用于改善硫酸软骨素的生物利用度的含有硫酸软骨素、蛋白水解酶和巯基化合物的组合物

摘要

本发明描述了组合，其包含硫酸软骨素(CS)、一种或多种具有蛋白水解活性的酶或酶混合物以及巯基化合物，其用于治疗和预防骨关节炎及相关急性和慢性炎症过程，或作为用于维持人类和动物肌肉骨骼的健康的营养组合物。所述组合的特征在于当口服施用时其提高CS的肠道吸收。所述组合的效果适用于广范围分子量的CS，包括已经具有比较高分子量样品高的生物利用度的极低分子量的CS样品。该效果还适用于任何来源的CS样品。

权利要求

1.包含硫酸软骨素和纳豆激酶的口服组合物，所述硫酸软骨素/蛋白酶比按重量计为

1.0/0.05-0.8，其中不存在巯基化合物。

2.根据权利要求1所述的口服组合物，其中硫酸软骨素具有1-95kDa的分子量。

3.根据权利要求1-2任一项所述的口服组合物，其中硫酸软骨素通过从动物来源提取获得。

4.根据权利要求1-2任一项所述的口服组合物，其中硫酸软骨素如下获得：水解移除大肠杆菌荚膜多糖K4的果糖残基后，进行化学硫酸化。

5.根据权利要求1-2任一项所述的口服组合物，其中硫酸软骨素如下获得：水解大肠杆菌的荚膜多糖K4移除果糖残基后，进行化学硫酸化并随后进行酸或自由基解聚。

6.根据权利要求1-2任一项所述的口服组合物，其中硫酸软骨素通过化学硫酸化基因修饰的大肠杆菌菌株的荚膜多糖而获得，其中所述多糖最初即不存在果糖残基。

7.根据权利要求1-2任一项所述的口服组合物，其中硫酸软骨素通过化学硫酸化以及随后酸或自由基解聚基因修饰的大肠杆菌菌株的荚膜多糖而获得，其中所述多糖最初即不存在果糖残基。

8.根据权利要求1-7任一项所述的口服组合物，其还含有一种或多种用于预防或治疗急性或慢性炎症的活性成分和/或一种或多种用于维持人和动物肌肉骨骼健康的营养物质。

9.根据权利要求8的口服组合物，其中所述一种或多种活性成分选自盐酸葡糖胺、硫酸葡糖胺、N-乙酰-葡糖胺、透明质酸、氨基酸、胶原、水解的胶原、多不饱和脂肪酸、角蛋白、甲基磺酰甲烷、叶酸、还原态叶酸、维生素、B族维生素、S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)、抗坏血酸和抗坏血酸锰。

10.根据权利要求1-9任一项所述的口服组合物，其还含有一种或多种选自微晶纤维素、硬脂酸、硬脂酸镁、胶体二氧化硅、乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、含水虫胶盐、藻酸钠、淀粉、改性淀粉、甲基丙烯酸共聚物、麦芽糊精、多元醇的药学上或营养学上可接受的赋形剂。

11.根据权利要求1-10任一项所述的口服组合物，其用于预防或治疗急性和慢性炎症。

12.根据前述任一项权利要求的口服组合物，其为固体口服制剂，包括胶囊、软胶囊、片剂、颗粒剂或重构的粉末饮料。

13.根据前述任一项权利要求的口服组合物，其为液体饮料。

说明书

用于改善硫酸软骨素的生物利用度的含有硫酸软骨素、蛋白

水解酶和巯基化合物的组合物

[0001] 发明概述

[0002] 本发明涉及组合物，其包含硫酸软骨素(CS)、具有蛋白水解活性的酶或酶混合物，不存在或者存有巯基化合物，及其在治疗和预防骨关节炎和相关急性和慢性炎症过程中的用途，或作为用于维持人类和动物肌肉骨骼的健康的营养组合物的用途。

[0003] 所述组合当口服施用时提高CS的肠道吸收。所述组合的效果适用于广范围分子量的CS，包括由特征在于极低分子量(1-10kDa)的寡糖组成的样品，已知其生物利用度高于具有较高分子量样品的生物利用度。

背景技术

[0004] 在广泛临床证据的基础上，CS由EULAR(欧洲抗风湿病联盟(European League against Rheumatism))推荐作为骨关节炎的对症慢作用药物(SYSADOA)，用于治疗膝、髋和手的骨关节炎。CS还用作用于实现局部和全身水平抗炎活性的组合物中的营养物(单独或与其他成分组合)。

