可以被固定在固相载体上，形成用于“捕获”CHI3L1的捕获抗体。

[0019] 优选CHI3L1第二抗体上的标记物能够催化或者激活化学发光化合物或者荧光染料，从而快速地将无色的底物转变成有色的产物、或者引起光变化，或者将非荧光的荧光染料转变成强烈的荧光产物。

[0020] 优选上述试剂盒进一步包含：

[0021] (4)引发剂溶液，用于引发CHI3L1第二抗体上的标记物与作为标记物反应对象的化学发光化合物或显色底物或者荧光染料之间的化学反应。

[0022] 优选CHI3L1第一抗体、或者用于固定CHI3L1第一抗体的固相载体上连接有化学发光化合物或荧光染料。借此，使得免疫测定方法更简单化，定量更准确。

[0023] 本发明的另一目的在于提供另一种用于检测由乙肝病毒感染引起的肝纤维化和/或肝硬化的试剂盒，其通过检测个体样本中CHI3L1和HBV蛋白的水平来确定个体是否有肝纤维化和/或肝硬化状况，其包含：

[0024] (1’)能够结合CHI3L1的抗体；

[0025] (2’)当CHI3L1结合于(1’)中限定的抗体时，能够结合于CHI3L1的标记抗体；

[0026] (3’)能够结合HBV蛋白的抗体；

[0027] (4’)当HBV蛋白结合于(3’)中限定的抗体时，能够结合于HBV蛋白的标记抗体；

[0028] (5’)由含有已知量CHI3L1的溶液组成的标准样，其中CHI3L1来源于由乙肝病毒感染引起的肝纤维化和/或肝硬化患者的体液比如血清；以及由含有已知量HBV蛋白的溶液组成的标准样，其中HBV蛋白来源于由乙肝病毒感染引起的肝纤维化和/或肝硬化患者的体液比如血清。

[0029] 为方便起见，将上述(1’)中限定的抗体称作CHI3L1初级抗体或者CHI3L1第一抗体；将上述(2’)中限定的标记抗体称作CHI3L1第二抗体；将上述(3’)中限定的抗体称作HBV初级抗体或者HBV第一抗体；将上述(4’)中限定的标记抗体称作HBV第二抗体；

[0030] 优选CHI3L1第一抗体和HBV第一抗体可以分别被固定在不同的固相载体上，分别形成用于“捕获”CHI3L1和HBV蛋白的捕获抗体。

[0031] 优选CHI3L1第二抗体和HBV蛋白第二抗体上的标记物能够催化或者激活化学发光化合物或者荧光染料，从而快速地将无色的底物转变成有色的产物、或者引起光变化、或者将非荧光的荧光染料转变成强烈的荧光产物。

[0032] 优选上述试剂盒还包含：

[0033] (6’)引发剂溶液，分别用于引发CHI3L1第二抗体和HBV蛋白第二抗体上的标记物与分别作为标记物反应对象的化学发光化合物或显色底物或者荧光染料之间的化学反应。

[0034] 优选CHI3L1第一抗体和HBV第一抗体、或者分别用于固定CHI3L1第一抗体和HBV第一抗体的固相载体上分别连接有化学发光化合物或荧光染料。

[0035] 上述两种试剂盒还可分别包括下述物品中的至少之一：(5)携带工具，其空间划分为可以收容一种或多种容器、96孔板或板条的限定空间，该容器例如是药瓶、试管和类似物，每样容器都含有一个单独的用于本发明方法的组分；(6)辅助试剂，比如，显色剂、酶抑制剂、缓冲液、稳定剂、稀释剂、洗涤试剂以及类似物；(7)说明书，其可以写在瓶子、试管和类似物上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部，也可以是多媒体的形式，比如CD、电脑光盘、录像等等。

[0036] 借助于本发明的试剂盒，可以测定个体样本中CHI3L1的水平，进而确定个体是否有肝纤维化和/或肝硬化状况。例如，当以血清为样本时，如果将CHI3L1含量79ng/ml设定为诊断界点值，基本上就可以确定血清CHI3L1水平超过该诊断界点值的个体患有肝纤维化和/或肝硬化。而且，针对不同的样本类型，本发明的试剂盒可以设置相应的CHI3L1水平作为诊断界点值，该界点值可通过简单的测试实验和常规的统计手段进行确定。因此，本发明的试剂盒可以作为诊断乙肝病毒感染引起的肝纤维化和/或肝硬化的辅助手段。

附图说明

[0037] 图1是对1151例血清样本(含314例乙肝病毒感染引起的肝硬化患者血清样本、112例乙肝患者血清样本、725例健康对照血清样本)进行CHI3L1检测的ROC曲线界面。

[0038] 图2是对浙江大学医学院附属第一医院581例血清样本(含162例乙肝病毒感染引起的肝硬化患者血清样本、62例乙肝患者血清样本、357例健康对照血清样本)进行CHI3L1检测的ROC曲线界面。

[0039] 图3是对浙江大学医学院附属第二医院297例血清样本(含67例乙肝病毒感染引起的肝硬化患者血清样本、30例乙肝患者血清样本、200例健康对照血清样本)进行CHI3L1检测的ROC曲线界面。

[0040] 图4是对浙江大学医学院附属邵逸夫医院273例血清样本(含85例乙肝病毒感染引起的肝硬化患者血清样本、20例乙肝患者血清样本、168例健康对照血清样本)进行CHI3L1检测的ROC曲线界面。

具体实施方式

[0041] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。

[0042] 本发明提供一种用于检测肝纤维化和/或肝硬化、尤其是乙肝病毒感染引起的肝纤维化和/或肝硬化的方法。该方法包括使用试剂盒来检测个体样本中CHI3L1的水平，借此确定个体是否有肝纤维化和/或肝硬化状况。

[0043] 样本

[0044] 本发明所用样本可以包含多种形式，比如全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、精液、或眼泪。其中优选血清。

[0045] 血清样本制备可根据普通方法比如离心等进行，例如，参见如下文献：Young,D.S.&Bermes,E.W."Specimen collection and processing"in Tietz Textbook of Clinical Chemistry2nd Edition"Eds.Burtis,C.A.&Ashwood,E.R.,Saunders(1994)；Methods in Enzymology,H.Van Vunakis and J.J.Langone(Eds),1981,72(B)；Practice and Theory of Enzyme Immunoassays,P Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,R.J.Burden and P.H.Van Knippenberg(Eds),Elsevier,1985；Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques,T.Chard,ibid,3rd Edition,1987；Methods in Enzymology,H.Van Vunakis and J.J.Langone(Eds)1981,74(C)。

[0046] 试剂盒

[0047] 本发明的第一种试剂盒包含：

[0048] (1)能够结合CHI3L1的抗体；

[0049] (2)当CHI3L1结合于(1)中限定的抗体时，能够结合于CHI3L1的标记抗体；以及[0050] (3)由含有已知量CHI3L1的溶液组成的标准样，该标准样是人工配制的CHI3L1溶液，其中CHI3L1来源于由乙肝病毒感染引起的肝纤维化和/或肝硬化患者、尤其是中国人群患者的体液比如血清。

[0051] 为方便起见，将上述(1)中限定的抗体称作CHI3L1初级抗体或者CHI3L1第一抗体；将上述(2)中限定的标记抗体称作CHI3L1第二抗体。

[0052] 其中，CHI3L1第一抗体包括任何能够结合CHI3L1的抗体或抗体片段，并且可以是重组体、嵌合抗体、人源化抗体和鼠源性抗体。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，优选单克隆抗体。优选使用商品化的市售CHI3L1抗体，其例子比如包括：艾博抗公司(Abcam)的一系列CHI3L1抗体产品，比如CHI3L1抗体[MM0628-9X24]、Anti-CHI3L1抗体(ab77528)、Anti-CHI3L1抗体(ab180569)、Anti-CHI3L1抗体[AT4A3](ab86428)、Anti-CHI3L1抗体[AT4A3](ab115328)等等；小鼠抗人CHI3L1抗体(ABIN934046)；兔抗大鼠(Rattus)CHI3L1抗体(ABIN311477)；兔抗小鼠CHI3L1抗体(ABIN737556),EMD Millipore clone mAY:MABC196,Aviva Systems Biology,CHI3L1antibody-middle region(ARP51929_P050)；LifeSpan Biosciences公司的CHI3L1/YKL-40小鼠抗人单克隆(aa22-383)(AT4A3)抗体(LS-B3057-50)、或CHI3L1/YKL-40小鼠抗人单克隆(aa22-383)抗体(LS-C125352-50)；R and D systems公司的Human Chitinase 3-like 1MAb(Clone 384327)；
Novus Biologicals公司的CHI3L1Antibody(4A3)、CHI3L1Antibody(9X24)；北京义翘神州生物技术有限公司的CHI3L1/YKL40抗体(11227-R101)、或CHI3L1/YKL40抗体(Antigen Affinity Purified)(11227-RP02)，等等。CHI3L1第一抗体也可通过标准的抗体制备技术，表达或合成CHI3L1蛋白或多肽，筛选和制备针对CHI3L1的特异的单抗或多抗。

[0053] 在本发明的一个实施方式中，CHI3L1第一抗体可以被固定在固相载体上，形成用于“捕获”CHI3L1的捕获抗体。这种固定可以通过共价连接或者通过吸附工艺进行。在本发明的实施方式中可用的固相载体可以是各种材料、各种形状、和各种尺寸的固体支持物，包括：96孔、384孔以上的多种微孔板，试管，样品杯，塑料微球，纤维素，纸质或塑料试验条，胶乳粒子，聚合物颗粒，二氧化硅粒子，磁性粒子，尤其是那些平均直径为0.1-10μm以及纳米颗粒的各种材料。

[0054] CHI3L1第二抗体包括任何能够结合CHI3L1的已标记的(带有标签的)抗体或抗体片段，并且可以是重组体、嵌合抗体、人源化抗体和鼠源性抗体。优选已标记的(带有标签的)单克隆抗体或多克隆的抗体，比如R&D Systems的生物素标记的多抗，Antibody Online公司的CHI3L1-antibody(Alexa Fluor 488)(No.ABIN890291)、CHI3L1antibody(Cy5.5)；LifeSpan Biosciences公司的CHI3L1/YKL-40兔抗人多克隆抗体(LS-B8213-50)；Biorbyt公司的兔多克隆抗CHI3L1抗体(orb170491)；GenWay Biotech公司的碱性磷酸单脂酶共轭的羊抗人CHI3L1多克隆抗体(GWB-112941)、或HRP共轭的羊抗人CHI3L1多克隆抗体(18-
783-77701)；R and D systems公司的人CHI3L1生物素化亲和纯化的PAb(BAF2599)；Novus Biologicals公司的CHI3L1抗体(H00001116-D01P)；北京义翘神州生物技术有限公司的CHI3L1/YKL40抗体(11227-RP01)；Origene Technologies公司的抗CHI3L1兔多克隆抗体(TA323195)。CHI3L1第二抗体也可通过标准的抗体制备技术，表达或合成CHI3L1蛋白或多肽，筛选和制备针对CHI3L1的特异的单抗或多抗。可以根据常规方法进行抗体标记或加标签，也可使用商品化的市售CHI3L1抗体。比如：以酶比如HRP(辣根过氧化物酶)作为标记物(标签)时，酶与抗体的结合方法有许多种，例如可以用戊二醛二步法和过碘酸钠法。

[0055] CHI3L1第二抗体上可结合有称为活化剂的标记物，活化剂能够催化或者激活化学发光化合物或者荧光染料，诱导化学反应，从而快速地将无色的底物转变成有色的产物、或者引起光变化，或者将非荧光的荧光染料转变成强烈的荧光产物。能够用作标记物的化合物包括过渡金属盐和络合物以及酶，尤其是含有过渡金属的过氧化物酶和荧光素酶，更尤其优选是过氧化物酶。在标记物化合物中有用的过渡金属包括周期表第3-12族中的那些过渡金属，尤其是铁、铜、钴、锌、锰和铬。其中过氧化物酶可以包括：乳过氧化物酶、微小过氧化物酶、髓过氧化物酶、卤素过氧化物酶例如钒溴过氧化物酶、辣根过氧化物酶、真菌的过氧化物酶比如木质素过氧化物酶和在白腐真菌中产生的依赖Mn的过氧化物酶、以及大豆过氧化物酶。其他氧化物酶的模拟化合物并不是酶，而是具有类似过氧化物酶的活性，其包括铁络合物比如亚铁原卟啉和Mn-TPPS4(Y.X.Ci等，Mikrochem.J.，52，257-62(1995))，已知该化合物可以催化底物的化学发光氧化，这种化合物也被包含在本发明所使用的过氧化物酶含义的范围内。考虑到ELISA在蛋白质检测中的普遍适用性，优选CHI3L1第二抗体上的标记物是辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，简称HRP)。当CHI3L1第二抗体上已具有标签比如生物素时，通过加入活化剂比如HRP标记的亲和素，可形成复合型的第二抗体比如生物素标记抗体-酶标亲和素复合物。