[0005] 硫酸软骨素(CS)是属于糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)类的多糖，存在于脊椎动物和无脊椎动物中，由二糖序列组成，所述二糖序列由葡糖醛酸(GlcA)残基及交替的N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)通过β-1-3键连接并且在不同位置的硫酸化而形成。所述二糖又由β1-4键连接在一起。CS主要由在GalNAc的第4位和第6位单硫酸化的二糖单元(分别称为二糖A和C)组成。取决于多糖来源，CS A和C以不同百分比存在。

[0006] 未被硫酸化的二糖和拥有两个与不同位置的氧原子连接的硫酸酯基团的二硫酸化二糖还以更少的、可变的程度存在于CS中，这取决于具体的动物来源：在GlcA的2位及GalNAc的6位(二糖D)、在GlcA的2位及GalNAc的4位、或在GalNAc的4和6位(二糖E)(Volpi N.J.Pharm.Pharmacol.61,1271,2009.Volpi N.J.Pharm.Sci.96,3168,2007.Volpi N.Curr.Pharm.Des.12,639,2006)。

[0007] 不同动物来源的CS特征还在于不同的分子量。

[0008] 例如，来源于陆地动物的CS具有彼此间类似的分子量值，但与来源于鱼类的那些不同，来源于鱼类的那些具有更高的分子量值。陆地来源的CS具有14至26kDa的平均分子量，而海洋来源(来自乌贼、软骨鱼和硬骨鱼)的CS具有超过50kDa的平均分子量。

[0009] 除了动物来源的CS外，还描述了这样的一些CS产品，其基于细菌来源的多糖骨架，随后通过合成修饰，从而获得与天然CS类似的聚合物。这些细菌合成来源的生物技术CS克服了与动物来源的提取CS相关的一些缺点，诸如残余杂质中可能存在病毒和/或朊病毒或其他可能引起过敏的大分子；终产物中的高动物蛋白含量；动物产品与宗教或饮食限制的不相容；以及对于满足增长的全球需求的可得到的有限来源。

[0010] 细菌合成来源的CS的实例例如描述于EP 1304338中，其中大肠杆菌O5:K4:H4株的荚膜多糖在原始聚合物提取和水解后被化学硫酸化。其他细菌合成CS的实例公开于WO 2012/152872、WO 2012/159655和WO 2013/174847中，其中化学硫酸化细菌荚膜多糖，得到与动物来源类似的CS。

[0011] 最后，通过对提取的多糖(Cho SY等人.Biol.Pharm.Bull.27,47,2004,Das A.等人.Osteoart.Cartil.8,343,2000)及细菌来源的多糖(WO 2013/174847、WO 2012/152872)进行解聚，得到低分子量CS的一些实例。这些类型CS的小的分子尺寸导致更好的口服吸收，同时维持了天然CS的许多已知活性。

[0012] 口服施用时，CS通过小肠和远端消化道的肠粘膜吸收。CS在小肠中部分地作为高分子量多糖被吸收，而大部分在盲肠和结肠中作为寡糖的形式被吸收(Lauder R.；Compl.Ther.Med.17,56-62,2009)。这些寡糖通过消化系统的下消化道中的肠道菌群产生的水解酶对原始多糖的部分解聚而产生。

[0013] 尽管对于与构成CS的多糖的肠道吸收相关的机制尚不完全清楚，但相信通过肠上皮细胞旁路空间的吸收在量上是显著的，如同对于大多数大分子那样；CS的寡糖片段也通过这一途径吸收。在这一水平存在紧密连接，其形成限制大分子吸收的屏障，所述大分子的转运不涉及通过特定分子载体穿越肠道粘膜的介导。

[0014] 高分子量CS的吸收预计约为1-5％。如此前所述，吸收的大部分CS由寡糖组成，所述寡糖来源于肠道微生物菌落产生的软骨素酶对其的酶消化作用。然而，考虑寡糖的吸收，由肠粘膜摄取的总CS占摄入的多糖的不超过20-23％(Lauder R.；Compl.Ther.Med.17,56-62,2009-Barthe L.等人.Arzneimittelforsch./Drug Res.2004；54:286-92)。