[0056] 不同的标记物具有各自的反应对象，这些反应对象是适用于化学发光检测、显色检测或者荧光检测的化合物。因此，在本发明的一个实施方式中，优选CHI3L1第二抗体上的标记物能够催化或者激活化学发光化合物或者荧光染料，从而快速地将无色的底物转变成有色的产物、或者引起光变化，或者将非荧光的荧光染料转变成强烈的荧光产物。比如，当标记物是辣根过氧化物酶时，相应的显色化合物例如是常用的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)比如3,3′,5,5′-四甲基联苯胺、或2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)；当标记物是磷酸酯酶(AP)时，相应的显色化合物例如是常用的对硝基苯磷酸酯(p-NPP)或者相应的荧光底物例如是(磷酸4-甲基伞酮)。优选的化学发光化合物是能够被氧化从而当存在标记物(即，活化剂)和引发剂溶液时产生化学发光，其示例性化合物种类包括氨基苯二酰一肼(鲁米诺)、异氨基苯二酰一肼、氨基丁基乙基异氨基苯二酰一肼(ABEI)、氨基己基乙基异氨基苯二酰一肼(AHEI)、7-二甲基氨基萘-l,2-二羧酸酰肼、环取代的氨基邻苯二甲酰肼、蒽-2,3-二羧酸酰肼、菲-1,2-二羧酸酰肼、芘二羧酸酰肼、5-羟基-邻苯二甲酰肼、6-羟基邻苯二甲酰肼、2,3-二氮杂萘二酮类似物、9,10-二氢化吖啶类化合物比如9,10-二氢化吖啶酯、9,10-二氢化吖啶酯、9,10-二氢化吖啶硫酯、9,10-二氢化吖啶磺酰胺、9,10-二氢化吖啶二硫缩烯酮化合物。一般来讲，任何已知可以在过氧化氢和过氧化物酶的作用下产生化学发光的化合物都可在本发明中被用做化学发光化合物来产生化学发光，这样的化合物包括占辛染料、芳香胺和杂环胺。可在本发明中使用的荧光染料包括可用于蛋白质的荧光免疫测定的化合物，其可共轭于蛋白质比如抗体。优选的荧光染料包括萤火虫荧光素化合物。荧光素是荧光素酶的底物，其在荧光素酶存在的条件下被氧化从而产生氧化荧光素并发光。

[0057] 这些标记物的反应对象可以单独作为试剂盒的组成部分，即，反应底物溶液。

[0058] 在本发明的另一个优选实施方式中，作为标记物反应对象的化学发光底物或显色底物或者荧光染料可以被连接在CHI3L1第一抗体上、或者连接在用于固定CHI3L1第一抗体的固相载体上。借此，当通过双抗体夹心法测试时，与传统的在检测步骤之前必须漂洗除去第二抗体的免疫测定方法相比，因为省去了分离(第二抗体)和洗涤步骤而使测定方法简单化。在传统的免疫测定方法比如ELISA中，在抗原与第一抗体结合之后，加入第二抗体；经过一段时间的温育，必须漂洗除去过量的未与抗原结合的第二抗体，然后再加入酶底物温育，形成有色产物。通过对传统免疫测定方法的优化，本发明的上述检测方法的特征在于，使用被固定在固相载体上的化学发光化合物或者荧光染料和第二抗体上的标记物，用于诱导化学发光反应或者荧光发光反应。CHI3L1介导的化学发光化合物或者荧光染料的共定位和第二抗体引起随后的化学发光或者荧光发光反应仅在CHI3L1分子的位点处发生。过量第二抗体的存在不参与或者不妨碍化学发光反应或者荧光发光反应。其结果是，发射的光强度与CHI3L1的数量成正比。因此与现有技术的免疫测定方法相比更简单化，定量更准确。在本发明的另一个优选实施方式中，可以使用在抗体上已经连接有化学发光底物或显色底物或者荧光染料的抗体作为CHI3L1第一抗体，例如可以使用其上已结合荧光素的CHI3L1抗体比如BYK-1093R-FITC、bs-10215R-FITC等。标记的(带有标签的)单克隆抗体或多克隆的抗体包括R&D Systems的生物素标记的多抗，Antibody Online公司的CHI3L1-antibody(Alexa Fluor 488)(No.ABIN890291)、CHI3L1antibody(Cy5.5)。

[0059] 在本发明的实施方式中，免疫测试使用了“CHI3L1标准样”作参考，用于建立标准对照曲线或者数学模型。CHI3L1标准样由含有已知量CHI3L1的溶液组成，该标准样是人工配制的CHI3L1溶液。理论上讲，标准样中的CHI3L1可以来源于任何包含或者产生CHI3L1的生物体，比如来源于基因工程菌表达、或动物的体液。然而，不同来源的CHI3L1作为抗原时，其表位特异性可能会有所不同，从而与同一抗体的结合也可能会有差异，进而影响到免疫检测。为使CHI3L1作为抗原具有较高的表位特异性，优选CHI3L1标准样来源于对应于动物的体液，例如来源于对应于受检测生物样本类型的动物体液比如全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、精液、或眼泪，其中更优选来源于血清。研究发现，当CHI3L1标准样取自乙肝病毒感染引起的肝纤维化和/或肝硬化患者的血清时，该标准样具有广谱适用性，检测得到的结果尤其准确，即便受检测生物样本类型不是血清、而是全血、血浆、尿液、脑脊液、唾液、精液、或眼泪。因此优选CHI3L1标准样来源于由乙肝病毒感染引起的肝纤维化和/或肝硬化患者、优选由乙肝病毒感染引起的肝硬化患者、尤其是中国人群患者的体液比如血清。当然，也可以来源于基因工程菌表达、或动物的体液，前提是其CHI3L1的表位特异性与乙肝病毒感染引起的肝纤维化和/或肝硬化患者的血清CHI3L1的表位特异性大致等同。用作标准样和对照样的材料可以采用多种形式，合适的材料可以是呈水溶液状态。典型地，一种适合于本发明的免疫测定的标准样可以包含已知CHI3L1含量的溶液，其可以进行梯度稀释。

[0060] 本发明中可以使用自制的CHI3L1标准品，例如，通过常规的蛋白质分离纯化手段比如亲和色层法，从由乙肝病毒感染引起的肝硬化患者的血清中分离出CHI3L1，溶于缓冲液(比如含有2M脲的20mM磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液、或者Tris缓冲液，pH 7.4)中，使用时可用相同的缓冲液进行稀释。本发明中也可以使用某些商品化的CHI3L1标准品，比如Abcam公司的活性人CHI3L1全长蛋白(ab182706)；Creative Biomart公司的重组人CHI3L1,His-tagged(CHI3L1-7262H)；OriGene Technologies公司的重组人CHI3L1蛋白(cartilage glycoprotein-39)(CHI3L1)(TP303769)；Abnova Corporation公司的人CHI3L1全长ORF(AAH08568.1,1a.a.-383a.a.)，在N-端具有GST-tag的重组蛋白；IBL-America(Immuno-Biological Laboratories)公司的CHI3L1,1-383aa Human,His tag,CHO(IBATGP1962)；Antibodies-online公司的(Cartilage Glycoprotein-39)(CHI3L1)蛋白(His tag)(ABIN1098537)；R&D Systems公司的重组人CHI3L1,CF(2599-CH-050)。标准品的稀释点可以分别为1200pg/ml、600pg/ml、300pg/ml、150pg/ml、75pg/ml、0pg/ml。

[0061] 在本发明的一个优选实施方式中，为了实现CHI3L1第二抗体上的标记物与化学发光化合物或显色底物或者荧光染料之间的化学反应或者酶催化反应，本发明的试剂盒中还可包含：

[0062] (4)引发剂溶液。引发剂溶液提供了为产生对于化学发光所需激发态化合物所需要的反应物。该反应物可以是一种对于通过直接与化学发光化合物反应而进行化学发光反应所必需的反应物。例如，当活化剂是过氧化物酶时，将会发生这种情况。在一种优选实施方式中，引发剂溶液包含过氧化物化合物。该过氧化物成分是任何能够与过氧化物酶反应的过氧化物或者烷基氢过氧化物。优选的过氧化物包括过氧化氢(双氧水)、过氧化脲和过硼酸盐。该过氧化物与过氧化物酶反应，估计可能是在酶的活性部位将铁的氧化态变成了不同的氧化态。所述引发剂溶液还可以包含选自下组的过氧化物酶增强子：苯酚化合物、芳香胺、芳基硼酸化合物、芳基硼酸酯化合物、芳基硼酸酸酐化合物。

[0063] 在本发明的实施方式中，上述试剂盒还包含下述物品中的至少之一：(5)携带工具，其空间划分为可以收容一种或多种容器、96孔板或板条的限定空间，该容器例如是药瓶、试管、和类似物，每样容器都含有一个单独的用于本发明方法的组分；(6)辅助试剂，比如，显色剂、酶抑制剂、缓冲液、稳定剂、稀释剂、洗涤试剂以及类似物；(7)说明书，其可以写在瓶子、试管和类似物上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部，也可以是多媒体的形式，比如CD、电脑光盘、录像等等。

[0064] 本发明人的研究发现，乙肝病毒HBV的表达也可以作为乙肝病毒感染引起的肝硬化检测的生物标志，其与CHI3L1的表达结合起来，进行联合检测可以显著提高HBV感染引起的肝纤维化和/或肝硬化诊断的成功率。因此，将样本中乙肝病毒的检测、CHI3L1的检测整合在一个试剂盒中，将会进一步提高肝纤维化和/或肝硬化检测的准确性，并且进一步提高确定肝纤维化和/或肝硬化病因的准确性。

[0065] 因此，本发明的第二种试剂盒除了上述CHI3L1第一抗体和CHI3L1第二抗体之外，还包含：

[0066] (3’)能够结合HBV蛋白的抗体；

[0067] (4’)当HBV蛋白结合于(3’)中限定的抗体时，能够结合于HBV蛋白的标记抗体；以及

[0068] (5’)由含有已知量CHI3L1的溶液组成的标准样，该标准样是人工配制的CHI3L1溶液，其中CHI3L1来源于由乙肝病毒感染引起的肝纤维化和/或肝硬化患者、尤其是中国人群患者的体液比如血清；以及由含有已知量HBV蛋白的溶液组成的标准样，其中HBV蛋白可以来源于由乙肝病毒感染引起的肝纤维化和/或肝硬化患者、尤其是中国人群患者的体液比如血清。

[0069] 为方便起见，将上述(3’)中限定的抗体称作HBV初级抗体或者HBV第一抗体；将上述(4’)中限定的标记抗体称作HBV第二抗体。

[0070] 至于HBV蛋白，其可以是HBV中包含的任何种类的蛋白质，比如是HBx、HBs、HBe、HBc等。

[0071] HBV第一抗体包括任何能够结合HBV蛋白的抗体或抗体片段，并且可以是重组体、嵌合抗体、人源化抗体和鼠源性抗体。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，优选单克隆抗体，优选使用商品化的市售HBV抗体，其例子比如包括：ABCAM公司的HBV PreS2antibody[H.11],Biorbyt公司的HBV Pres1antibody,Abbexa公司的HBV-PreS1(Capture Ab)和Abnova公司的Hepatitis B virus(core antigen)monoclonal antibody,clone LF161。

[0072] 与上述CHI3L1第一抗体和CHI3L1第二抗体的情形类似，优选CHI3L1第一抗体和HBV第一抗体可以分别被固定在不同的固相载体上，分别形成用于“捕获”CHI3L1和HBV蛋白的捕获抗体。

[0073] HBV第二抗体包括任何能够结合HBV蛋白的已标记的(带有标签的)抗体或抗体片段，并且可以是重组体、嵌合抗体、人源化抗体和鼠源性抗体。优选已标记的(带有标签的)单克隆抗体。可以根据常规方法进行抗体标记或加标签，也可使用商品化的市售HBV抗体。比如：以酶比如HRP(辣根过氧化物酶)作为标记物(标签)时，酶与抗体的结合方法有许多种，例如可以用戊二醛二步法和过碘酸钠法。可列举的已标记的(带有标签的)HBV的抗体商品例如有Prosci公司的共轭有生物素的山羊抗乙肝表面抗原多克隆抗体；Creative Diagnostics公司的共轭有FITC的兔抗乙肝表面抗原多克隆抗体(Cat.No.DPATB-H81654)；
Thermo Scientific Pierce公司的共轭有HRP的小鼠抗乙肝核心抗原单克隆抗体Clone 
4H5。

[0074] HBV蛋白第二抗体上的标记物能够催化或者激活化学发光化合物或者荧光染料，从而快速地将无色的底物转变成有色的产物、或者引起光变化、或者将非荧光的荧光染料转变成强烈的荧光产物。上述CHI3L1第二抗体中包含的标记物同样可以用作HBV蛋白第二抗体上的标记物。

[0075] 类似地，上述CHI3L1第二抗体中包含的标记物的反应对象同样可以用作HBV蛋白第二抗体上的标记物的反应对象。

[0076] 类似地，用于诱导CHI3L1第二抗体上的标记物与化学发光化合物或显色底物或者荧光染料之间的化学反应或者酶催化反应的引发剂溶液同样可以用于诱导HBV蛋白第二抗体上的标记物与化学发光化合物或显色底物或者荧光染料之间的化学反应或者酶催化反应。因此，在本发明的实施方式中，优选上述试剂盒进一步包含：