[0015] 一般而言，口服施用后的CS吸收仍然是个问题，能够提高所述糖胺聚糖肠道吸收的任何方法是受到高度关注的。

[0016] 菠萝蛋白酶(Bromelain)是提取自菠萝(Ananas comosus)水果和茎的半胱氨酸蛋白酶混合物，菠萝是一种属于凤梨科(Bromeliaceae)的植物。其提取物的主要来源是所述水果的茎，在这里它的浓度是最高的。可将这一混合物区分为四种不同级分(fractions)，或根据通过质谱进行的更精细的分析表征，区分为8种蛋白水解组分，其均具有相当的蛋白水解活性。因此通常使用其天然形式的混合物。菠萝蛋白酶分类为属于C1A肽酶(MEROPS命名法)亚类的内切酶。除了蛋白酶混合物外，该提取物还含有过氧化物酶、酸性磷酸酶和糖苷酶。所述成分的分子量为8至28.5kDa。菠萝蛋白酶浓度通常以蛋白水解单位(GDU单位或国际单位，IU)表示，而不是以重量单位表示。

[0017] 就其蛋白水解特征，菠萝蛋白酶具有与胰蛋白酶类似的活性，并且因此促进消化。其与胰腺提取物组合用于消化不良。菠萝蛋白酶还分割长链脂肪。

[0018] 菠萝蛋白酶还拥有其他的药理学活性，最重要的是有效的抗炎活性，这使得其能有效治疗软组织中与创伤或手术后反应以及局部炎症相关的炎症状态。还证实菠萝蛋白酶通过升高抗炎前列腺素(诸如E2前列腺素)的生物合成以及相反地通过抑制促-炎症前列腺素的生物合成而发挥这一活性。

[0019] 菠萝蛋白酶的其他药理活性包括抗血栓和促溶纤维蛋白(pro-fibrinolytic)作用、低血压活性以及诱导动脉粥样硬化斑块消退的作用。其在抗菌和抗肿瘤治疗中的协同能力也得以描述。

[0020] 菠萝蛋白酶的特征在于良好的口服生物利用度，估计约40％，这对于蛋白来说是非常罕见的特性。此外，多数未吸收的菠萝蛋白酶保持完整，并且能够在肠道中发挥其酶活性，因为其不会受到胃液或唾液中的胱蛋白的强烈攻击。鉴于其特性，其类似于木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶(分别来自木瓜(Carica papaya)和无花果(Ficus carica)的类似提取物)。

[0021] 纳豆激酶是最初分离自纳豆(natto)的酶，纳豆是基于用特定种类的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)即纳豆芽胞杆菌(B.subtilis natto)发酵的煮大豆(soybeans)的日本传统食物。

[0022] 纳豆激酶是约32kDa的丝氨酸蛋白酶，其具有很强的纤维蛋白溶解活性。其与枯草杆菌蛋白酶的同源性超过72％。其纤维蛋白溶解活性包括对纤维蛋白溶解的直接作用，以及诱导尿激酶和纤溶酶产量增加的能力。纳豆激酶的特征在于相对高的对温度和低pH值的稳定性；这一特征赋予该蛋白对胃环境的良好耐受性，使得其可通过口服施用。

[0023] 其在胃环境中相对稳定的特征及其蛋白水解活性使得其成为可类似于菠萝蛋白酶存在于本文阐明的应用中。

[0024] US 5679344公开了用于关节疾病的营养组合物，其含有葡糖胺和具有抗炎性质的蛋白水解酶。该组合物含有至少一种蛋白酶和至少一种酸稳定的蛋白酶。

[0025] US 5888514公开了含有软骨、蛋白水解酶、硫酸葡糖胺和硫酸软骨素以及维生素和植物提取物的组合物，用于治疗骨和关节的炎症。

[0026] 发明详述

[0027] 已发现CS与菠萝蛋白酶的组合，以及同时存在菠萝蛋白酶活性增强剂诸如半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽或其他巯基化合物时，提高了其在小肠中的吸收。

[0028] 还发现纳豆激酶对于CS的生物利用度具有甚至更出人意料的效果，其提高了超过250％。

[0029] 本发明的一个目标是包含硫酸软骨素和一种或多种蛋白酶以及任选的巯基化合物的组合物，条件是当所述蛋白酶不是纳豆激酶时，则存在所述巯基化合物。

[0030] “巯基化合物”在本文中是指包含至少一个巯基的天然或合成氨基酸、或小肽或其它化合物。巯基化合物优选选自甲硫氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、乙酰半胱氨酸、还原或氧化的谷胱甘肽和S-乙酰基-谷胱甘肽。