[0077] (6’)引发剂溶液，分别用于引发CHI3L1第二抗体和HBV蛋白第二抗体上的标记物与分别作为标记物反应对象的化学发光化合物或显色底物或者荧光染料之间的化学反应。例如，当标记物是过氧化物酶时，引发剂溶液包含过氧化物化合物。该过氧化物成分是任何能够与过氧化物酶反应的过氧化物或者烷基氢过氧化物。优选的过氧化物包括过氧化氢(双氧水)、过氧化脲和过硼酸盐。

[0078] 在本发明的实施方式中，HBV蛋白标准样由含有已知量HBV蛋白的溶液组成，该标准样是人工配制的HBV蛋白溶液。理论上讲，标准样可以来源于任何包含或者产生HBV蛋白的生物体，比如来源于基因工程菌表达、或动物的体液。然而，不同来源的HBV蛋白作为抗原时，其表位特异性可能会有所不同，从而与同一抗体的结合也可能会有差异、进而影响到免疫检测。为使HBV蛋白作为抗原具有较高的表位特异性，优选HBV蛋白标准样来源于对应于动物的体液，例如HBV蛋白来源于对应于受检测生物样本类型的动物体液比如全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、精液、或眼泪，其中更优选来源于血清。研究发现，当HBV蛋白标准样取自乙肝病毒感染引起的肝纤维化和/或肝硬化患者的血清时，该标准样具有广谱适用性，检测得到的结果尤其准确，即便受检测生物样本类型不是血清、而是全血、血浆、尿液、脑脊液、唾液、精液、或眼泪。因此优选HBV蛋白来源于由乙肝病毒感染引起的肝纤维化和/或肝硬化患者、优选由乙肝病毒感染引起的肝硬化患者、尤其是中国人群患者的体液比如血清。当然，也可以来源于基因工程菌表达、或动物的体液，前提是其HBV蛋白的表位特异性与乙肝病毒感染引起的肝纤维化和/或肝硬化患者的血清HBV蛋白的表位特异性大致等同。用作标准样和对照样的材料可以采用多种形式，合适的材料可以是呈水溶液状态。典型地，适合于本发明的免疫测定的标准样可以包含已知CHI3L1含量的溶液以及包含已知HBV蛋白含量的溶液，它们可以进行梯度稀释。在不导致CHI3L1和HBV蛋白的含量检测因交叉反应而产生误差的情况下，本发明的免疫测定的标准样可以同时包含已知CHI3L1含量以及已知HBV蛋白含量的溶液。

[0079] 在本发明的实施方式中，优选CHI3L1第一抗体和HBV第一抗体、或者分别用于固定CHI3L1第一抗体和HBV第一抗体的固相载体上分别连接有化学发光化合物或荧光染料。借此，当分别通过双抗体夹心法测试时，与传统的在检测步骤之前必须漂洗除去第二抗体的免疫测定方法相比，因为省去了分离(第二抗体)和洗涤步骤而使测定方法简单化，定量更准确。

[0080] 类似地，本发明的第二种试剂盒还可包括下述物品中的至少之一：(5)携带工具，其空间划分为可以收容一种或多种容器、96孔板或板条的限定空间，该容器例如是药瓶、试管、和类似物，每样容器都含有一个单独的用于本发明方法的组分；(6)辅助试剂，比如，显色剂、酶抑制剂、缓冲液、稳定剂、稀释剂、洗涤试剂以及类似物；(7)说明书，其可以写在瓶子、试管和类似物上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部，也可以是多媒体的形式，比如CD、电脑光盘、录像等等。

[0081] ELISA

[0082] 本发明的试剂盒优选用于ELISA(酶联免疫吸附测定)，对个体的样本进行检测。

[0083] 酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是分子生物学领域常用的蛋白质含量分析方法，其可用于测定抗原，也可用于测定抗体。根据试剂的来源、样本的性状以及检测的具备条件，本发明可以采用多种不同类型，比如：双抗体夹心法、双位点一步法、间接法测抗体、竞争法、捕获法测IgM抗体、以及应用亲和素和生物素的ELISA等。优选CHI3L1抗体和HBV抗体的抗体偶联物用检测仪器检测，比如，酶标仪进行吸光度测定。

[0084] 以双抗体夹心法ELISA为例，CHI3L1试剂盒检测标本中CHI3L1含量的检验原理是：用抗人CHI3L1抗体(第一抗体)包被微孔板，制成固相抗体；在包被抗体的微孔板中加入待检样本，若样本中含有被测物，便可结合于固相抗体上，从而形成抗原－抗体复合物；再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人CHI3L1抗体(第二抗体)，形成抗体－抗原－HRP标记抗体复合物(也可以使用生物素标记的抗人CHI3L1抗体作为第二抗体，形成抗体－抗原－生物素标记抗体复合物；再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素，形成抗体-抗原-生物素标记抗体-酶标亲和素复合物)；最后加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-TMB)底物系统(包括双氧水)，发生显色反应。显色反应结束后用酶标仪比如在450nm进行检测。根据校准品中CHI3L1的浓度和其对应的OD值作标准曲线，通过标准曲线计算样本中CHI3L1浓度。

[0085] ROC曲线

[0086] ROC曲线全称为受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve)，又称为接收者操作特性曲线，主要用于临床生化诊断试验。ROC曲线是反映真阳性率(灵敏度，又称敏感性，sensitivity)和假阳性率(1-特异性，specificity)连续变量的综合指标，是用构图法揭示灵敏度和特异性的相互关系。它通过设定一系列不同的分界值(阈值或临界值，截断值(cut-off value)，是划分诊断试验结果正常与异常的界值)作为连续变量，从而计算出一系列灵敏度和特异性，再以灵敏度为纵坐标、1-特异性为横坐标绘制的曲线，曲线下面积(AUC)越大，诊断准确性越高。在ROC曲线上，最靠近坐标图左上方的点为灵敏度和特异性均较高的临界值。ROC曲线AUC值在1.0和0.5之间。在AUC＞0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。

[0087] ROC曲线的评价方法与传统的评价方法不同，根据实际情况，允许有中间状态，可以把试验结果分为多个有序分类，比如：正常、大致正常、可疑、大致异常和异常五个等级。

[0088] 上述有序分类，对于疾病的诊断而言，可分为：阴性、不确定、阳性。进一步地，对于肝硬化诊断而言，可分为：有肝硬化、健康。

[0089] 因此，以检测样本中蛋白CHI3L1为例，本发明检测肝硬化的方法，可以包括如下步骤：

[0090] (1)分别测定样本中蛋白CHI3L1的含量；

[0091] (2)以CHI3L1蛋白含量为变量，根据不同的阈值对肝硬化诊断的灵敏度和特异性绘制出ROC曲线，并计算曲线下面积AUC；以及

[0092] (3)按照期望的灵敏度和特异性，对测定样本进行分类(肝硬化或健康)。

[0093] ROC曲线的绘制可以使用现有技术领域的软件或系统，比如：MedCalc 9.2.0.1医学统计软件、SPSS 9.0、ROCPOWER.SAS、DESIGNROC.FOR、MULTIREADER_POWER.SAS、CREATE_ROC.SAS、GB STAT V10.0(Dynamic Microsystems,Inc.Silver Spring,MD,USA)等等。

[0094] 肝硬化的诊断、预后评估、治疗效果监测或病程监测

[0095] 本发明在医学领域的具体应用，主要体现在肝硬化的诊断、预后评估、治疗效果监测或病程监测方面，包括操作方法以及实现该方法的器具—试剂盒。众所周知，肝炎的病程与肝硬化转化密切相关，典型的病程为：肝炎(比如乙肝、丙肝)→肝硬化。本发明人的研究发现，肝炎病毒的表达也可以作为肝硬化检测的生物标志，其与CHI3L1的表达结合起来，进行联合检测可以显著提高由乙肝病毒感染引起的肝纤维化和/或肝硬化诊断的成功率。因此，本发明还提供了一种用于由HBV感染引起的肝纤维化和/或肝硬化的诊断、预后评估、治疗效果监测或病程监测的方法，其包括：检测个体血液样本中HBV的表达；检测个体血液样本中CHI3L1的表达；对测得的HBV表达水平和CHI3L1的表达水平进行数学分析；以及根据数学分析结果，对测定血液样本进行分类，做出肝硬化的判断结果。这种结果可分为：肝硬化前期、肝硬化中期、肝硬化晚期等。

[0096] 其中，HBV的表达可以采用本技术领域标准的方法进行，比如标准的血样检测试纸法、血样检测试剂盒法，以及常规的血样化验方法，等等。

[0097] 以下以个体的血清为样本进行肝硬化诊断为例，对本发明作进一步详细说明。

[0098] 实施例

[0099] 1.临床实验

[0100] 1.1样品来源：在浙江大学医学院附属第一医院、浙江大学医学院附属第二医院和浙江大学医学院附属邵逸夫医院收集的已诊断为由HBV感染引起的肝硬化的血清样本和正常对照的血清样本，标本为1年内-80℃以下保存的血清或者1个月内-20℃以下保存的血清。使用考核试剂进行CHI3L1的定量测定；以临床单位的肝硬化临床或病理诊断结果进行比较，利用ROC曲线确定合适的阳性参考值，评价该检测试剂盒的特异性、敏感性、总符合率及相关性分析。

[0101] 1.2样本选择依据、入选标准、排除标准和剔除标准

[0102] 入选标准：临床常规检测后的剩余血清样本或库存血清样本；样本的采集和处理符合标准实验室操作规程以及产品说明书的要求；样本的原始相关信息至少包括供样者的性别、样本采集日期、样本类型。

[0103] 排除标准：不符合样本采集和处理要求的样本；微生物污染的样本；严重溶血、混浊的样本(干扰样本组除外)；与临床情况不相符的样本。

[0104] 剔除标准：

[0105] 由于样本量不足导致无法得出结果的样本；

[0106] 检测过程中出现差错的样本。

[0107] 1.3样本采集、保存和分组

[0108] 1)根据样本的入选标准要求收集正常对照组、非肝硬化疾病对照组、肝硬化组的血清样品。

[0109] 2)样本为静脉采血后析出的血清，每份血清体积不小于200uL。

[0110] 3)血样采集后，应不加抗凝剂，并放置在干净、干燥的试管内静置1小时，离心(2000rpm×5min)取上层血清，待测。

[0111] 4)不适用于溶血，脂血或黄疸的样本的检测。

[0112] 5)尽量采用新鲜血清进行检测，新鲜采集的样本，如果暂时不用于检测，必须将样本保存在-80℃。样本冻融之后，应立即检测，不宜反复冻融。如必须冻融则将冻融次数控制在3次以内。检测前样本应与室温平衡。冷冻的样本需缓慢升至室温，解冻后的标本应混匀。

[0113] 6)若样本含有纤维蛋白、颗粒物或血红细胞，应对样本进行凝集和离心分离。

[0114] 血样按以下分组：

[0115] 正常对照组

[0116] 选择的血清样本来自健康个体者，这组人群无明确的肿瘤病史和其他常见慢性疾病史，相关肿瘤学血清学指标检测结果在正常范围内。该组也可称为表面健康人群组。

[0117] 非肝硬化疾病对照组即干扰样本组

[0118] 选择的血清样本来源于患有除肝硬化外的其他疾病的病人。这些非肝硬化疾病包括肝炎、肝癌等。这些血清样本在血清标志物检测方面容易与肝硬化混淆或可能会出现单次检测结果有阳性结果交叉表现。

[0119] 肝硬化组

[0120] 肝硬化的临床诊断方法包括相关的影像学诊断，病理学诊断或/和治疗和随访等。选择的血清样本来源于临床确诊的肝硬化病人等。

[0121] 1.4肝硬化的临床诊断

[0122] 采用现有技术的临床诊断方法(包括金标准)，完成受测人群肝硬化的检测。

[0123] 1.5CHI3L1检测试剂盒

[0124] 可使用杭州普望生物技术有限公司生产的多种试剂盒对生物样本比如血清进行CHI3L1水平检测，比如：

[0125] 1.5.1CHI3L1检测试剂盒(酶联免疫法)1，杭州普望生物技术有限公司生产。其主要包含：

[0126] CHI3L1第一抗体为LifeSpan Biosciences公司的CHI3L1/YKL-40小鼠抗人单克隆(aa22-383)抗体(LS-C125352-50)。抗体的原始浓度为1mg/ml，抗体的稀释度可为10-1000倍。用第一抗体包被96孔微孔板，制成固相抗体，即捕获抗体。

[0127] CHI3L1第二抗体为R&D systems公司的生物素化亲和纯化的抗人CHI3L1多克隆抗体PAb(BAF2599)，其为生物素标记的抗CHI3L1多克隆抗体，存放在加入蛋白质稳定剂的缓冲液中。抗体的原始浓度为1mg/ml，抗体的稀释度可为10-5000倍，每孔加入量可为100μl。

[0128] 用于与CHI3L1第二抗体共轭的标记物(即活化剂)为辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素。可按1：99稀释后使用；稀释后每孔加入量可为100μl；