[0031] 在本发明的组合物中，硫酸软骨素/蛋白酶/巯基化合物比为1.0/0.05-0.8/0.001-0.05。

[0032] 硫酸软骨素优选具有1至95kDa的分子量，更优选4至50kDa的分子量。

[0033] 硫酸软骨素优选为提取的动物来源的。CS可如下获得：对来自大肠杆菌的荚膜多糖K4进行水解移除果糖残基后，进行化学硫酸化，如在EP 1304338、WO 2012/152872、WO 2012/159655中描述的那样；或对来自大肠杆菌的荚膜多糖K4进行水解移除果糖残基后，进行化学硫酸化并随后进行酸或自由基解聚，如在WO 2013/174847和WO 2012/152872中描述的那样。备选地，CS可通过化学硫酸化来自基因修饰的大肠杆菌株(例如DSM23644)的荚膜多糖而获得，其中所述多糖最初即不存在果糖残基(WO 2012/159655)。如此获得的CS的分子大小也可随后通过酸或自由基解聚而减小，如在WO 2013/174847中那样。

[0034] 蛋白酶优选选自菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和纳豆激酶。纳豆激酶是优选的。本发明优选实施方案因此提供了包含硫酸软骨素和纳豆激酶的组合物，其不存在巯基化合物。本发明还涉及纳豆激酶在改善硫酸软骨素肠渗透性中的用途。

[0035] 本发明的组合物还可含有一种或多种用于预防或治疗急性和慢性炎症状态的活性成分和/或一种或多种用于维持人和动物肌肉骨骼健康的营养物质。

[0036] 所述活性成分可以例如选自盐酸葡糖胺、硫酸葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、透明质酸、氨基酸、胶原、水解的胶原、多不饱和脂肪酸、角蛋白、甲基磺酰甲烷、叶酸(folate)、还原态叶酸(folates)、维生素、B族维生素、S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)、抗坏血酸和抗坏血酸锰。

[0037] 该组合物还可含有一种或多种药学上或营养学上可以接受的赋形剂。

[0038] 通常与硫酸软骨素联合的所有成分，诸如葡糖胺和甲基磺酰甲烷(MSM)，均可加入到所述制备物中。

[0039] 药学上或营养学上可以接受的赋形剂例如是微晶纤维素、硬脂酸、硬脂酸镁、胶体二氧化硅、乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、含水虫胶盐(aqueous shellac salts)、藻酸钠、淀粉、改性淀粉、甲基丙烯酸共聚物、麦芽糊精和多元醇。

[0040] 本发明的组合物优选口服施用，例如以胶囊、软胶囊、片剂、颗粒剂、液体形式的饮料或待重构的粉末饮料形式施用。营养领域中CS的日剂量可以为400mg至3600mg，并且作为药物的通常日剂量为1200mg。

[0041] 附图简述

[0042] 附图显示了20kDa的牛硫酸软骨素(菱形)、9kDa的LMW硫酸软骨素(正方形)以及40kDa的HMW硫酸软骨素(三角形)通过大鼠肠粘膜的渗透性。

[0043] 实验部分

[0044] 在体外模型中测试了CS的渗透性，其中安乐死之后立即从动物中切离大鼠肠粘膜，并且置于浸泡在合适缓冲液中的Ussing室中，位于两个隔室的界面处，使粘膜本来暴露于肠腔的一面朝向一个隔室，称为供应隔室，并且底部朝向另一个隔室，称为接受隔室。

[0045] 存在或不存在所述组合的其他成分情况下，将CS置于供应隔室中，并且在一段温育期后测定接受隔室中多糖的存在，在所述温育期间，CS通过由大鼠肠粘膜组成的膜渗透至接受隔室中。

[0046] 现在将更详细地描述用于评估在其各种组合中的CS的肠渗透性的实验技术。通过吸入CO2安乐死重为150-170g的Lewis大鼠，并且立即切除小肠，洗涤，并安装在充满介质的Ussing室中，所述介质由125mM氯化钠(NaCl)、1.3mM硫酸镁(MgSO4)、5mM氯化钾(KCl)、20mM葡萄糖和25mM碳酸钠(NaHCO3)组成。用HEPES调节溶液pH至7.4。在37℃的温度下，在由95％O2和5％CO2组成的气氛中进行渗透性研究。在切离肠粘膜后不超过15分钟进行渗透性测试。

[0047] 测试中使用的CS样品就其性质和分子大小而言不同。牛来源和生物技术(细菌合成)来源的CS样品以不同的组合用于肠渗透性测试。使用的CS样本特征还在于不同的分子量，范围为1至95kDa，或优选4至50kDa。