[0129] CHI3L1标准品，通过常规的蛋白质分离纯化手段比如亲和色层法，从由浙江大学医学院附属第一医院提供的乙肝病毒感染引起的肝硬化患者的血清中分离出CHI3L1，溶于含有2M脲的20mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中，使用时可用相同的缓冲液进行稀释。标准品的稀释点可以分别为CHI3L1浓度1200pg/ml、600pg/ml、300pg/ml、150pg/ml、75pg/ml、0pg/ml。

[0130] 标记物的显色反应底物(显色剂B)，为含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺的缓冲液，每孔加入可为50μl。

[0131] 引发剂溶液(显色剂A)，含有双氧水的缓冲液。与显色剂B按1：1混合使用，每孔加入量可为50μl。

[0132] CHI3L1样本稀释液，含有蛋白质稳定剂的缓冲液，用于检测前对样本的稀释。

[0133] 1.5.2CHI3L1检测试剂盒(酶联免疫法)2，杭州普望生物技术有限公司生产。其主要包含：

[0134] CHI3L1第一抗体为LifeSpan Biosciences公司的CHI3L1/YKL-40小鼠抗人单克隆(aa22-383)(AT4A3)抗体(LS-B3057-50)。抗体的原始浓度为1mg/ml，抗体的稀释度可为10-1000倍。用第一抗体包被96孔微孔板，制成固相抗体，即捕获抗体。

[0135] CHI3L1第二抗体为GenWay Biotech公司的HRP共轭的羊抗人CHI3L1多克隆抗体(18-783-77701)，存放在加入蛋白质稳定剂的缓冲液中。抗体的原始浓度为1mg/ml，抗体的稀释度可为10-5000倍，每孔加入量可为100μl。

[0136] CHI3L1标准品，Abcam公司的活性人CHI3L1全长蛋白(ab182706)。标准品的稀释点分别为CHI3L1浓度1200pg/ml、600pg/ml、300pg/ml、150pg/ml、75pg/ml、0pg/ml。

[0137] 标记物HRP的显色反应底物(显色剂B)，为含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺的缓冲液，每孔加入量可为50μl。

[0138] 引发剂溶液(显色剂A)，含有双氧水的缓冲液。与显色剂B按1：1混合使用，每孔加入量量可为50μl。

[0139] CHI3L1样本稀释液，含有蛋白质稳定剂的缓冲液，用于检测前对样本的稀释。

[0140] 这些试剂盒中还可以包含ELISA常用的其他试剂，比如洗涤液、终止液等，这是本领域技术人员所熟知的。

[0141] 下文中列举了使用CHI3L1检测试剂盒(酶联免疫法)1检测血清中CHI3L1水平的实验结果。

[0142] 1.6临床试验评价指标

[0143] 1.6.1临床特异性

[0144] 用试剂盒检测为阴性的血样例数占临床诊断为“非肝硬化”的例数中的比例，考察试剂盒正确排除患者罹患肝硬化的能力。

[0145] 1.6.2临床敏感性

[0146] 通过试剂盒检测血样为阳性的例数占临床诊断为“肝硬化”的病例中的比例，考察试剂盒正确判断患者是否罹患肝硬化的能力。

[0147] 1.6.3总体符合率

[0148] 综合计算产品灵敏度和特异性的指标，反映试剂盒检测结果与患者罹患肝硬化的符合性。并用Kappa值进行一致性分析。

[0149] 1.7临床试验数据处理及统计分析方法

[0150] 1.7.1对于统计数据，采用平均数±标准偏(mean±sd)差等描述；对计数数据，采用例数和百分比来描述。

[0151] 1.7.2根据数据类型，分别选择成组设计对应的统计分析方法，如t检验/秩和检验/卡方检验/精确概率等方法。通过SAS软件统计试剂盒测定临床样本CHI3L1浓度值，考核CHI3L1与肝硬化的相关性和直线回归分析。

[0152] 1.7.3与现有技术的肝硬化临床或病理诊断标准比如“金标准”比较，通过计算试剂盒的检测敏感度、特异性、总符合率来评价试剂盒的临床分析性能：

[0153] 依据专业知识，对各样本测定结果进行分析，确定测定值的上下限、组距以及截断点(cut-off point)，按选择的组距间隔列出累积频数分布表，分别计算出所有截断点的灵敏度(真阳性率)、特异度和假阳性率(1-特异性)。以真阳性率为纵坐标，假阳性率为横坐标，绘制ROC曲线，计算ROC曲线下面积(AUC)和95％CI，以评价诊断的价值，并确定截断参考值。

[0154] 以上述确定的截断参考值为判断依据，对所有检测标本进行阴性、阳性判断，并将检测结果和临床(或病理)诊断结果配对资料整理如表1所示，计算敏感度、特异性、总符合率等指标，并用Kappa检验评价检测试剂盒的检测结果与临床(或病理)诊断的一致性。若Kappa值≥0.75，一致性较好；若0.75＞Kappa值≥0.40，一致性中等；若Kappa值＜0.40，一致性不理想。

[0155] 表1定性检测结果配对资料统计表

[0156]

[0157] 其中A为真阳性；B为假阳性；C为假阴性；D为真阴性。

[0158] (1)灵敏度，实际患病且被诊断为阳性的概率，也称为真阳性率，即为：

[0159] Sen(sensitivity)＝TPR＝A/(A+C)*100％

[0160] (2)特异度，实际未患病且被诊断为阴性的概率，即为：

[0161] Spe(specificity)＝D/(B+D)*100％

[0162] (3)总符合率(一致百分率)＝(A+D)/(A+B+C+D)*100％

[0163] (4)阳性预测值：指在阳性结果的病人中，肝硬化存在的可能性。计算公式为：

[0164] 阳性预测值＝真阳性结果数/阳性结果总数*100％

[0165] 其中：阳性结果总数＝(真阳性结果数+假阳性结果数)

[0166] (5)阴性预测值：指在阴性结果的病人中，非肝硬化存在的可能性。计算公式为：

[0167] 阴性预测值＝真阴性结果数/阴性结果总数*100％

[0168] 其中：阴性结果总数＝(真阴性结果数+假阴性结果数)

[0169] (6)误诊率：即假阳性率，计算公式为：

[0170] ɑ＝FPR＝1-Spe

[0171] (7)漏诊率：即假阴性率，计算公式为：

[0172] β＝1-Sen

[0173] (8)阳性似然比(LR+)：真阳性率与假阳性率之比，即为灵敏度与误诊率之比，计算公式为：LR+＝TPR/FPR

[0174] 其中，LR+的取值范围为(0，∞)，其值越大，检测方法证实疾病的能力越强。

[0175] (9)阴性似然比(LR-)：假阴性率与真阴性率之比，即漏诊率与特异度之比，计算公式为：LR-＝(1-TPR)/(1-FPR)