[0048] 硫酸软骨素以3％(质量/体积)的浓度添加至供应隔室中。对于菠萝蛋白酶存在下的渗透性研究，以1.5％的浓度添加菠萝蛋白酶至CS溶液中。备选地，选自甲硫氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、乙酰半胱氨酸、S-乙酰基-谷胱甘肽和还原或氧化的谷胱甘肽的巯基化合物以0.075％的浓度与菠萝蛋白酶一起添加。对于纳豆激酶存在下的渗透性研究，以1.5％的浓度将酶添加至溶液中，如菠萝蛋白酶一样。

[0049] 总温育时间为3小时，期间每30分钟从接受隔室中取100μl样品，并用新鲜介质补充移除的体积。应用以下描述的方法，在用软骨素酶ABC(比活性：0.5U/ml)消化多糖后，通过HPLC分析所取样品中构成CS的二糖的存在。

[0050] 所用的HPLC方法涉及使用强阴离子交换柱(SAX)，基于pH 4的酸化水的洗脱液，以及在最先仅用酸化水等度洗脱5分钟后，25分钟内从0％至100％的1.2M NaCl线性梯度。使用的流速为1.0ml/min，以及二糖的检测用UV检测仪在232nm处进行。

[0051] 应用标准硫酸软骨素的8-点校准曲线计算接受隔室中CS的量，所述校准曲线相应于初始CS浓度C的0.78％至100％的范围。硫酸软骨素的标准品用软骨素酶ABC预温育，稀释于与实验所用相同的介质中。基于在接受隔室中发现的CS，表观渗透系数(Papp)通过公式Papp(cm/sec)＝Q/A·C·t计算，其中Q是渗透的CS的总量(μg)，A是Ussing室的扩散面积2 3
(cm)，C是供应隔室中CS的初始浓缩(μg/cm)，并且t是温育时间(30-180min)。增长比R基于Papp计算为(Papp CS+蛋白酶)/(Papp CS单独)。在取得每一样品时，即在30、60、90、120、150和
180min时，计算Papp。然后计算在这些点获得的不同Papp值的平局值，以得到每一样品在整个实验中的平均渗透系数。CS渗透数据表达为分别测量的二糖Δdi-0S、Δdi-6S和Δdi-4S的浓度峰值的平均值。

[0052] 数据的统计值由Student’s“t”检验来分析，其中p<0.05为最小显著性。

[0053] 这一实验模型的有效性得到了这样一个事实的确认，即三种不同分子量(即9、20和40kDa)的CS样品表现出针对肠膜的渗透性，其为分子量的函数，如体内发生的那样。这得到了下述曲线的证实，所述曲线显示了在180分钟实验期间内所考虑的所有时间间隔的CS累积转运(附图)。

[0054] 然后将具有低(9kDa)或高(40kDa)分子量的非动物来源的CS样品在下述情况下用于渗透性测试：存在或不存在蛋白酶，以及在菠萝蛋白酶的情况下，添加或不添加增强剂化合物。

[0055] 在不存在其他佐剂或在存在菠萝蛋白酶、菠萝蛋白酶和甲硫氨酸、或纳豆激酶的情况下得到CS样品的随时间的渗透性结果。

[0056] 尽管菠萝蛋白酶促进许多大分子细胞旁渗透的能力是已知的，这一能力与其弱化紧密连接的能力是相关的(Grabovac等人,Int.J.Pharm.326,153-159,2006)，但在这一测试中，单独使用菠萝蛋白酶而没有其他因子的介入，没有提高低分子量CS的吸收。这可从表1中所示平均Papp值之间的比较而看到。然而，对于低分子量CS、菠萝蛋白酶和甲硫氨酸组合，观察到可观的升高。在低分子量CS和纳豆激酶组合的情况下，也观察到肠粘膜渗透率的出人意料的升高(表1)。对于CS/菠萝蛋白酶/甲硫氨酸组合，增长比R具有超过1的值；并且对于CS/纳豆激酶的组合，其明显高于1，而CS/菠萝蛋白酶的R小于1(表2)。因此，甲硫氨酸对于作为CS肠渗透率增强剂的菠萝蛋白酶的作用而言，显示出出人意料的有利效果，而甚至更出人意料地，纳豆激酶在没有其他因子介入的情况下，几乎使低分子量CS的肠渗透性加倍。有趣的是，注意到小分子量CS的生物利用度已比相应的大的多糖更好，但其生物利用度能被所述的组合进一步提高。

[0057] 表1

[0058]  Papp(cm sec-1)x 10-7
LMW硫酸软骨素 2.13±0.61
LMW硫酸软骨素+菠萝蛋白酶+甲硫氨酸 2.65±1.36
LMW硫酸软骨素+菠萝蛋白酶 1.41±0.76
LMW硫酸软骨素+纳豆激酶 3.56±0.04

[0059] 就单独的或者与菠萝蛋白酶组合、与菠萝蛋白酶+甲硫氨酸组合、或与纳豆激酶组合的低分子量(LMW)硫酸软骨素的渗透，测试了平均Papp值。

[0060] 表2

[0061]

[0062] 所述组合对单独的低分子量(LMW)硫酸软骨素的增长比

[0063] 还观察到也是非动物来源的高分子量CS(40kDa)吸收的可比的效果(表3和4)。在这一情形下，组合的增强效果甚至更显著，几乎为单独CS吸收的三倍，表明该增强效果也发生在大尺寸的多糖的情况中，对于大尺寸的多糖，吸收更为关键。

[0064] 表3

[0065]  Papp(cm sec-1)x 10-7
HMW硫酸软骨素 0.53±0.25
HMW硫酸软骨素+菠萝蛋白酶+甲硫氨酸 1.27±0.80
HMW硫酸软骨素+纳豆激酶 1.57±1.10

[0066] 就单独的或者与菠萝蛋白酶组合、与菠萝蛋白酶+甲硫氨酸组合、或与纳豆激酶组合的高分子量(HMW)硫酸软骨素的渗透，测试了平均Papp值。

[0067] 表4

[0068]  增长比(R)
HMW硫酸软骨素+菠萝蛋白酶+甲硫氨酸/HMW硫酸软骨素 2.42±0.36
HMW硫酸软骨素+纳豆激酶/HMW硫酸软骨素 2.86±1.64

[0069] 所述组合对单独的高分子量(HMW)硫酸软骨素的增长比

[0070] 还对动物来源的CS样品(分子量：15-20kDa)在不存在或存在菠萝蛋白酶和甲硫氨酸混合物的情况下进行了渗透性测试，证实了所述组合的提高任意来源的CS的渗透性的能力(表5)。

[0071] 表5

[0072]  Papp(cm sec-1)x 10-7
参照硫酸软骨素 1.34±1.24
参照硫酸软骨素+菠萝蛋白酶+甲硫氨酸 1.45±0.45

[0073] 就单独的或与菠萝蛋白酶+甲硫氨酸组合的牛硫酸软骨素的渗透，测试了平均Papp值。

[0074] 以下是本发明组合物的实例

[0075] 实施例1

[0076] 通过混合以下物质制备组合物：

[0077] 1200mg牛硫酸软骨素、

[0078] 600mg菠萝蛋白酶、

[0079] 30mg L-甲硫氨酸。

[0080] 实施例2

[0081] 通过混合以下物质制备组合物：

[0082] 1200mg牛硫酸软骨素、

[0083] 600mg纳豆激酶。

[0084] 实施例3

[0085] 通过混合以下物质制备组合物：

[0086] 1200mg具有9kDa分子量的生物技术硫酸软骨素、

[0087] 600mg菠萝蛋白酶、

[0088] 30mg L-甲硫氨酸。

[0089] 实施例4

[0090] 通过混合以下物质制备组合物：

[0091] 1200mg具有9kDa分子量的生物技术硫酸软骨素、

[0092] 600mg纳豆激酶。

[0093] 实施例5

[0094] 通过混合以下物质制备组合物：

[0095] 1200mg具有40kDa分子量的生物技术硫酸软骨素、

[0096] 600mg菠萝蛋白酶、

[0097] 30mg L-甲硫氨酸。

[0098] 实施例6

[0099] 通过混合以下物质制备组合物：

[0100] 1200mg具有40kDa分子量的生物技术硫酸软骨素、

[0101] 600mg纳豆激酶。

[0102] 实施例7

[0103] 通过混合以下物质制备组合物：

[0104] 1200mg具有9kDa分子量的生物技术硫酸软骨素、

[0105] 600mg纳豆激酶、

[0106] 30mg L-甲硫氨酸。

[0107] 实施例8

[0108] 通过混合以下物质制备组合物：

[0109] 1200mg具有40kDa分子量的生物技术硫酸软骨素、

[0110] 600mg纳豆激酶、

[0111] 30mg L-甲硫氨酸。

[0112] 实施例9

[0113] 通过混合以下物质制备组合物：

[0114] 1200mg牛硫酸软骨素、

[0115] 600mg纳豆激酶、

[0116] 30mg L-甲硫氨酸。