[0176] 其中，LR-的取值范围为(0，∞)，其值越小，检测方法排除疾病的能力越好。

[0177] 2临床研究结果及分析

[0178] 2.1样本基本信息

[0179] 本次临床试验由浙江大学医学院附属第一医院(简称中心01、或者浙一)、浙江大学医学院附属第二医院(简称中心02、或者浙二)、浙江大学医学院附属邵逸夫医院(简称中心03、或者邵逸夫)共同完成，共入选1151例，样本来源于临床检测剩余(即残留)标本或库存血清样本。各中心入选样本情况参见表2：

[0180] 表2各中心病例分布表

[0181]

[0182] 1151例试验对象年龄为18-88岁(42.8±13.7岁)，男性601例，女性550例。其中健康个体725例，男310例，女415例，年龄为19-88岁(37.5±11.2岁)；肝硬化314例，男223例，女91例，年龄为23-82岁(55.0±11.1岁)；乙肝112例，男68例，女44例，年龄为18-78岁(43.0±13.6岁)。样本来源的年龄特征详见表3，性别分布见表4。

[0183] 表3样本对象一般资料表

[0184]

[0185] 表4样本对象性别分布情况

[0186]

[0187] 2.2临床评价指标分析

[0188] 2.2.1血清CHI3L1水平与肝硬化的相关性分析

[0189] 对健康个体和肝硬化患者的血清样本进行CHI3L1的定量测定，具体测定结果详见下表。

[0190] 与健康个体对照组比较，CHI3L1含量在肝硬化组的表达明显升高(P<0.0001)，见表5。

[0191] 表5血清CHI3L1检测水平(ng/mL，平均值±标准偏差)

[0192]

[0193] 对CHI3L1与肝硬化的相关性进行Spearman秩相关分析，结果示相关系数r＝0.751，p<0.0001，说明CHI3L1与肝硬化之间呈正相关关系，肝硬化组的CHI3L1高于健康组。

[0194] 2.2.2ROC曲线

[0195] 对样本测定结果进行分析，建立CHI3L1用于肝硬化诊断的ROC曲线见图1。其余各中心的ROC曲线见图2至图4。采用计算Youden指数的方法确认最佳诊断临界值。Youden指数越大，试验的诊断价值越高，Youden指数最大为0.870，对应CHI3L1诊断界点值74ng/mL，即可作为诊断截断值，其诊断灵敏度和特异度分别为92.4％和94.6％，详细见表6。

[0196] 表6血清CHI3L1含量在肝硬化诊断中ROC曲线面积及敏感性、特异性

[0197]

[0198] 2.2.3敏感度、特异性、总符合率评价

[0199] ROC曲线采用计算Youden指数的方法确认最佳诊断临界值为79ng/mL，对本中心的所有检测标本进行阴性、阳性判断，并将检测结果和临床(或病理)诊断结果配对资料整理如表7所示。

[0200] 表7检测结果方表

[0201]

[0202] 根据上述资料统计表数据，计算灵敏度、特异度、总体符合率等指标，总结见表8：

[0203] 表8CHI3L1用于肝硬化诊断临床效能评价各指标

[0204]

[0205] 采用Kappa检验评价检测试剂盒的检测结果与临床(或病理)诊断的一致性。若Kappa值≥0.75，一致性较好；若0.75＞Kappa值≥0.40，一致性中等；若Kappa值＜0.40，一致性不理想。对健康个体人群肝硬化评判的Kappa值为0.8586，95％置信区间(0.950,0.991),P＜0.0001,可认为两种测定方法结果高度一致性。

[0206] 2.2.4干扰样本的评价分析

[0207] 在112例肝炎干扰样本中共51例(45.5％)的CHI3L1值未超过诊断界值79ng/mL。因此，肝炎病例可能对本试剂检测有干扰。

[0208] 3结果和讨论

[0209] 本次临床试验是采用杭州普望生物技术有限公司生产的CHI3L1试剂盒对肝硬化、乙肝、健康个体人群血清样本进行检测，与各临床单位的肝硬化临床或病理诊断结果进行比较，利用ROC曲线确定合适的阳性参考值,评价该检测试剂盒的特异性、敏感性、总符合率及相关性分析。

[0210] 试验由浙江大学医学院附属第一医院、浙江大学医学院附属第二医院、和浙江大学医学院附属邵逸夫医院(中心03)共同完成，共收集了1151例样本，其中肝硬化样本314例，健康个体样本725例，乙肝样本112例。样本来源年龄18-88岁，平均年龄42.8岁，男性601例，女性550例。

[0211] 比较健康个体和肝硬化患者的血清样本CHI3L1定量测定结果，健康个体对照组血清CHI3L1水平平均为47.4±23.7(5-395)ng/ml，而肝硬化组血清CHI3L1水平明显升高，平均为338.7±328.1(20-2520)ng/ml，两者比较差异具有显著性意义(P<0.0001)。进一步对CHI3L1与肝硬化的相关性进行Spearman秩相关分析，结果示相关系数r＝0.751，p<0.0001，说明CHI3L1与肝硬化之间呈正相关关系，肝硬化组CHI3L1高于健康组。

[0212] 对健康个体和肝硬化患者的血清样本CHI3L1定量测定结果进行分析，建立CHI3L1用于肝硬化诊断的ROC曲线。ROC曲线下面积为0.972，95％可信区间为(0.0.960-0.981)。根据Youden指数越大，试验的诊断价值越高，Youden指数最大为0.850，对应CHI3L1诊断界点值79ng/ml，即可作为诊断截断值，此时诊断灵敏度和特异度分别为92.4％和94.6％。选定CHI3L1用于诊断肝硬化的诊断界值为79ng/ml，对1151例入选的样本(含肝炎样本)考察考核试剂的诊断灵敏度和特异度分别为92.4％和89.3％，总符合率为90.1％。进一步采用Kappa检验评价检测试剂盒的检测结果与临床(或病理)诊断的一致性，结果示本试验Kappa值为0.766，P＜0.0001，可认为两种诊断方法结果具有一致性。

[0213] 综上所述，采用杭州普望生物技术有限公司生产的CHI3L1试剂盒用于检测肝硬化、乙肝、健康个体者血清CHI3L1水平来诊断肝硬化的灵敏度和特异度分别为92.4％和89.3％，总符合率为90.1％，诊断界值为79ng/ml，说明考核试剂盒的测定可以作为诊断肝硬化的辅助手段。